Name: evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Лаборатория Е поддерживается финансирования научных исследований из Американского общества рака институциональных исследований Грант (IRG-97-219-14) присуждается Центра Hollings рака в MUSC, исследовательской финансирования из Министерства обороны гранта (W81XWH-11-2- 0229) в MUSC, и награду от концерна Foundation (в ESY).

Протокол следует руководящие принципы и стандарты по уходу за животными Медицинского университета Южной Каролины (MUSC) и ее институциональных уходу и использованию животных комитета (IACUC). 1. Вскрытие легких <ol><li> Молочная рассечение опухоли (дополнительно, в зависимости от целей и?...

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

Этот протокол описывает использование QRT-PCR для оценки молочной метастазы опухолевых клеток в легких, используя модель ксенотрансплантата мыши. Он признал, что другие методы, в том числе биолюминесценции визуализации, имеются в наличии и также эффективен для обнаружения метастазов, не...

Анализ QRT-ПЦР предложен в качестве метода оценки метастазов опухоли. Этот метод предлагается в качестве альтернативы для пользователей, которые заинтересованы в оценке метастазирования, но не могут иметь доступ к конкретному оборудованию, например, в естественных условиях съемочной аппаратуры или флуоресценции, способного стереоскоп. Обсуждение часто используемых методов представлена ​​последующим демонстрации для того, как анализ QRT-ПЦР может быть использован либо в качестве отдельного или в качестве метода оценки сопутствующей метастаз. Эта процедура имеет потенциал, чтобы обеспечить количественный анализ метастатического нагрузки. Стандартные методы анализа валового, в том числе визуализации легких при помощи стереомикроскопа, а также последовательного секционирования с последующим гематоксилином и эозином (Н &amp; Е) окрашивание ткани легкого, в количественной оценке, но в значительной степени зависят от определенных пользователем параметров для подсчета 2-5. При оценке целые легкие с помощью стереомикроскопа, только крупные поверхностные метастазы VisiBLE и анализ требует от следователя есть достаточные знания легких анатомической структуры, чтобы определить, что представляет собой метастатического поражения. Флуоресцентные маркировки опухолевых клеток с маркером, таким как GFP и использование стереомикроскопа, который содержит световой куб с соответствующими возбуждения / испускания максимумов (например, вблизи 470/510 нм для GFP) оказывает помощь в этом процессе, но только узелки опухоли поверхность обнаруживаются , Кроме того, флуоресценция заражение крови, которая видна при тех же параметрах, как GFP, может привести к ложной идентификации возможных метастазов. Секционирование легких с последующим H &amp; E окрашивания визуализировать легких метастазы является полезным методом для оценки микрометастазы и другие микроскопические процессы, включая иммунной клеточной инфильтрацией, но часто требует использования всей легочной ткани для парафин, секционирование и процедур окрашивания. Таким образом, ниже по течению процедуры не являются идеальными после этого метод. Хотя количественно, эта процедура требует исследователю оценить большое количество окрашенных срезов легких каждого животного, чтобы обеспечить, что анализ составляет всего 3D структуры легких. Следовательно, этот тип исследования является трудоемким, может привести к подсчету ошибку, и анализ в значительной мере опирается на следователя усмотрению. Несколько в естественных условиях методов визуализации (например, МРТ, ПЭТ, ОФЭКТ) в настоящее время используется для выполнения или тестирования биологических процессов в экспериментальных моделях грызунов 8. В естественных условиях биолюминесценции изображений является распространенным методом, используемым для получения валовой вид метастазирования 9. Этот метод обычно применяется для оценки присутствия репортера люциферазы активности вследствие накопления опухолевых клеток, которые сконструированы, чтобы содержать элемент ответа люциферазы, которые находятся в отдельных органах, таких как молочной железы после имплантации опухолевых клеток и легких при спонтанном метастазов 10. Визуализация люциферазы активности индуцируется присутствии субстрата люциферин (D-люциферин). Люциферазы катализирует окислительное декарбоксилирование D-люциферин на оксилюциферин генерации биолюминесценции. В то время как информативный, этот метод ограничен несколькими факторами, включая стабильность субстрата (т.е. короткий период жизни), адекватного распределения субстрата, которая зависит от того, как он будет доставлен в экспериментальных животных, и низкой чувствительности обнаружения 9. Основным достоинством этого метода является то, что она является неинвазивным, может быть выполнена на живых животных, и это может привести к обнаружению опухолевых клеток метастазов в различных органах, которые не могут быть нормально собраны в рассечения 9,10. Одним из положительных аспектов в естественных условиях методов визуализации является то, что легочная ткань без помех позволяет вторичных процедур, как парафин или представлены здесь, QRT-ПЦР-анализ. Тем не менее, из-за QRT-ПЦР theoreticaLLY более чувствительной мерой обнаружения, валовой оценка не может выявить низкие количества опухолевых клеток, присутствующих в легких. В то время как полезно, что методы визуализации, описанные выше, могут быть замещены или дополнены с помощью метода ПЦР QRT-описанной в данный момент. QRT-ПЦР имеет потенциал, чтобы обеспечить чувствительной мерой опухолевых полученных мРНК в легких.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

Метастатического заболевания является распространение клеток злокачественных опухолей от первичного рака сайта на отдаленный орган и является основной причиной рака, связанного смерти 1. Общие сайты метастазирования включают легкие, лимфатические узлы, мозг, кости и 2. Механизмы, которые управляют метастазы интенсивные направления исследований рака. Следовательно, эффективные анализы для измерения метастатического бремя в отдаленные участки метастазирования способствуют для исследований рака. Оценка легочных метастазов в молочных моделях опухолей, как правило, выполняется по грубой качественной наблюдения легочной ткани следующим вскрытия. Количественные методы оценки метастазов в настоящее время ограничены экс естественных условиях и в естественных методов визуализации на основе, которые требуют определенных пользователем параметров. Многие из этих методов находятся на уровне целого организма, а не клеточном уровне 3-6. Хотя новые методы визуализации, использующие многофотонное микроскопии способны оценить METASТАСИС на клеточном уровне 7, эти высоко изящные процедуры больше подходят к оценке механизмов распространения, а не количественную оценку метастатического бремени. Здесь простой метод в пробирке, чтобы количественной оценки метастазов представлена. Используя количественный ПЦР в реальном времени (QRT-ПЦР), специфической мРНК опухолевых клеток могут быть обнаружены в мышиных легочной ткани.

За время, которое требуется, чтобы выполнить начальную прививку опухолевых клеток в экспериментальных животных, и если выполнять, первичный анализ в опухолевой естественных, урожая ткани, выделения РНК и анализ QRT-PCR процедура 1-2 день (Рисунок 1) , <p ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Этот протокол описывает, как использовать количественную ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) для обнаружения специфических мРНК опухолевых клеток, представляющих метастазы в пределах мыши легочной ткани.

Оценка метастазов в легких у мыши опухоли молочной Модели количественными ПЦР в реальном времени

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Оценка наночастиц в опухоли в реальном времени с помощью Прижизненные изображения

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

В естественных условиях Биолюминесценция изображения опухоли Гипоксия Динамика груди метастазы рака мозга у мышей

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Обнаружение микроРНК в опухолях простаты количественного ПЦР в реальном времени (КПЦР)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Models of Bone Metastasis

Модели костных метастазов

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Жить изображений на наркотики Ответы на микроокружение опухоли в мышиных моделях рака молочной железы

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Использование Количественный ПЦР в реальном времени для определения Приживление клетки-донора в конкурентной мышиной модели трансплантации костного мозга костей

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Простой метод мышь интубации легких

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Инициирование метастатического рака молочной железы с помощью таргетинга из эпителия протоков с аденовируса-Cre: роман Трансгенные мыши Модель рака молочной железы

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Спинномозговой жидкости профилирования микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Первичная опухоль и MEF Выделение клеток для изучения метастазов в легких

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...