Name: evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Den Yeh labbet stöds av forskningsmedel från ett American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) tilldelas den Hollings Cancer Center vid MUSC genom forskningsmedel från en Department of Defense bidrag (W81XWH-11-2- 0229) på MUSC, och en utmärkelse från Concern Foundation (till ESY).

Protokollet följer de riktlinjer och djurvårds standarder för den medicinska universiteten av South Carolina (MUSC) och dess Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Brösttumör dissektion (tillval beroende på studie mål och om primärtumören analys eller svansveninjektion utfördes). <ol><li> Euthanize musen med en dödlig dos av isoflurananestesi enligt IACUC och universitet reglering. Bekräfta eutanasi genom kirurgisk förskjutning. </li><li> På skum...

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

Detta protokoll beskriver användningen av QRT-PCR för att utvärdera juver tumörcellmetastas till lungan med hjälp av en xenograft musmodell. Det medges att andra tekniker, inklusive självlysande bildbehandling, finns tillgängliga och är också effektivt för att upptäcka metastaser trots sina egna värderingar och begränsningar. De data som presenteras tyder på att QRT-PCR ger en effektiv åtgärd för att detektera tumörhärrörande mRNA inom lungvävnad för kvantifiering av den totala metastaser. Det för...

QRT-PCR-analys föreslås som en metod för att bedöma tumörmetastaser. Denna metod föreslås som ett alternativ för användare som är intresserade av att utvärdera metastaser men får inte ha tillgång till särskild utrustning som in vivo imaging utrustning eller fluorescens kan stereoskop. En diskussion av vanliga metoder presenteras följt av en demonstration för hur QRT-PCR-analys kan användas antingen som en separat eller som en följeslagare metod för att utvärdera metastaser. Detta förfarande har potential att ge en kvantitativ analys av metastaserande bördan. Standardmetoder av grov analys, inklusive visualisering av lungorna under ett stereomikroskop samt seriesnittning följt av hematoxylin och eosin (H &amp; E) färgning av lungvävnad, är kvantifierbara men är starkt beroende av användardefinierade parametrar för att räkna 2-5. Vid bedömningen av hela lungor med hjälp av ett stereomikroskop, bara stor yta metastaser är Visible och analys kräver utredaren att ha rimlig kunskap om lung anatomisk struktur för att avgöra vad som utgör en metastatisk skada. Fluorescensmärkning av tumörceller med en markör såsom GFP och användning av ett stereomikroskop som innehåller en ljus kub med lämplig excitering / emissionsmaxima (t.ex. nära 470/510 nm för GFP) bistår i denna process, men endast ytan tumörnoduli är detekterbara . Dessutom, fluorescens från blodsmitta, som är synlig under samma parametrar som GFP, kan leda till falsk identifiering av eventuella metastaser. Sektionering i lungorna följt av H &amp; E färgning att visualisera lungmetastas är en användbar metod för att utvärdera mikrometastaser och andra mikroskopiska processer inklusive immuncellinfiltration men ofta kräver användning av hela lungvävnad för paraffininbäddning, sektionering och färgningsprocedurer. Därför, förfaranden nedströms är inte idealiskt följer denna metod. Även kvantifierbar, kräver denna procedur utredaren att utvärdera ett stort antal färgade lungsektioner per djur för att säkerställa att analysen står för hela 3D-strukturen för lungan. Därför är denna typ av undersökning är tidskrävande, kan leda till att räkna fel, och analys är starkt beroende av utredare diskretion. Flera in vivo avbildningstekniker (t.ex. MR, PET, SPECT) används idag för att utföra eller testa biologiska processerna i experimentella gnagarmodeller 8. In vivo självlysande avbildning är en vanlig metod för att få en grov bild av metastaser 9. Denna teknik tillämpas allmänt för att utvärdera närvaron av luciferasaktivitet reporteraktivitet på grund av ansamling av tumörceller, vilka är konstruerade för att innehålla ett luciferas responselement, som finns i specifika organ såsom bröstkörteln efter tumörcell implantation och lungan vid spontan metastas 10. Visualisering av luciferas reporteraktivitet induceras genom närvaro av luciferin substrat (D-luciferin). Luciferas katalyserar den oxidativa dekarboxyleringen av D-luciferin att oxyluciferin generera bioluminiscens. Medan informativ, är denna metod begränsas av flera faktorer, inklusive substrat stabilitet (dvs. kort halveringstid), lämplig fördelning av substrat som beror på hur den levereras till försöksdjur, och låg känslighet för upptäckt 9. En huvud merit denna teknik är att den är icke-invasiv, kan utföras på levande djur, och kan leda till upptäckt av tumörcellmetastaser i flera organ som kanske inte har normalt skördas vid dissektion 9,10. En positiv aspekt av in vivo avbildningstekniker är att lungvävnaden är ostört möjliggör sekundära förfaranden som paraffininbäddning eller presenteras här, QRT-PCR-analys. Men eftersom QRT-PCR är theoretically ett mer känsligt mått på detektion, kan brutto utvärderingen inte avslöja lågt antal tumörceller som är närvarande i lungan. Medan användbara, kan de avbildningstekniker som beskrivits ovan vara substituerad eller kompletteras med QRT-PCR-metod som för närvarande beskrivs. QRT-PCR har potential att ge ett känsligt mått på tumörhärrörande mRNA i en lunga.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

Metastatisk sjukdom är spridningen av maligna tumörceller från den primära cancer webbplats till en avlägsen organ och är den främsta orsaken till cancer associerade dödsfall 1. Vanliga platser av metastatisk spridning inkluderar lunga, lymfkörtel, hjärna och ben 2. Mekanismer som driver metastaser är intensiva områden av cancerforskningen. Följaktligen effektiva analyser mäter metastaserande bördan i avlägsna områden av metastaser är av avgörande betydelse för cancerforskningen. Utvärdering av lungmetastaser i brösttumörmodeller i allmänhet utförs av grov kvalitativ observation av lungvävnad efter dissektion. Kvantitativa metoder för att utvärdera metastaser är för närvarande begränsad till ex vivo och in vivo imaging baserade tekniker som kräver användardefinierade parametrar. Många av dessa tekniker är på hela organismen nivå snarare än cellnivå 3-6. Även nyare avbildningsmetoder som använder multi-foton mikroskopi kan bedöma metastasis på cellnivå 7, dessa mycket elegant förfaranden är bättre lämpade för att utvärdera mekanismer för spridning snarare än kvantitativ bedömning av metastaserande bördan. Här är en enkel in vitro metod för att kvantitativt bedöma metastaser presenteras. Med hjälp av kvantitativa realtid PCR (QRT-PCR), kan tumörcellspecifika mRNA detekteras i musen lungvävnad.

Utöver den tid det tar att utföra den initiala inokuleringen av tumörceller in i försöksdjuret och om utförande, är primärt in vivo tumöranalys, vävnaden skörd, RNA-isolering, och QRT-PCR-analys en 1-2 dagars förfarande (Figur 1) . Ett exempel av brutto analys är självlysande avbildning att utvärdera tumörceller i lungvävnad. Här var en brösttumörbildning experiment för att utvär...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Detta protokoll beskriver hur man använder kvantitativa realtid PCR (QRT-PCR) för att upptäcka tumörcellsspecifika mRNA representerar metastaser i musen lungvävnad.

Utvärdering av lungmetastas i musbrösttumör Modeller av kvantitativ realtids-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Utvärdering av nanopartiklar Upptag i tumörer i realtid med hjälp Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo bioluminescence avbildning av tumör Hypoxi Dynamics i bröstcancer metastaser i hjärnan i en musmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MikroRNA Detektion av prostatatumörer genom kvantitativ realtids-PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Models of Bone Metastasis

Modeller för benmetastaser

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Realtidsundersökningen av Drug svar i tumören mikromiljön i musmodeller av bröstcancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Använda kvantitativ realtids-PCR för att avgöra Engraftment donatorcellen i en konkurrenskraftig Murine Bone Marrow Transplantation Modell

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

En enkel metod för mus Lung Intubation

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Inledande av metastaserande Bröstkarcinom genom Inriktning av Ductal epitel med adenovirus-Cre: A Novel transgen musmodell av bröstcancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinalvätska MikroRNA Profilering Med kvantitativa realtid-PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Primärtumör och MEF Cell Isolation att studera lungmetastas

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...