Name: multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers
Uploaded: 2015-11-19T15:00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

ويدعم البحث عنها في هذا المنشور من قبل مكتب سلاح الجو للبحوث العلمية الأساسية مبادرة منحة FA9550-12-1-0464.

<ol>
	<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties.">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).</li><li>Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+bimolecular+protein-lipid+membranes+in+aqueous+solution.">Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution.</a> Nature. , (1966).</li><li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Bilayer+Formation+by+Contacting+Monolayers+in+a+Microfluidic+Device+for+Membrane+Protein+Analysis.">Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis.</a> ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).</li><li>Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+bionetworks+from+nanoliter+water+droplets.">Functional bionetworks from nanoliter water droplets.</a> J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Maglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+networks+with+incorporated+protein+diodes+show+collective+properties.">Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties.</a> Nat Nano. 4, 437-440 (2009).</li><li>Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+formation+between+lipid-encased+hydrogels+contained+in+solid+substrates.">Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates.</a> ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+attachment+method+for+reconstituting+lipid+bilayers+of+prescribed+size+within+flexible+substrates.">Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates.</a> ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-based+biomolecular+smart+materials.">Membrane-based biomolecular smart materials.</a> SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+virtual+ground+to+control+transmembrane+voltages+and+measure+bilayer+currents+in+serial+arrays+of+droplet+interface+bilayers.">The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers.</a> SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-inspired+electroactive+polymer+materials+incorporating+biomolecular+materials.">Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials.</a> SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Bayley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayers.">Droplet interface bilayers.</a> MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+torus+surrounding+planar+lipid+bilayer+membranes.">Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes.</a> BIOPHYS J. 12, 432 (1972).</li><li>Tien, H. T., Ottova, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+bilayer+concept+and+its+experimental+realization:+from+soap+bubbles,+kitchen+sink,+to+bilayer+lipid+membranes.">The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes.</a> J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).</li><li>Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+prokaryotic+mechanosensitive+channels.">Gating prokaryotic mechanosensitive channels.</a> NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).</li><li>Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+channels+in+microbes.">Mechanosensitive channels in microbes.</a> ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+census+of+mechanosensitive+channels+in+living+bacteria.">Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria.</a> PLoS ONE. 7, e33077 (2012).</li><li>Levina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+Escherichia+coli+cells+against+extreme+turgor+by+activation+of+MscS+and+MscL+mechanosensitive+channels:+identification+of+genes+required+for+MscS+activity.">Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity.</a> The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).</li><li>Chiang, C. -. S., Anishkin, A., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+the+large+mechanosensitive+channel+in+situ:+estimation+of+the+spatial+scale+of+the+transition+from+channel+population+responses.">Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses.</a> BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).</li><li>Anishkin, A., Chiang, C. -. S., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+reveal+expanded+intermediate+states+and+a+sequential+action+of+two+gates+in+MscL.">Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).</li><li>Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetic+and+Spatial+Parameters+for+Gating+of+the+Bacterial+Large+Conductance+Mechanosensitive+Channel,+MscL.">Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).</li><li>Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+investigation+of+MscL+gating+using+experimental+data+and+coarse+grained+MD+simulations.">Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations.</a> PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).</li><li>Kubalski, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. , (2005).</li><li>Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+MscL+homolog+from+Mycobacterium+tuberculosis:+a+gated+mechanosensitive+ion+channel.">Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel.</a> Science. 282, 2220-2226 (1998).</li><li>Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+prokaryotic+mechanosensitive+channels+MscL+and+MscS.">Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS.</a> Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).</li><li>Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+models+of+the+MscL+gating+mechanism.">Structural models of the MscL gating mechanism.</a> BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).</li><li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels.">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li><li>Betanzos, M., Chiang, C. -. S., Guy, H. R., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+iris-like+expansion+of+a+mechanosensitive+channel+protein+induced+by+membrane+tension.">A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension.</a> NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).</li><li>Corry, B., Jayatilaka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+structure,+orientation,+and+energy+transfer+between+AlexaFluor+molecules+attached+to+MscL.">Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL.</a> BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+FRET+Reveals+Pore+Size+and+Opening+Mechanism+of+MscL.">Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL.</a> eLife. 3, e01834 (2014).</li><li>Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydration+properties+of+mechanosensitive+channel+pores+define+the+energetics+of+gating.">Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating.</a> J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).</li><li>Ko&#231;er, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+voltage-gated+ion+channel+model+inferred+from+the+crystal+structure+of+alamethicin+at+1.5-&#8491;+resolution.">A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-&#8491; resolution.</a> Nature. 300, 325-330 (1982).</li><li>Iwamoto, M., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+Bubble+Bilayers+with+Flush+Drainage.">Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Barriga, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayer+reconstitution+and+activity+measurement+of+the+mechanosensitive+channel+of+large+conductance+from+Escherichia+coli.">Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli.</a> J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Mechanosensation يدل على واحدة من أولى مسارات نقل الحسية التي تطورت في الكائنات الحية. استخدام هذه الظاهرة لدراسة وفهم للوالميكانيكية الكهربائية خصائص بنك دبي الإسلامي، هو خطوة حاسمة تجاه مواد محفزات الاستجابة الوظيفية. أنه ينطوي على إدماج وتفعيل قناة mechanosensitive، MscL، في بنك دبي الإسلامي كما محول mechanoelectrical وقياس الضغط للكشف عن زيادة التوتر في واجهة الدهون طبقة ثنائية. على صعيد آخر، يمكن أن تنظم وظيفة قنوات MS خلال خصائص المواد الأساسية للطبقات ثنائية الدهون بما في ذلك سمك، انحناء جوهري، والانضغاطية. في ضوء ما سبق، توفر تقنية القائم على micropipette أداة قيمة تسمح للباحث القدرة على دراسة قنوات MS في الدبس ويقدم نظرة ثاقبة هيكل طبقة ثنائية الدهون، وكذلك التفاعلات دهون، بروتين. على مدى العقد الماضي ثلاثةالصورة، كان التصحيح، المشبك الطريقة الأساسية لدراسة قنوات MS، لأنه يسمح لقط كل الجهد والتوتر. ومع ذلك، والتصحيح، المشبك يتطلب معدات ضخمة وغير مناسبة لالتصغير، وهي خاصية اللازمة لهندسة الأجهزة الحسية والتحويل. الدبس بسبب من البساطة، والاستقرار، والاكتناز تمثل بيئة مناسبة لدراسة نشاط MscL. هنا، ونحن نعرب السلف السابقة في تقنيات تشكيل بنك دبي الإسلامي من خلال اقتراح تقنية القائم على micropipette، مع القدرة على التحكم في حجم قطرات واجهة طبقة ثنائية، والتركيب الكيميائي لكل قطرة، والتوتر في الواجهة من خلال التحفيز الحيوي. وتتكون هذه التقنية من ترسيخ قطرات المائية، التي تحتوي على proteoliposomes، إلى نصائح من محوري معارضة الزجاج الشعيرات الدموية. يتم وضع قطرات في حمام من المذيبات العضوية وعند مثوله في اتصال من أشكال طبقة ثنائية الدهون في واجهة. وترد بال micropipettes إلى pمؤشرات التذبذب iezoelectric، مما يسمح النزوح الأفقي للقطرات. ضغط حيوي قطرات، والنتائج في زيادة التوتر السطحي في واجهة النفط المياه، وبالتالي زيادة في طبقة ثنائية التوتر. جانبين رئيسيين هما تفرق هذه الطريقة من المماثلة والتي نشرت مؤخرا طبقة ثنائية فقاعة الاتصال (مصرف البحرين المركزي) تقنية 37. باستخدام تقنية الواردة في هذه الوثيقة، وحجم طبقة ثنائية يتم التحكم باستخدام micromanipulators وبالتالي على حجم قطرات تبقى ثابتة، على عكس الطريقة مصرف البحرين المركزي. وبالإضافة إلى ذلك، تدعو تقنية مصرف البحرين المركزي لمضخات الضغط، التي لا يحتاج إليها في طريقة عرضها في هذه الورقة مما يجعل من أبسط وأسهل لبناء. ونحن قادرون على دمج وتحفيز MscL البكتيري للمرة الأولى دون استخدام ماصة التصحيح أو التعديلات الكيميائية 38. لأن النظام يسهل تشكيل قوة غير متكافئة الأغشية الدهنية طبقة ثنائية، فإنه يحاكي عن كثب لالتباين IPID وجدت في الأغشية البيولوجية. وهذا يسمح لنا لدراسة الآثار المترتبة على تكوين غشاء رقابة أو التماثل على نشاط MscL. بالإضافة إلى ذلك، من خلال تقنيات معالجة الصور، ويساعد هذا الأسلوب تقدير التوتر في واجهة طبقة ثنائية. ويساعد هذا الأسلوب في فهم مبادئ interconversion بين السائبة وسطح القوات في بنك دبي الإسلامي، ويسهل قياس خصائص الغشاء الأساسية، وتحسين فهم استجابة MscL لغشاء التوتر. على الرغم من أن هذه الطريقة يأخذنا خطوة أقرب نحو نظام المواد المحفزات التي تستجيب الجزيئية البيولوجية والبيئة الفسيولوجية المختلفة لدراسة MscL، وهناك قيود على النظام. التوتر في هذا النظام لا يمكن فرضت بسبب وجود خزان الدهون في شكل الجسيمات الشحمية في كل قطرة، والتي تميل إلى تخفيف حدة التوتر في واجهة النفط / الماء. لذلك، في قنوات mechanosensitive الحالية يمكن حفزفي الدبس فقط في نظام ديناميكي. وجود فقاعات هواء في نظام يؤثر تأثيرا كبيرا على الدقة واستنساخ التجارب. فقاعات الهواء الموجودة في الهلاميات المائية يمكن أن يؤدي فقدان إذا الربط الكهربائي. في حين وصفنا استخدام أسلوب ماصة الصغيرة القائمة على تحفيز MscL، يمكن أن تستخدم هذه التقنية لدراسة أنواع أخرى من قنوات MS ولديه القدرة ليتم استخدامها من قبل الباحثين لدراسة مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية. على سبيل المثال، تم استخدام الإعداد مماثل في المختبر لدراسة استجابة mechanoelectrical من واجهة قطرة الغشاء طبقة ثنائية خالية من القناة. يمكن إعادة تشكيل البروتينات المختلفة وتفعيلها باستخدام هذا الإعداد رقابة شديدة، مع الأخذ في الاعتبار أن البيئات إعادة كل جزيء حيوي تختلف. الطريقة الموضحة في هذه المقالة يتطرق إلى إمكانية التطبيق على نطاق أوسع بكثير أن يقتصر فقط على مخيلة الباحث.

في العقد الماضي، والتجمع من طبقات ثنائية الدهون الاصطناعية قد تقدمت بشكل كبير من خلال تطوير أسلوب طبقة ثنائية اجهة الحبرية. المعروفة باسم مستقرة وقوية، فرضت الدبس أنفسهم نظم بديلة لنموذج الكلاسيكية رسمت (مولر) ومطوية طبقات ثنائية (مونتال-مولر) مستو 1. على الرغم من أن فكرة استخدام قطرات لخلق طبقات ثنائية الدهون يعود إلى 1960s 2، فإنه لم اكتسب شعبية حتى وقت قريب. وذكر أول محاولة ناجحة من قبل مجموعة Takeushi 3، تليها عدة دراسات تثبت تشكيل طبقة ثنائية باستخدام شبكة قطرات من قبل مجموعة بايلي 4-6. وفي الآونة الأخيرة، تم اقتراح أساليب التغليف من قبل مجموعة ليو 7-9، الذي كان رائدا في مفهوم استخدام الدبس لبنات بناء نظم المواد رواية المحفزات التي تستجيب 10. في دراسات سابقة، أثبتت الدبس قدرتها على الرد على الكهرباء 9،11، كيمياءكال 10،12، والبصرية المحفزات 13. الجزيئات الحيوية المختلفة مع وظائف المحفزات استجابة مختلفة قد حفز على نحو فعال عندما أعيد في بنك دبي الإسلامي 10،14. في ضوء هذه المحاولات الناجحة أثير سؤال مهم: يمكن أن تستجيب DIB إلى التحفيز الميكانيكي عندما يتم دمج الجزيئات الحيوية المناسبة؟ قوات بينية بناء على DIB تختلف عن تلك الموجودة في غيرها من 15،16 نظام طبقة ثنائية. لذا، يمكن السيطرة على التوتر في طبقة ثنائية عقدت من قبل قطرات من خلال تنظيم التوتر في الواجهات المائية الدهون النفط. مفهوم لا ينطبق مع أنظمة طبقة ثنائية رسمت أو مطوية. قنوات MscL، المعروف على نطاق واسع صمامات الإفراج osmolyte والعناصر الأساسية للغشاء هيولي البكتيرية، والرد على زيادة التوتر غشاء 17،18. في حالة حدوث صدمات للفراش لا تسبب ناضح، وعدة قنوات المقيمين في غشاء خلية صغيرة يمكن أن تولد 19 ماساستجابة نفاذية SIVE للافراج بسرعة الأيونات والجزيئات الصغيرة، وتوفير البكتيريا من تحلل 20. Biophysically، MscL تدرس بشكل جيد وتتميز في المقام الأول من خلال التصحيح بارز المشبك تقنية 21-23. واقترح النماذج الهيكلية موثوقة شرح آلية النابضة 24،25 MscL على أساس هيكل homolog لها من الكريستال 26،27، والنمذجة 28، ونتائج التجارب واسعة النطاق 24،29-31. في ظل التوتر التطبيقية ~ 10 مليون / م، وقناة المغلقة التي تتكون من حزمة ضيقة من اللوالب عبر الغشاء، يتحول إلى حلقة من اللوالب يميل كثيرا تشكيل ~ 28 Å مملوءة بالماء المسام موصل 21،24،32. كما تم إثبات أن للا مائية من البوابة الضيقة المتمركزة عند تقاطع المجالات TM1 الداخلية، ويحدد عتبة تفعيل القناة 33. في المقابل، وجد أن من خلال خفض للا مائية من البوابة، والتوتر السطحييمكن خفض ن عتبة 22. جعلت هذه الخاصية من MscL الممكنة تصميم مختلف صمامات التحكم 34، في المقام الأول لأغراض تسليم المخدرات. لكافة الخصائص المذكورة أعلاه، واستنادا إلى دورها الأساسي في ترجمة غشاء الخلية التوتر المفرط في الأنشطة الكهربية، MscL يجعل خيارا مثاليا كما محول mechanoelectrical في الدبس. في هذه المقالة، نقدم طريقة القائم على micropipette الأصلي لتشكيل الدبس وقياس النشاط القنوات MscL تأسست بموجب التحفيز الميكانيكي. نفيدكم للمرة الأولى، استجابة الدبس إلى التحفيز الميكانيكي وإعادة الوظيفية متحولة V23T منخفضة عتبة MscL في الدبس 35. يتكون النظام التجريبي من الدهون المغطى قطرات المائية ترتكز على نصائح من اثنين من المعارضين بال micropipettes الزجاج البورسليكات. فإذا ما وضعنا قطرات على اتصال واجهة طبقة ثنائية الدهون هو FOrmed. هذه التقنية تتيح السيطرة على التركيب الكيميائي وحجم كل قطرة (بالجملة)، فضلا عن أبعاد واجهة طبقة ثنائية. وبالإضافة إلى ذلك، والأغشية غير متكافئة مع مختلف مكونات الدهون في كل نشرة يمكن تشكيلها بسهولة. وجود واحد من بال micropipettes تعلق على المحرك كهرضغطية التوافقي، ويوفر القدرة على تطبيق دورة واحدة مبرمجة مسبقا أو التحفيز متذبذبة. يتم تسليم التوتر إلى غشاء اصطناعي من خلال ضغط كل من قطرات دعمها. ونتيجة لقطرات تشوه، مجالات المياه الدهون النفط واجهات الزيادة، في وقت واحد الزاوية بين قطرات النقصان، مما تسبب في زيادة التوتر الغشاء وتفعيل MscL عابر. من خلال تحليل الأشكال من قطرات خلال تشويه، ويمكن تقدير التوتر التي تم إنشاؤها في الواجهة. على الرغم من أن التركيز في هذه المقالة على خصائص والميكانيكية تنبيغ من بنك دبي الإسلامي، فإننا نؤكد أيضا أن أنواع أخرى من الحيويةالجزيئات، مثل alamethicin، يمكن تفعيلها من خلال هذه المنصة متعددة الوظائف. نقدم هنا، كل الجوانب التقنية لإعداد وتجميع، وأخذ القياسات مع هذا الأسلوب الجديد بطريقة خطوة بخطوة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MscL، قناة mechanosensitive تصرف كبير (MSC)، هو في كل مكان صمام الافراج osmolyte التي تساعد البكتيريا على قيد الحياة صدمات للفراش لا تسبب الاسموزي مفاجئة. وقد تم اكتشاف ودرس بدقة باستخدام تقنية التصحيح، المشبك لثلاثة عقود تقريبا. دورها الأساسي في ترجمة التوتر تطبق على غشاء الخلية في الاستجابة نفاذية يجعله مرشحا قويا لتكون بمثابة محول mechanoelectrical في الأجهزة الجزيئية البيولوجية التي تعتمد على الأغشية الاصطناعية. بمثابة اللبنات لمثل هذه الأجهزة، طبقات ثنائية اجهة قطرة (الدبس) ويمكن استخدام منصة جديدة لإدراج وتنشيط قنوات MscL. هنا، نحن تصف طريقة القائم على micropipette لتشكيل الدبس وقياس النشاط القنوات MscL يدمج. يتكون هذا الأسلوب من قطرات المغطى الدهون المائية ترتكز على نصائح من اثنين من المعارضين (وضع محوري) بال micropipettes الزجاج البورسليكات. عندما يتم إحضارها قطرات على اتصال، واجهة الدهون طبقة ثنائية هوشكلت. هذه التقنية تتيح السيطرة على التركيب الكيميائي وحجم كل قطيرة، فضلا عن أبعاد واجهة طبقة ثنائية. وجود واحد من بال micropipettes تعلق على المحرك كهرضغطية التوافقي يوفر القدرة على تقديم الحوافز متذبذبة المطلوب. من خلال تحليل الأشكال من قطرات خلال تشويه، والتوتر الناجم في واجهة يمكن تقدير. باستخدام هذه التقنية، فقد ذكر أن النشاط الأول من القنوات MscL في نظام بنك دبي الإسلامي. إلى جانب قنوات MS، أنشطة أنواع أخرى من القنوات يمكن دراستها باستخدام هذه الطريقة، التي تثبت وظائف متعددة من هذا المنبر. الطريقة المعروضة هنا يمكن قياس خصائص الغشاء الأساسي، ويوفر سيطرة أكبر على تشكيل الأغشية المتماثلة وغير المتماثلة، وهي وسيلة بديلة لتحفيز ودراسة قنوات mechanosensitive.

أرقام 1 و 2 شاشة الإعداد والمعدات التجريبية تستخدم لتسجيل نشاط البروتين في سياق التحفيز الميكانيكي من الغشاء الدهني طبقة ثنائية. للحد من الضوضاء الكهربائية في قياساتنا، يتم وضعها داخل محطة العمل من صنع مختبر قفص فاراداي، ترتكز على اتصال الأرض على AxoPatch 200 B مكبر للصوت. تشكيل مستقرة العازلة الدهون طبقة ثنائية هو خطوة رئيسية في هذه الدراسة. في هذا الترتيب، وتجمع أحادي الطبقة الدهنية في واجهة النفط / الماء من قطرات مائية مغمورة في حمام من مذيب عضوي. عندما يتم وضع قطرات في الاتصال، ويتم التخلص من فائض المعروض النفطي، والطبقات الوحيدة الدهون المعارضة رقيقة إلى اثنين من جزيء سميكة الدهون طبقة ثنائية. تقنية الأكثر شيوعا المستخدمة في توصيف طبقة ثنائية هو الجهد المشبك. مع الجهد المشبك، يتم الحفاظ على الجهد عبر طبقة ثنائية في قيمة ثابتة بينما يتم قياس التيار الشكل 4 </stronز&gt; يصور في الوقت الحقيقي تسجيل الحالي نموذجي لتشكيل طبقة ثنائية الأولي. معرفة السعة المحددة (~ 0.6 μF / سم 2) 5 من الدهون طبقة ثنائية DPhPC، ويمكن حساب منطقة طبقة ثنائية تشكيلها. يمكن السيطرة على منطقة طبقة ثنائية عن طريق تغيير موقف قطرات (الشكل 4A). باستخدام المحرك كهرضغطية، وأنواع مختلفة من الطول الموجي (الجيبية، مربع، مثلث، الخ.) على ترددات مختلفة، سعة، ودورات اجب يمكن تطبيقها على قطرات لأفقيا ومحوريا تتذبذب لهم وبالتالي، يمكن أن تتغير التوتر طبقة ثنائية والمنطقة (الشكل 4B). عندما يتم تحفيز DIB ميكانيكيا، مع الإبقاء على إمكانية DC ثابت عبر الغشاء، على عتبة منخفضة (اكتساب-وظيفة) V23T متحولة من MscL يولد أنشطة يمكن الاعتماد عليها بما في ذلك الدول أساسا شبه الموصلة والأحداث افتتاح أحيانا الكاملة (الشكل 5) . هذه EVالوالدان مماثلة لتلك التي تم تسجيلها باستخدام تقنية التصحيح، المشبك من سليمة الداخلية E. coli و الأغشية الجسيمات الشحمية تشكيلها مع V23T تنقيته MscL. النتائج في الشكل 5 تثبت أن يحدث النابضة ردا على زيادة التوتر، حيث يتم مراعاة جميع المسامير الحالية في ضغط الذروة. في ضغط الذروة، والتوسع المساحي النسبي من قطرات هو الحد الأقصى، وبالتالي، والتوتر في واجهة هو الحد الأقصى. Alamethicin، والجهد بوابات قناة ايون واحدة من الببتيدات الأكثر درس، ويزيد من نفاذية الغشاء عندما يتم تطبيق DC الجهد عبر الغشاء 36. يتم اختبار قدرة واجهة الدهون طبقة ثنائية لاستضافة بروتينات الغشاء والببتيدات أيضا عن طريق إجراء التسجيلات الحالية-النابضة الجهد باستخدام alamethicin الببتيد. يتم خلط Alamethicin مع الحل فوسفورية إلى تركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل الشكل 6 يظهر القياسات الحالية في إطار<html> المشبك الجهد (+115 فولت). يتم سحبها قطرات في هذه التجربة بصرف النظر من أجل تحقيق اجهة طبقة ثنائية الصغيرة والمقاومة وبالتالي ارتفاع وأصغر السعة. يظهر السلوك النابضة من الببتيد Alamethicin من خلال الخطوات المنفصلة من الحالي (الشكل 6). الرسم البياني على الجانب الأيمن من مؤامرة يوضح التغيرات في تصرف من المستوى (0.0962 NS)، الذي هو في الأساس على مستوى تصرف الأول للقناة نفسها. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> الشكل 1: رسم تخطيطي تصف الأجزاء الرئيسية وأبعاد خزان النفط يتم تصنيعها خزان النفط في ورشة ميكانيكا في جامعة فرجينيا للتكنولوجيا. وهو يتألف من أنبوب اسطواني الاكريليك تشكيله لصقها على سطح ورقة الاكريليك. الأبعاد والتصميم يمكن تعديلها لاستيعاب مختلف التطبيقات أو أكثر من اثنين بال micropipettes./53362/53362fig1large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> ويشمل الإعداد وبال micropipettes إعداد التجريبية (A) محطة العمل القياسية للتشكيل، ميكانيكيا تحفيز، وتميز طبقات ثنائية اجهة المجهر، المتلاعبين 3 محاور، كاميرا رقمية، مذبذب كهرضغطية، جدول عزل الاهتزاز، وقفص فاراداي: الرقم 2. (غير ظاهر). (B) يتكون الإعداد التجريبية من اثنين من المعارضين PEG-DMA هيدروجيل شغل بال micropipettes وضعه أفقيا داخل حمام من النفط سداسي. كل من بال micropipettes يحتوي على القطب حج / أجكل لتوفير الربط الكهربائي. ويستخدم micropipette الثالث مليئة proteoliposome حل لتشكيل قطرات في غيض من بال micropipettes أخرى. (C) يمكن قياس استجابة DIB الحاليةباستخدام مزيج من مكبر للصوت التصحيح ومنخفضة الضوضاء نظام الحصول على البيانات. (D) وأغلق مرتفعا صورة تظهر قطرات مائية شكلت في غيض من بال micropipettes. مصنوعة أقطاب (E) حج / أجكل عن طريق غمس غيض من اثنين 250 ميكرون الأسلاك الفضية في التبييض. ثم يتم تغذية الأقطاب من خلال اثنين من الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مليئة PEG-DMA هيدروجيل، والتي يتم الشفاء للأشعة فوق البنفسجية لترسيخ. ويستخدم حامل التوالي مسرى مكروي مع موصل الذكور للاتصال واحدة من بال micropipettes إلى headstage من مكبر للصوت التصحيح. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> يتم وضع الصور التي توضح تشكيل طبقات ثنائية اجهة قطرة (A) A 10 ميكرون micropipette مليئة proteoliposomes تحت المجهر في القرب من نصائح micropipette: الرقم 3. باستخدام حقنة متصلة micropipette، الاستغناء عن كميات صغيرةمن proteoliposomes لتشكيل قطرات كروية للحجم المطلوب. السماح للشكل أحادي الطبقة من خلال السماح للقطرات على الجلوس لمدة عشر دقائق. جعل قطرات في الاتصال؛ سوف تشكل طبقة ثنائية بعد القضاء على كل النفط في واجهة. (B) في حين يتم تشكيل طبقة ثنائية، والتركيب الكيميائي في كلا الجانبين من واجهة يمكن السيطرة عليها عن طريق حقن المواد الكيميائية المطلوبة باستخدام micropipette الصغيرة الحجم. (C) وقطرات في لحظة من أول اتصال. (D) وقطرات عندما يتم تشكيل طبقة ثنائية المادة الدهنية. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> تظهر في الوقت الحقيقي قياسات كل من ترقق الأولي والتوسع اللاحق واجهة (A) الحالي يقاس خلال تشكيل طبقة ثنائية من خلال تطبيق الجهد الكهربائي الثلاثي: الرقم 4. حجم التيار المقاس هو يتناسب طرديا مع capaci<html> tance، وبالتالي مجال واجهة طبقة ثنائية. وأقرب يتم إحضارها قطرات معا، وأكبر مساحة من واجهة والعكس بالعكس. (B) بناء على طلب من الإثارة الميكانيكية، ومنطقة للزيادات واجهة طبقة ثنائية والنقصان في نفس التردد إشارة محفزة. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> الرقم 5: تظهر القياسات في الوقت الحقيقي استجابة طبقة ثنائية إلى الإثارة الميكانيكية وكذلك النابضة من متحولة V23T من MscL شكل الاستجابة الحالية غير الجيبية، التي تتعلق تغيير الجيبية في طبقة ثنائية السعة نتيجة لل التغيير منطقة طبقة ثنائية. المسامير الحالية، والتي تحدث في ذروة كل دورة، تشير تصرف الفرعي النابضة من متحولة V23T. مؤامرة القطبية أيضا إلى أن النابضة يحدث في ضغط الذروة، مما يعكس زيادة في التوتر في واجهة طبقة ثنائية. &gt; <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig6.jpg" /> وأظهرت القياسات الحالية تحت المشبك الجهد والرسم البياني المقابل من مستويات تصرف للنشاط النابضة القنوات Alamethicin أدرجت السلوك النابضة من الببتيد Alamethicin من خلال المنفصلة زيادة تدريجية في التيار: الرقم 6. تطابق مستويات تصرف بشكل جيد جدا مع القياسات السابقة التي يؤديها مجموعة بحثنا في جامعة فرجينيا للتكنولوجيا (7).

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

قنوات mechanosensitive البكتيرية ويمكن استخدام محولات mechanoelectrical في الأجهزة الجزيئية البيولوجية. طبقات ثنائية اجهة قطرة (الدبس)، اللبنات مستوحاة من الخلية إلى هذه الأجهزة، وتمثل منصات جديدة لدمج وتحفيز قنوات mechanosensitive. هنا، علينا أن نظهر طريقة القائم على micropipette الجديد من تشكيل الدبس، والسماح للدراسة قنوات mechanosensitive تحت التحفيز الميكانيكي.

متعددة الوظائف، طريقة Micropipette القائم لتأسيس وتحفيز القنوات Mechanosensitive البكتيرية ايون في القطرة واجهة طبقات ثنائية

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

إعداد طبقات ثنائية الاصطناعي للتجارب الكهربية

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

طريقة مبتكرة لثقافة الاستقطاب وتحفيز من explants الإنسان مخاطية الأمعاء

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

قياس خارج الخلية ايون تدفقاتها باستخدام ايون انتقائية مسرى مكروي تقنية الرجوع الذاتي

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

تقرير من سطح الخلية النسبي ومجموع التعبير عن قنوات المؤتلف ايون باستخدام التدفق الخلوي

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...