Name: multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers
Uploaded: 2015-11-19T15:00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Forskning rapporteret i denne publikation er støttet af Air Force Office of Scientific Research Basic Initiative Grant FA9550-12-1-0464.

<ol>
	<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties.">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).</li><li>Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+bimolecular+protein-lipid+membranes+in+aqueous+solution.">Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution.</a> Nature. , (1966).</li><li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Bilayer+Formation+by+Contacting+Monolayers+in+a+Microfluidic+Device+for+Membrane+Protein+Analysis.">Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis.</a> ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).</li><li>Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+bionetworks+from+nanoliter+water+droplets.">Functional bionetworks from nanoliter water droplets.</a> J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Maglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+networks+with+incorporated+protein+diodes+show+collective+properties.">Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties.</a> Nat Nano. 4, 437-440 (2009).</li><li>Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+formation+between+lipid-encased+hydrogels+contained+in+solid+substrates.">Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates.</a> ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+attachment+method+for+reconstituting+lipid+bilayers+of+prescribed+size+within+flexible+substrates.">Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates.</a> ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-based+biomolecular+smart+materials.">Membrane-based biomolecular smart materials.</a> SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+virtual+ground+to+control+transmembrane+voltages+and+measure+bilayer+currents+in+serial+arrays+of+droplet+interface+bilayers.">The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers.</a> SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-inspired+electroactive+polymer+materials+incorporating+biomolecular+materials.">Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials.</a> SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Bayley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayers.">Droplet interface bilayers.</a> MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+torus+surrounding+planar+lipid+bilayer+membranes.">Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes.</a> BIOPHYS J. 12, 432 (1972).</li><li>Tien, H. T., Ottova, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+bilayer+concept+and+its+experimental+realization:+from+soap+bubbles,+kitchen+sink,+to+bilayer+lipid+membranes.">The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes.</a> J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).</li><li>Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+prokaryotic+mechanosensitive+channels.">Gating prokaryotic mechanosensitive channels.</a> NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).</li><li>Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+channels+in+microbes.">Mechanosensitive channels in microbes.</a> ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+census+of+mechanosensitive+channels+in+living+bacteria.">Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria.</a> PLoS ONE. 7, e33077 (2012).</li><li>Levina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+Escherichia+coli+cells+against+extreme+turgor+by+activation+of+MscS+and+MscL+mechanosensitive+channels:+identification+of+genes+required+for+MscS+activity.">Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity.</a> The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).</li><li>Chiang, C. -. S., Anishkin, A., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+the+large+mechanosensitive+channel+in+situ:+estimation+of+the+spatial+scale+of+the+transition+from+channel+population+responses.">Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses.</a> BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).</li><li>Anishkin, A., Chiang, C. -. S., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+reveal+expanded+intermediate+states+and+a+sequential+action+of+two+gates+in+MscL.">Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).</li><li>Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetic+and+Spatial+Parameters+for+Gating+of+the+Bacterial+Large+Conductance+Mechanosensitive+Channel,+MscL.">Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).</li><li>Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+investigation+of+MscL+gating+using+experimental+data+and+coarse+grained+MD+simulations.">Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations.</a> PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).</li><li>Kubalski, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. , (2005).</li><li>Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+MscL+homolog+from+Mycobacterium+tuberculosis:+a+gated+mechanosensitive+ion+channel.">Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel.</a> Science. 282, 2220-2226 (1998).</li><li>Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+prokaryotic+mechanosensitive+channels+MscL+and+MscS.">Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS.</a> Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).</li><li>Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+models+of+the+MscL+gating+mechanism.">Structural models of the MscL gating mechanism.</a> BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).</li><li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels.">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li><li>Betanzos, M., Chiang, C. -. S., Guy, H. R., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+iris-like+expansion+of+a+mechanosensitive+channel+protein+induced+by+membrane+tension.">A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension.</a> NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).</li><li>Corry, B., Jayatilaka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+structure,+orientation,+and+energy+transfer+between+AlexaFluor+molecules+attached+to+MscL.">Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL.</a> BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+FRET+Reveals+Pore+Size+and+Opening+Mechanism+of+MscL.">Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL.</a> eLife. 3, e01834 (2014).</li><li>Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydration+properties+of+mechanosensitive+channel+pores+define+the+energetics+of+gating.">Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating.</a> J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).</li><li>Ko&#231;er, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+voltage-gated+ion+channel+model+inferred+from+the+crystal+structure+of+alamethicin+at+1.5-&#8491;+resolution.">A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-&#8491; resolution.</a> Nature. 300, 325-330 (1982).</li><li>Iwamoto, M., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+Bubble+Bilayers+with+Flush+Drainage.">Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Barriga, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayer+reconstitution+and+activity+measurement+of+the+mechanosensitive+channel+of+large+conductance+from+Escherichia+coli.">Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli.</a> J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Mechanosensation betegner en af ​​de første sensoriske pathways, der udviklede sig i levende organismer. Ved hjælp af dette fænomen for at studere og forstå mekanisk-elektriske egenskaber af DIB, er et afgørende skridt i retning af funktionelle stimuli-reagerende materialer. Det indebærer inkorporering og aktivering af en mekanosensitiv kanal, MscL, i DIB som mechanoelectrical transducer og en strain gauge at opdage spændingen stigning i lipiddobbeltlaget interface. På en anden note, kan funktionen af ​​MS-kanaler reguleres gennem de grundlæggende materialeegenskaber lipiddobbeltlag herunder tykkelse, iboende krumning, og kompressibilitet. I lyset af ovennævnte, mikropipetten-baserede teknik giver et værdifuldt redskab, der giver forskeren mulighed for at studere MS kanaler i Dibs og giver indsigt i strukturen af ​​lipiddobbeltlaget, samt lipid-protein-interaktioner. I de seneste tre årtis, patch-clamp var den primære metode til at studere MS kanaler, eftersom den tillader fastspænding af både spænding og spændinger. Men patch-clamp kræver omfangsrigt udstyr og ikke egnet til miniaturisering, en egenskab der kræves til engineering af sensoriske og konvertering enheder. DIBS på grund af deres enkelhed, stabilitet og kompakthed repræsenterer et passende miljø for at studere aktiviteten af ​​MscL. Her har vi forlænge de tidligere fremskridt inden DIB dannelse teknikker ved at foreslå en mikropipette-baseret teknik, med evnen til at styre størrelsen af ​​dråber og dobbeltlag interface, den kemiske sammensætning af hver dråbe, og spændingen ved grænsefladen ved dynamisk stimulation. Teknikken består i at forankre vandige dråber, der indeholder proteoliposomer, til spidserne af koaksialt modstående glaskapillarer. Dråberne anbringes i et bad af organisk opløsningsmiddel og når de bringes i kontakt et lipiddobbeltlag formularer på grænsefladen. De mikropipetter er knyttet til piezoelectric oscillatorer, der tillader horisontal forskydning af dråberne. Dynamisk komprimering dråberne, resulterer i en forøgelse af grænsefladespænding på vandet olie interface og derfor en stigning i dobbeltlag spænding. To vigtige aspekter skelne denne metode fra den lignende og for nylig offentliggjort kontakt boble dobbeltlag (CBB) teknik 37. Anvendelse af teknikken er præsenteret heri, er størrelsen af ​​dobbeltlaget styres ved hjælp mikromanipulatorer og dermed mængden af ​​dråberne forbliver konstant, i modsætning til i CBB metode. Desuden CBB teknikken kræver trykpumper, som ikke er nødvendige i fremgangsmåden i dette papir gør det enklere og nemmere at bygge. Vi er i stand til at optage og stimulere bakteriel MscL for første gang uden anvendelse af et plaster pipette eller kemiske modifikationer 38. Da systemet letter dannelsen af ​​robuste asymmetriske lipiddobbeltlagsmembraner, det mere nøje efterligner den lipid asymmetri findes i biologiske membraner. Dette giver os mulighed for at studere virkningerne af membran sammensætning eller asymmetri styres på aktiviteten af ​​MscL. Derudover ved billedbehandlingsteknikker, denne metode hjælper estimere spændingen ved dobbeltlaget interface. Denne teknik medvirker til at forstå principperne for interomdannelsen mellem bulk- og overfladekræfter i DIB, letter målingerne af fundamentale egenskaber membran, og forbedrer forståelsen af ​​MscL reaktion på membranspænding. Selv om denne fremgangsmåde tager os et skridt nærmere mod en biomolekylær stimuli-reagerende materiale, og til et andet fysiologisk miljø at studere MscL, der er begrænsninger for systemet. Spændinger i dette system ikke kan fastspændes på grund af tilstedeværelsen af ​​lipidet reservoir i form af liposomer i hver dråbe, som har tendens til at lindre spændinger på olie / vand-grænsefladen. Derfor kan på nuværende mekanosensitive kanaler stimuleresi Dibs kun i en dynamisk ordning. Tilstedeværelsen af ​​luftbobler i systemet væsentligt påvirker præcisionen og reproducerbarheden af ​​forsøgene. Luftbobler i hydrogelerne kunne resultere tab, hvis elektrisk forbindelse. Mens vi beskriver anvendelsen af ​​mikro-pipette metode til stimulering af MscL, kunne teknikken anvendes til at undersøge andre typer MS kanaler og har potentialet til at blive anvendt af forskere til at undersøge en række biomolekyler. For eksempel har lignende opsætning blevet anvendt i vores laboratorium for at studere mechanoelectrical respons en kanal-fri dråbe grænseflade dobbeltlaget membran. Forskellige proteiner kan rekonstitueres og aktiveret ved hjælp af denne meget kontrolleret opsætning, idet der i betragtning, at de rekonstituering miljøer i hvert biomolekyle variere. Den beskrives i denne artikel metode berører et betydeligt bredere potentiale, der er kun begrænset til fantasien af ​​forskeren ansøgning.

I det seneste årti har samlingen af ​​kunstige lipiddobbeltlag blevet betydeligt frem gennem udvikling af dråben grænseflade dobbeltlaget metode. Kendt som stabil og robust, DIBS pålagt sig selv som alternative modelsystemer til klassiske malet (Mueller) og foldede (Montal-Mueller) plane dobbeltlag 1. Selv tanken om at bruge dråber til at skabe lipiddobbeltlag går tilbage til 1960&#39;erne 2, har det ikke vundet popularitet indtil for nylig. Den første vellykkede forsøg blev rapporteret af Takeushi gruppe 3, efterfulgt af flere undersøgelser, der påviser dobbeltlagsformation hjælp af et netværk af små dråber af Bayley gruppe 4-6. For nylig blev der indkapslingsteknikker foreslået af Leo gruppe 7-9, som pioner begrebet ved hjælp af DIBS som byggesten i nye stimuli-responderende materialesystemer 10. I tidligere undersøgelser, har DIBS bevist deres evne til at reagere på elektriske 9,11, chemical 10,12, og optisk stimuli 13. Forskellige biomolekyler med forskellige stimuli-reagerende funktionaliteter er blevet effektivt stimuleret når rekonstitueres i DIB 10,14. I lyset af disse vellykkede forsøg et vigtigt spørgsmål er rejst: kunne DIB reagere på mekaniske stimuli, når egnede biomolekyler er indarbejdet? De grænsefladespændinger kræfter, der virker på en DIB forskellige fra dem i andre dobbeltlag-system 15,16. Derfor kunne spændingen i dobbeltlaget, som dråberne styres ved at regulere spændingen ved vand-lipid-oil grænseflader; et koncept ikke relevant med de malede eller foldede dobbeltlag-systemer. MsCl kanaler, som er almindelig kendt som osmolyt release ventiler og grundlæggende elementer i den bakterielle cytoplasmatiske membran, reagerer på øget membran spænding 17,18. I tilfælde af hypo-osmotisk chok, flere kanaler bosiddende i membranen af en celle 19 lille kan generere en mastende permeabilitet reaktion på hurtigt at frigive ioner og små molekyler, hvilket sparer bakterier fra lysis 20. Biofysisk er MscL godt undersøgt og karakteriseret primært gennem den fremtrædende patch clamp teknik 21-23. Pålidelige strukturelle modeller forklarer MscL s gating mekanisme 24,25 er foreslås baseret på dens homolog s krystalstruktur 26,27, modellering 28, og resultaterne af omfattende eksperimenter 24,29-31. Under en påført spænding på ~ 10 mN / m, den lukkede kanal, der består af en stram bundt af transmembranspiraler, omdannes til en ring af stærkt hældende helixer danner en ~ 28 en vandfyldt ledende pore 21,24,32. Det er også blevet fastslået, at hydrofobiciteten af den stramme porten, der er placeret i skæringspunktet mellem de indre TM1 domæner, afgør, hvornår aktivering af kanalen 33. Tilsvarende blev det konstateret, at ved at reducere hydrofobiciteten af ​​porten, at tension tærskel kunne sænkes 22. Denne egenskab ved MscL muliggjort konstruktionen af forskellige styrbare ventiler 34, primært til lægemiddelfremføring. For alle de ovennævnte egenskaber, og baseret på dens grundlæggende rolle oversætte cellemembran store spændinger i elektrofysiologiske aktiviteter, MscL gør en stor pasform som en mechanoelectrical transducer i Dibs. I denne artikel præsenterer vi en original mikropipette-baserede metode til at danne DIBS og måle aktiviteten af ​​de inkorporerede MsCl kanaler under mekanisk stimulering. Vi rapporterer for første gang, respons Dibs mekanisk stimulus og den funktionelle rekonstituering af V23T lav tærskel mutant af MscL i Dibs 35. Det eksperimentelle system består af lipid indkapslet vandige dråber forankret til spidserne af to modsatrettede borsilicatglashulsfærer mikropipetter. Når dråberne bringes i kontakt et lipiddobbeltlag interface er foRMED. Denne teknik giver kontrol over den kemiske sammensætning og størrelsen af ​​hver dråbe (bulk), samt dimensionerne af dobbeltlaget interface. Desuden kunne asymmetriske membraner med forskellige lipidsammensætninger i hvert blad let dannes. Har en af ​​de mikropipetter knyttet til en harmonisk piezoelektrisk aktuator, giver mulighed for at anvende en forprogrammeret single-cyklus eller oscillerende stimulus. Spænding leveres til den kunstige membran gennem komprimering af begge dråber understøtter det. Som et resultat af små dråber deformation, områderne vand-lipid-olie grænseflader stigning, og samtidig vinklen mellem dråberne falder, forårsager en stigning i membranspændingen og forbigående MscL aktivering. Gennem analyse af formerne af dråberne under deformation, kunne spændingen skabt ved grænsefladen estimeres. Selvom fokus i denne artikel er på mekanisk-transduktion egenskaber af DIB vi også understrege, at andre typer af biomolekyler, såsom alamethicin, kan aktiveres af denne multifunktionelle platform. Vi præsenterer her, alle de tekniske aspekter af at forberede, montage, og måltagning med denne nye metode i en trin-for-trin måde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MscL, en stor ledningsevne mekanosensitiv kanal (MSC), er en allestedsnærværende osmolyt release ventil, der hjælper bakterier overlever pludselige hypoosmotisk chok. Det er blevet opdaget, og strengt studeret ved hjælp af patch-clamp teknik til næsten tre årtier. Dens grundlæggende rolle oversætte spænding, der påføres til cellemembranen i permeabilitet respons gør det til en stærk kandidat til at fungere som en mechanoelectrical transducer i kunstige membran-baserede biomolekylære enheder. Tjener som byggesten til sådanne enheder, kan dråber grænseflade dobbeltlag (DIBS) bruges som en ny platform for indarbejdelse og stimulering af MsCI kanaler. Her beskriver vi en mikropipette-baserede metode til dannelse af DIBS og måle aktiviteten af ​​de inkorporerede MsCI kanaler. Denne metode består af lipid-indkapslet vandige dråber forankret til spidserne af to modsatrettede (koaksialt) placeres borsilicatglashulsfærer mikropipetter. Når dråberne bringes i kontakt, et lipiddobbeltlag interface erdannet. Denne teknik giver kontrol over den kemiske sammensætning og størrelsen af ​​hver dråbe, såvel som dimensionerne af dobbeltlaget interface. Har en af ​​mikropipetter knyttet til et harmonisk piezoelektrisk aktuator giver mulighed for at levere en ønsket oscillerende stimulus. Gennem analyse af formerne af dråberne under deformation, kan estimeres spændingen skabt ved grænsefladen. Ved hjælp af denne teknik, er den første aktivitet MsCl kanaler i en DIB-system rapporteret. Udover MS-kanaler, kan aktiviteter i andre typer af kanaler undersøges ved hjælp af denne metode, beviser de multifunktionalitet af denne platform. Den præsenteres her metode muliggør måling af grundlæggende membran egenskaber, giver en større kontrol over dannelsen af ​​symmetriske og asymmetriske membraner, og er en alternativ måde at stimulere og studere mekanosensitive kanaler.

Figurerne 1 og 2 viser forsøgsopstillingen og udstyr anvendes til at registrere protein aktivitet i løbet af mekanisk stimulering af lipiddobbeltlagsmembranen. For at minimere elektrisk støj ind i vores målinger, bliver arbejdsstationen placeres inden for en lab-made Faradays bur, jordet til en jordforbindelse på Axopatch 200 B forstærker. Dannelse af en stabil isolerende lipiddobbeltlag er et vigtigt skridt i denne undersøgelse. I dette arrangement, et lipid monolag samler ved olie / vand-grænsefladen mellem de vandige dråber nedsænket i et bad af et organisk opløsningsmiddel. Når dråberne er placeret i kontakt, er overskydende olie fjernes, og de modstående lipidmonolag tynd til en to-molekyle tykt lipiddobbeltlag. Den mest almindelige teknik, der anvendes i dobbeltlaget karakteristik er spænding-klemme. Med spænding-clamp, er spændingen over dobbeltlaget holdes på en konstant værdi, mens strømmen måles. Figur 4 </strong&gt; skildrer en typisk realtid aktuelle optagelse af den oprindelige dobbeltlagsformation. Kendskab til specifikke kapacitans (~ 0,6 uF / cm2) 5 i DPhPC lipiddobbeltlaget, kunne beregnes arealet af den dannede dobbeltlag. Dobbeltlaget område kunne styres ved at ændre placeringen af dråberne (figur 4A). Ved hjælp af piezoelektriske aktuator, at forskellige typer af bølgeformer (sinusformet, kvadratisk, trekantet osv.) Ved forskellige frekvenser, amplituder, og driftsperioder påføres dråberne til vandret og aksialt svinge dem og således kunne dobbeltlag spændinger og areal ændres (figur 4B). Når DIB mekanisk stimuleres, og samtidig opretholde en konstant DC-potentiale over membranen, en lav-tærskel (vinde-of-funktion) V23T mutant af MscL genererer pålidelige aktiviteter, herunder primært sub-ledende stater og til tider fuldstændig åbning hændelser (figur 5) . Disse events er identiske med dem optaget med patch-clamp-teknik fra intakte indre E. coli-membraner og liposomer rekonstitueret med den rensede V23T MscL. Resultaterne i figur 5 bevise, at gating forekommer som respons på en stigning i spænding, da alle spidsværdier observeres ved peak komprimering. På peak kompression, den relative areal udvidelse af dråberne er maksimal, og derfor spændingen ved grænsefladen er maksimal. Alamethicin, en spænding ionkanal og en af de mest undersøgte peptider, øger membranpermeabilitet når en jævnspænding påføres over membranen 36. Evne lipiddobbeltlaget interface til vært transmembrane proteiner og peptider er også testet ved at udføre spænding-gating aktuelle optagelser ved hjælp alamethicin peptid. Alamethicin blandes med phospholipid opløsning til en endelig koncentration på 100 ng / ml. Figur 6 viser de aktuelle målinger under<html> spænding clamp (+115 mV). Dråberne i dette eksperiment trækkes fra hinanden for at opnå små dobbeltlag interface og dermed højere modstand og kapacitans mindre. Gating adfærd Alamethicin peptid vist gennem de diskrete trin af strøm (figur 6). Histogrammet på højre side af plottet viser ændringerne i konduktans fra basisniveauet (0,0962 NS), som er dybest set den første ledningsevne niveau af selve kanalen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> Figur 1:. En skematisk beskriver de vigtigste dele og dimensioner oliebeholderen Olien reservoiret er fremstillet på maskinværksted på Virginia Tech. Den består af en bearbejdet cylindrisk acrylrør limet til overfladen af ​​en acrylplade. Dimensioner og design kan ændres for at imødekomme forskellige applikationer eller mere end to mikropipetter./53362/53362fig1large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> Figur 2:. Eksperimentel opsætning og mikropipetter forberedelse (A) standard arbejdsstation til formning, mekanisk stimulerende, og karakterisere interface dobbeltlag omfatter et mikroskop, 3-aksede manipulatorer, et digitalt kamera, piezoelektriske oscillator, vibrationsisolering bord, og et Faradays bur (ikke vist). (B) Forsøgsopstillingen består af to modstående PEG-DMA hydrogel fyldt mikropipetter vandret anbragt i et bad af Hexadecan olie. Hver af mikropipetter indeholder en Ag / AgCl-elektrode for at tilvejebringe elektrisk forbindelse. En tredje mikropipette fyldt med proteoliposom opløsning anvendes til dannelse af dråberne på spidsen af ​​de andre mikropipetter. (C) kunne måles DIB aktuelle reaktionanvendelse af en kombination af plasteret forstærker og støjsvag datafangstsystem. (D) en lukket billede, der viser de vandige dråber dannet ved spidsen af mikropipetter. (E) Ag / AgCl elektroder er fremstillet ved at dyppe spidsen af to 250 um sølvtråde i blegemiddel. Elektroderne føres derefter gennem to borsilicatglashulsfærer kapillærer fyldt med PEG-DMA hydrogel, som hærdes med UV-lys til at størkne. En lige mikroelektrode holder med hanstik bruges til at forbinde en af ​​mikropipetter til hovedtrin af plasteret forstærker. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> Figur 3:. Billeder, der illustrerer dannelsen af dråber grænseflade dobbeltlag (A) En 10 um mikropipette fyldt med proteoliposomer er placeret under mikroskop i nærheden af mikropipetten tips. Anvendelse af en sprøjte forbundet til mikropipetten dispensere små volumenerDe proteoliposomer at danne sfæriske dråber til den ønskede volumen. Lad monolagform ved at tillade dråberne at sidde i ti min. Bring dråberne i kontakt; dobbeltlaget vil dannes, efter at al olie ved grænsefladen elimineres. (B), mens dobbeltlaget er dannet, kan den kemiske sammensætning på begge sider af grænsefladen styres ved at injicere de ønskede kemikalier ved hjælp af en mikro-størrelse mikropipette. (C) Dråberne på det tidspunkt, første kontakt. (D) Dråberne når lipiddobbeltlaget er dannet. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> Figur 4: Real-time målinger viser både den oprindelige udtynding og efterfølgende udvidelse af grænsefladen (A) Nuværende målt i løbet af dobbeltlagsformation ved anvendelse af et trekantet elektrisk potentiale.. Størrelsen af ​​den målte strøm er direkte proportional med kapaciteterafstand, og dermed området af dobbeltlaget interface. Jo tættere dråberne bringes sammen, jo større arealet af grænsefladen og vice versa. (B) Ved anvendelse af mekanisk excitation, området af dobbeltlaget grænsefladen stigninger og fald på samme frekvens som stimulerende signal. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> Figur 5:. Real-time målinger viser responset af dobbeltlaget til mekanisk excitation samt gating af V23T mutant af MscL Formen af den aktuelle reaktion er sinusformet, som vedrører en sinusformet ændring i dobbeltlag kapacitans som følge af dobbeltlaget området forandring. De nuværende pigge, der forekommer på toppen af ​​hver cyklus, indikerer sub-konduktans gating af V23T mutanten. En polær plot indikerer endvidere, at gating sker ved peak kompression, hvilket afspejler en stigning i spænding på dobbeltlaget interface. Figur 6:. Aktuelle målinger under spænding klemme og tilsvarende histogram af konduktans niveauer for gating aktivitet indarbejdet alamethicin kanaler gating adfærd Alamethicin peptidet er vist gennem det diskrete trinvis stigning i strømmen. De konduktans niveauerne matcher meget godt med tidligere målinger udført af vores forskningsgruppe på Virginia Tech 7.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Bakterielle mekanosensitive kanaler kan anvendes som mechanoelectrical transducere i biomolekylære enheder. Dråbe grænseflade dobbeltlag (DIBS), celle-inspirerede byggestenene til disse enheder, udgør nye platforme at indarbejde og stimulere mekanosensitive kanaler. Her viser vi en ny mikropipette-baseret fremgangsmåde til dannelse af DIBS, tillader studiet af mekanosensitive kanaler under mekanisk stimulering.

Multifunktionel, Mikropipette-baserede metode til indbygning og stimulering af bakteriel mekanosensitiv Ion Channels i dråbeform Interface-dobbeltlag

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

En ny metode til Kultur-og polariseret Stimulation for Human tarmslimhinden Eksplantater

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Dyrkning af human Nasal epithelialceller på Air Liquid grænseflade

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Måling af Ekstracellulær ionstrømme Brug af Ion-selektive Self-henvisninger mikroelektrode Teknik

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Bestemmelse af den relative celleoverfladen og Total ekspression af rekombinante Ion Channels anvendelse af flowcytometri

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...