Name: multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers
Uploaded: 2015-11-19T15:00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Onderzoek gemeld in deze publicatie wordt ondersteund door de Air Force Office van Wetenschappelijk Onderzoek Basic Initiative Grant FA9550-12-1-0464.

<ol>
	<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties.">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).</li><li>Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+bimolecular+protein-lipid+membranes+in+aqueous+solution.">Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution.</a> Nature. , (1966).</li><li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Bilayer+Formation+by+Contacting+Monolayers+in+a+Microfluidic+Device+for+Membrane+Protein+Analysis.">Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis.</a> ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).</li><li>Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+bionetworks+from+nanoliter+water+droplets.">Functional bionetworks from nanoliter water droplets.</a> J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Maglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+networks+with+incorporated+protein+diodes+show+collective+properties.">Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties.</a> Nat Nano. 4, 437-440 (2009).</li><li>Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+formation+between+lipid-encased+hydrogels+contained+in+solid+substrates.">Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates.</a> ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+attachment+method+for+reconstituting+lipid+bilayers+of+prescribed+size+within+flexible+substrates.">Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates.</a> ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-based+biomolecular+smart+materials.">Membrane-based biomolecular smart materials.</a> SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+virtual+ground+to+control+transmembrane+voltages+and+measure+bilayer+currents+in+serial+arrays+of+droplet+interface+bilayers.">The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers.</a> SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-inspired+electroactive+polymer+materials+incorporating+biomolecular+materials.">Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials.</a> SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Bayley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayers.">Droplet interface bilayers.</a> MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+torus+surrounding+planar+lipid+bilayer+membranes.">Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes.</a> BIOPHYS J. 12, 432 (1972).</li><li>Tien, H. T., Ottova, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+bilayer+concept+and+its+experimental+realization:+from+soap+bubbles,+kitchen+sink,+to+bilayer+lipid+membranes.">The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes.</a> J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).</li><li>Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+prokaryotic+mechanosensitive+channels.">Gating prokaryotic mechanosensitive channels.</a> NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).</li><li>Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+channels+in+microbes.">Mechanosensitive channels in microbes.</a> ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+census+of+mechanosensitive+channels+in+living+bacteria.">Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria.</a> PLoS ONE. 7, e33077 (2012).</li><li>Levina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+Escherichia+coli+cells+against+extreme+turgor+by+activation+of+MscS+and+MscL+mechanosensitive+channels:+identification+of+genes+required+for+MscS+activity.">Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity.</a> The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).</li><li>Chiang, C. -. S., Anishkin, A., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+the+large+mechanosensitive+channel+in+situ:+estimation+of+the+spatial+scale+of+the+transition+from+channel+population+responses.">Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses.</a> BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).</li><li>Anishkin, A., Chiang, C. -. S., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+reveal+expanded+intermediate+states+and+a+sequential+action+of+two+gates+in+MscL.">Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).</li><li>Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetic+and+Spatial+Parameters+for+Gating+of+the+Bacterial+Large+Conductance+Mechanosensitive+Channel,+MscL.">Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).</li><li>Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+investigation+of+MscL+gating+using+experimental+data+and+coarse+grained+MD+simulations.">Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations.</a> PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).</li><li>Kubalski, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. , (2005).</li><li>Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+MscL+homolog+from+Mycobacterium+tuberculosis:+a+gated+mechanosensitive+ion+channel.">Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel.</a> Science. 282, 2220-2226 (1998).</li><li>Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+prokaryotic+mechanosensitive+channels+MscL+and+MscS.">Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS.</a> Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).</li><li>Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+models+of+the+MscL+gating+mechanism.">Structural models of the MscL gating mechanism.</a> BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).</li><li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels.">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li><li>Betanzos, M., Chiang, C. -. S., Guy, H. R., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+iris-like+expansion+of+a+mechanosensitive+channel+protein+induced+by+membrane+tension.">A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension.</a> NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).</li><li>Corry, B., Jayatilaka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+structure,+orientation,+and+energy+transfer+between+AlexaFluor+molecules+attached+to+MscL.">Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL.</a> BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+FRET+Reveals+Pore+Size+and+Opening+Mechanism+of+MscL.">Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL.</a> eLife. 3, e01834 (2014).</li><li>Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydration+properties+of+mechanosensitive+channel+pores+define+the+energetics+of+gating.">Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating.</a> J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).</li><li>Ko&#231;er, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+voltage-gated+ion+channel+model+inferred+from+the+crystal+structure+of+alamethicin+at+1.5-&#8491;+resolution.">A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-&#8491; resolution.</a> Nature. 300, 325-330 (1982).</li><li>Iwamoto, M., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+Bubble+Bilayers+with+Flush+Drainage.">Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Barriga, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayer+reconstitution+and+activity+measurement+of+the+mechanosensitive+channel+of+large+conductance+from+Escherichia+coli.">Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli.</a> J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Mechanosensation betekent een van de eerste zintuiglijke transductie routes die vrijkomt bij levende organismen. Met behulp van dit fenomeen voor het bestuderen en begrijpen van de mechanisch-elektrische eigenschappen van de DIB, is een cruciale stap in de richting van functionele stimuli-responsieve materialen. Het gaat om de integratie en activering van mechanosensitieve kanaal MscL in het DIB als mechanoelectrical transducer en een spanningsmeter spanning toename van de lipide bilaag-interface detecteert. Op een andere nota, kan de functie van MS kanalen worden geregeld door middel van de fundamentele materiaaleigenschappen van lipidendubbellagen waaronder dikte, intrinsieke kromming, en samendrukbaarheid. Gezien het voorgaande is de micropipet gebaseerde techniek een waardevol instrument waarmee de onderzoeker de mogelijkheid om MS kanalen DIB bestuderen en geeft inzicht in de structuur van de lipide bilaag, en de lipide-eiwit interacties. In de afgelopen drie decennias, patch-clamp was de primaire methode voor MS kanalen bestuderen, aangezien het klemmen van zowel de spanning en spanning. Echter, patch-clamp vereist omvangrijke uitrusting en niet geschikt voor miniaturisatie, een eigenschap die nodig is voor de engineering van sensorische en conversie apparaten. DIB vanwege hun eenvoud, stabiliteit en compactheid vormen een geschikte omgeving om de activiteit van MscL bestuderen. Hier breiden wij eerdere ontwikkelingen in de DIB formatie technieken stellen een micropipet gebaseerde techniek, met de mogelijkheid om de grootte van de druppels en dubbellaag-interface, de chemische samenstelling van elke druppel en de spanning aan het grensvlak via dynamische stimuleringsstuureenheid. De techniek bestaat uit het verankeren waterige druppeltjes, met proteoliposomen, de uiteinden coaxiaal tegenoverliggende glazen capillairen. De druppels worden in een bad van organisch oplosmiddel geplaatst en toen in aanraking gebracht een lipide bilaag vormen aan het grensvlak. De micropipetten zijn aan piezoelectric oscillatoren, waardoor horizontale verplaatsing van de druppels. Dynamisch comprimeren van de druppeltjes, resulteert in een toename van grensvlakspanning aan het water oliegrensvlak en dus een toename van bilaag spanning. Twee belangrijke aspecten onderscheiden deze methode van de vergelijkbare en recent gepubliceerde contactgegevens bubble dubbellaag (CBB) techniek 37. De hierin gepresenteerde techniek is de grootte van de bilaag gecontroleerde behulp micromanipulators en daarmee de omvang van de druppeltjes constant blijven, in tegenstelling tot de werkwijze CBB. Bovendien, het CBB techniek vraagt ​​om drukpompen, die in de in dit document maakt het eenvoudiger en gemakkelijker te bouwen werkwijze nodig zijn. We kunnen nemen en te stimuleren bacteriële MscL voor het eerst zonder het gebruik van een pleister pipet of chemische modificaties 38. Aangezien het systeem vergemakkelijkt de vorming van sterke asymmetrische lipide dubbellaag membranen, ze beter bootst de lipid asymmetrie gevonden in biologische membranen. Dit stelt ons in staat om de effecten van gecontroleerde membraan samenstelling of asymmetrie studie over de activiteit van MscL. Bovendien, door middel van beeldverwerkingstechnieken, helpt deze methode schatting van de spanning in de bilaag interface. Deze techniek helpt bij het begrijpen van de principes van interconversie tussen massa en oppervlaktekrachten in het DIB, vergemakkelijkt de metingen van fundamentele membraaneigenschappen, en verbetert het inzicht van MscL reactie op spanning membraan. Hoewel deze methode neemt een stap dichter naar een biomoleculaire stimuli-responsieve materiaalsysteem en een verschillende fysiologische omgeving MscL studie, zijn er beperkingen aan het systeem. Spanning in dit systeem kan niet worden vastgeklemd door de aanwezigheid van de lipide reservoir in de vorm van liposomen in elk druppeltje, die de neiging heeft ook spanning op de olie / water interface. Derhalve thans mechanosensitieve kanalen gestimuleerdin DIB slechts in een dynamische regime. De aanwezigheid van luchtbellen in het systeem aanzienlijke invloed op de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de experimenten. Luchtbellen in de hydrogels kunnen verliezen als de elektrische aansluiting leiden. Hoewel we beschrijven het gebruik van de micro-pipet methode voor het stimuleren van MscL, kan de techniek worden gebruikt om andere typen MS kanalen bestuderen en heeft het potentieel om te worden gebruikt door onderzoekers voor verschillende biomoleculen te bestuderen. Zo is gelijkaardige opstelling gebruikt in ons lab de mechanoelectrical respons van een kanaalvrije droplet-interface dubbellaag membraan te bestuderen. Verschillende eiwitten kunnen worden aangemaakt en geactiveerd met behulp van deze zeer gecontroleerde opstelling, waarbij in overweging dat de reconstructie omgevingen van elk biomolecuul variëren. De werkwijze beschreven in dit artikel raakt aanzienlijk ruimere toepassingsmogelijkheden die alleen beperkt tot de verbeelding van de onderzoeker.

In het afgelopen decennium is de assemblage van artificiële lipidendubbellagen aanzienlijk gevorderd door de ontwikkeling van de druppel-interface dubbellaag methode. Bekend als stabiel en robuust, DIB zichzelf opgelegd als alternatief model systemen om de klassieke geschilderde (Mueller) en gevouwen (Montal-Mueller) vlakke dubbellagen 1. Hoewel het idee van het gebruik van druppels te lipidendubbellagen creëren dateert uit de jaren 1960 2, is het niet aan populariteit gewonnen tot voor kort. De eerste succesvolle poging werd gerapporteerd door Takeushi groep 3, gevolgd door verscheidene studies tonen dubbellaagsformatie via een netwerk van druppels door de Bayley groep 4-6. Meer recent, werden inkapseling technieken voorgesteld door de Leo groep 7-9, die het concept van het gebruik van DIB&#39;s als bouwstenen van nieuwe stimuli-responsieve materiaal systemen 10 pionier. In eerdere studies, hebben DIB hun vermogen om te reageren op de elektrische 9,11, chem bewezeniCal 10,12, en optische stimuli 13. Verschillende biomoleculen met verschillende stimuli-responsieve functionaliteiten zijn effectief gestimuleerd wanneer opgelost in het DIB 10,14. In het licht van deze succesvolle pogingen een belangrijke vraag wordt opgeworpen: zou de DIB reageren op mechanische stimulus waar nodig biomoleculen zijn opgenomen? Het grensvlak krachten die op een DIB verschillen van die in andere bilaag systeem 15,16. Daarom kan de spanning in de bilaag bezit van de druppels worden geregeld door de spanning op het water-lipide-olie interfaces; een concept niet van toepassing met de geschilderde of gevouwen bilayer systemen. MscL kanalen, alom bekend als osmolyt vrijkomen kleppen en fundamentele elementen van de bacteriële celmembraan, te reageren op verhoogde membraan spanning 17,18. Bij hypo-osmotische schok, meerdere kanalen die in het membraan van een kleincellig 19 kan een mas genererensive permeabiliteit reactie op snel ionen en kleine moleculen vrij te laten, bespaart bacteriën uit lysis 20. Biofysisch wordt MscL goed bestudeerd en in de eerste plaats gekenmerkt door de prominente patch clamp techniek 21-23. Betrouwbare structurele modellen uitleggen MscL&#39;s gating mechanisme 24,25 worden voorgesteld op basis van zijn homoloog de ​​kristalstructuur 26,27, het modelleren van 28, en de resultaten van uitgebreide experimenten 24,29-31. Onder een aangelegde spanning van ~ 10 mN / m, de gesloten kanaal dat bestaat uit een dichte bundel van transmembraan helices, transformeert in een ring van sterk gekantelde helices vormen van een ~ 28 een met water gevulde geleidende poriën 21,24,32. Ook is vastgesteld dat de hydrofobiciteit van de strakke poort, geplaatst op het snijpunt van de binnenste TM1 domeinen, bepaalt de activeringsdrempel van het kanaal 33. Dienovereenkomstig bleek dat door het verminderen van de hydrofobiciteit van de poort, het tension drempel kan worden verlaagd 22. Deze eigenschap van MscL mogelijk gemaakt het ontwerp van de verschillende bestuurbare kleppen 34, voornamelijk voor drug delivery doeleinden. Voor alle genoemde eigenschappen en op basis van de fundamentele rol van het vertalen celmembraan overmatige spanningen in elektrofysiologische activiteiten, MscL maakt een goede pasvorm als mechanoelectrical transducer in DIB&#39;s. In dit artikel presenteren we een originele-micropipet gebaseerde methode om DIB vormen en meet de activiteit van de opgenomen MscL kanalen onder mechanische stimulatie. Wij rapporteren voor het eerst de reactie van DIB mechanische stimulus en de functionele reconstitutie van de V23T laagdrempelige mutant van MscL in DIB 35. Het experimentele systeem bestaat uit lipide omhulde waterige druppeltjes verankerd aan de uiteinden van twee tegengestelde borosilicaatglas micropipetten. Als druppels in contact worden gebracht een lipidebilaag interface is formed. Deze techniek biedt controle over de chemische samenstelling en de grootte van elke druppel (bulk), alsook de afmetingen van de bilaag interface. Bovendien kan asymmetrische membranen met verschillende lipidesamenstellingen in elk blad gemakkelijk worden gevormd. Met een van de micropipetten bevestigd aan een harmonische piëzo-elektrische actuator, biedt de mogelijkheid om een ​​voorgeprogrammeerde enkelvoudige cyclus of oscillerende stimulus toepassen. De spanning wordt geleverd aan de artificiële membraan door het samendrukken van beide druppels ondersteunen. Door druppel vervorming, de wateroppervlakken lipide-olie interfaces verhogen en tegelijkertijd de hoek tussen de druppeltjes af, waardoor een toename van de membraan spanning en voorbijgaande MscL activatie. Door middel van analyse van de vorm van de druppeltjes tijdens deformatie, kan de spanning gecreëerd op het grensvlak worden geschat. Hoewel de focus in dit artikel op de mechanisch-transductie eigenschappen van de DIB, ook benadrukken dat andere soorten biomoleculen zoals alamethicin kunnen worden geactiveerd door deze multifunctionele platform. We presenteren hier alle technische aspecten bereiden, assembleren en metingen met deze nieuwe werkwijze een stap voor stap manier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MscL, een grote geleidbaarheid mechanosensitieve kanaal (MSC), een alomtegenwoordige osmolyt ventiel dat helpt bacteriën overleven abrupte hypo-osmotische schokken. Ontdekt is en grondig bestudeerd met de patch-clamp techniek bijna drie decennia. De sleutelrol van het vertalen aangebracht op het celmembraan in respons permeabiliteit spanning maakt het een sterke kandidaat te functioneren als mechanoelectrical omzetter artificiële membraan gebaseerde biomoleculaire toestellen. Die als bouwstenen dergelijke apparatuur kan druppeltje interface-bilagen (DIB) worden gebruikt als een nieuw platform voor de integratie en stimulering van MscL kanalen. We beschrijven hier een micropipet gebaseerde methode DIB vormen en meten van de activiteit van de gebruikte MscL kanalen. Deze methode bestaat uit een lipide omhuld waterige druppeltjes verankerd aan de uiteinden van de twee tegengestelde (coaxiaal gepositioneerd) borosilicaatglas micropipetten. Als druppels in contact worden gebracht, een lipidebilaag interfacegevormd. Deze techniek biedt controle over de chemische samenstelling en de grootte van elke druppel, alsmede de afmetingen van de bilaag interface. Met een van de micropipetten bevestigd aan een harmonische piezoelektrische actuator biedt de mogelijkheid om een ​​gewenste oscillerende stimulus leveren. Door middel van analyse van de vorm van de druppeltjes tijdens deformatie, kan de spanning gecreëerd op het grensvlak worden geschat. Met deze techniek wordt de eerste activiteit van MscL kanalen in een DIB-systeem gerapporteerd. Naast MS-kanalen, kunnen de activiteiten van andere soorten kanalen worden bestudeerd met behulp van deze methode, waaruit blijkt dat de multi-functionaliteit van dit platform. De hier gepresenteerde methode maakt het meten van fundamentele membraaneigenschappen, verschaft een grotere controle over de vorming van symmetrische en asymmetrische membranen en is een alternatieve manier te stimuleren en studie mechanosensitieve kanalen.

Figuren 1 en 2 tonen de experimentele opstelling en uitrusting om eiwitactiviteit te nemen in de loop van mechanische stimulatie van de lipide dubbellaag membraan. Elektrische ruis in onze metingen te minimaliseren, is het werkstation geplaatst in een lab gemaakt kooi van Faraday, geaard om een ​​massa-aansluiting op de Axopatch 200 B versterker. De vorming van een stabiele isolerende lipide bilaag is een belangrijke stap in deze studie. In deze opstelling, een lipide monolaag assembleert het olie / water grensvlak van de waterige druppeltjes ondergedompeld in een bad van een organisch oplosmiddel. Wanneer druppels in contact worden gebracht, wordt overtollige olie verwijderd, en de tegenstander lipide monolagen dun om een ​​twee-molecuul dik lipidedubbellaag. De meest voorkomende techniek die op bilaag karakterisering voltage-clamp. Met voltage-clamp, is de spanning over de bilaag op een constante waarde, terwijl de stroom wordt gemeten. Figuur 4 </strong&gt; portretteert een typische real-time huidige opname van de initiële dubbellaagsformatie. Het kennen van de specifieke capaciteit (~ 0,6 uF / cm 2) 5 van de DPhPC lipide bilaag, zou de oppervlakte van de gevormde dubbellaag berekend. De dubbellaag gebied kan worden bestuurd door de positie van de druppels (Figuur 4A). Met de piëzo-elektrische actuator, kunnen verschillende golfvormen (sinus, vierkant, driehoekig, enz.) Op verschillende frequenties, amplitudes en werkcycli worden toegepast op de druppeltjes horizontaal en axiaal oscilleren hen en daardoor kunnen bilaag spanning en ruimte worden gewijzigd (Figuur 4B). Wanneer de DIB mechanisch gestimuleerd, terwijl een constante DC potentiaal over het membraan, een lage drempelwaarde (gain-of-function) V23T mutant van MscL genereert betrouwbare activiteiten waaronder voornamelijk sub-geleidende toestanden en soms volledige opening events (figuur 5) . Deze eventen zijn identiek aan die zijn opgenomen met de patch-clamp techniek uit intacte E. coli binnenste membranen en liposomen gereconstitueerd met het gezuiverde V23T MscL. De resultaten in figuur 5 tonen dat gating ontstaat als reactie op een toename van de spanning, omdat alle stroompieken waargenomen op maximale compressie. Bij piek compressie, de relatieve areal uitbreiding van de druppeltjes maximaal is en dus spanning op het grensvlak maximaal is. Alamethicin, een voltage-gated ionkanaal en een van de meest bestudeerde peptiden verhoogt de membraanpermeabiliteit wanneer een DC spanning wordt aangelegd over het membraan 36. Het vermogen van de lipide bilaag interface transmembranaire eiwitten en peptiden gastheer wordt getest door het uitvoeren van spanning gating stroom opnames via alamethicin peptide. Alamethicin gemengd met de fosfolipide-oplossing tot een eindconcentratie van 100 ng / ml. Figuur 6 toont de actuele metingen onder<html> spanningsklem (115 mV). De druppeltjes in dit experiment uit elkaar getrokken om kleine bilaag interface en dus hogere weerstand en kleinere capaciteit te bereiken. De gating gedrag van de Alamethicin peptide weergegeven door discrete stappen stroom (figuur 6). Het histogram aan de rechterkant van de grafiek geeft het verloop geleiding van het basisniveau (0,0962 nS), die in feite de eerste geleidbaarheid van het kanaal zelf. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> Figuur 1:. Een schematische beschrijving van de belangrijkste onderdelen en de afmetingen van het oliereservoir Het oliereservoir wordt geproduceerd in de werkplaats op Virginia Tech. Het bestaat uit een machinaal cilindrische acrylbuis vastgelijmd aan het oppervlak van een acrylplaat. De afmetingen en het ontwerp kunnen worden aangepast aan verschillende toepassingen of meer dan twee micropipetten tegemoet./53362/53362fig1large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> Figuur 2:. Experimentele opstelling en micropipetten preparaat (A) De standaard werkplek voor het vormen, mechanisch stimuleren en karakteriseren van de interface bilagen omvat een microscoop, 3-assen manipulatoren, een digitale camera, piëzo-elektrische oscillator, trillingsisolatie tafel, en een kooi van Faraday (niet laten zien). (B) De experimentele opstelling bestaat uit twee tegengestelde PEG-DMA hydrogel gevuld micropipetten horizontaal geplaatst in een bad van hexadecaan olie. Elk van de micropipetten bevat een Ag / AgCl elektrode elektrische verbinding. Een derde micropipet gevuld met proteoliposoom oplossing wordt gebruikt om de druppels bij het uiteinde van de andere micropipetten vormen. (C) Het DIB huidige respons kan worden gemeteneen combinatie van de pleister versterker en ruisarme meetsysteem. (D) een gesloten showing waterige druppeltjes gevormd aan het uiteinde van de micropipetten. (E) Ag / AgCl elektroden door dompelen het uiteinde twee 250 urn zilveren draden in bleekwater. De elektroden worden vervolgens door twee borosilicaatglas capillairen gevuld met PEG-DMA hydrogel, die wordt uitgehard met UV-licht te stollen. Directe micro-elektrode houder met mannelijke connector wordt gebruikt om één van de micropipetten om de headstage van de pleister versterker. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> Figuur 3:. Beelden illustreert de vorming van bilagen druppel-interface (A) A 10 micrometer micropipet gevuld met proteoliposomen wordt geplaatst onder de microscoop in de nabijheid van de micropipet tips. Met behulp van een injectiespuit verbonden met de micropipet, afzien kleine volumesvan de proteoliposomen bolvormige druppeltjes gewenste volume te vormen. Laat de monolaag vorm doordat de druppels te zitten voor tien minuten. Breng de druppels in contact; de bilaag zal vormen immers olie op het grensvlak wordt geëlimineerd. (B) Terwijl de dubbellaag wordt gevormd, kan de chemische samenstelling op beide zijden van de interface worden geregeld door het injecteren van gewenste chemicaliën behulp van een micro-sized micropipet. (C) De druppels op het moment van het eerste contact. (D) de druppeltjes bij de lipide dubbellaag wordt gevormd. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> Figuur 4: Real-time metingen tonen de initiële verdunning en daaropvolgende expansie van de interface (A) Current gemeten in de loop van dubbellaagsformatie door toepassing van een driehoekige elektrische potentiaal.. De grootte van de gemeten stroom is direct evenredig met de capaciafstand en daarmee het gebied van de bilaag interface. Hoe dichter de druppels worden samengebracht, hoe groter de oppervlakte van de interface en vice versa. (B) bij toepassing van mechanische excitatie, het gebied van de bilaag-interface verhoogt en verlaagt op dezelfde frequentie als stimulerend signaal. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> Figuur 5:. Real-time metingen tonen de respons van de bilaag mechanische excitatie en de gating van de V23T mutant van MscL De vorm van de huidige respons sinusvormig, betreffende een sinusvormige verandering van de bilaag capaciteit als gevolg van de bilaag wijzigen. De stroompieken, die zich op de top van elke cyclus, duiden sub-geleiding gating van de V23T mutant. Een polaire plot geeft verder aan dat gating optreedt op de piek van de compressie, die een toename van de spanningen in de bilaag-interface weerspiegelt. Figuur 6:. De huidige metingen onder spanning klem en bijbehorende histogram van geleiding niveaus voor gating activiteit van opgenomen Alamethicin kanalen De gating gedrag van de Alamethicin peptide wordt aangetoond door middel van de discrete stapsgewijze verhoging van de stroom. De geleiding niveaus passen heel goed bij eerdere metingen uitgevoerd door onze onderzoeksgroep op Virginia Tech 7.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Bacteriële mechanosensitieve kanalen kunnen worden gebruikt als mechanoelectrical transducers in biomoleculaire inrichtingen. Droplet-interface dubbellagen (DIB), cel-geïnspireerde bouwstenen om dergelijke apparaten, vertegenwoordigen nieuwe platforms op te nemen en te stimuleren mechanosensitieve kanalen. Hier tonen we een nieuwe micropipet gebaseerde werkwijze voor het vormen van DIB, waardoor de studie van mechanosensitieve kanalen onder mechanische stimulatie.

Multifunctionele, Micropipet-gebaseerde methode voor opname en het stimuleren van bacteriële mechanosensitieve Ion Channels in Droplet Interface dubbellagen

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Voorbereiding van de Kunstmatige dubbellagen voor Elektrofysiologie Experimenten

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Een nieuwe methode voor de cultuur en de gepolariseerde Stimulatie van Human darmslijmvlies Explantaten

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Kweken van Menselijke neus epitheelcellen op de Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...