Name: multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers
Uploaded: 2015-11-19T15:00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Recherche présentée dans cette publication est soutenue par l&#39;Office de la Force aérienne de l&#39;Initiative de recherche scientifique fondamentale Grant FA9550-12-1-0464.

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Les auteurs ont rien à révéler.

Mécanosensibilité signifie l&#39;une des premières voies de transduction sensorielle qui ont évolué dans les organismes vivants. L&#39;utilisation de ce phénomène pour l&#39;étude et la compréhension des propriétés mécano-électrique de la DIB, est une étape cruciale vers matériaux stimuli-sensibles fonctionnels. Elle implique l&#39;incorporation et l&#39;activation d&#39;un canal mécanosensible, MscL, dans la DIB comme un transducteur mécano et une jauge de contrainte pour détecter l&#39;augmentation de la tension dans l&#39;interface lipidique bicouche. Sur une autre note, la fonction de canaux MS pourrait être réglementée par les propriétés du matériau de base de bicouches lipidiques, y compris l&#39;épaisseur, la courbure intrinsèque, et la compressibilité. À la lumière de ce qui précède, la technique basée-micropipette fournit un outil précieux permettant au chercheur d&#39;étudier la capacité des canaux dans la SEP DIB et donne un aperçu de la structure dans la bicouche lipidique, ainsi que les interactions lipide-protéine. Au cours des trois dernières annéess, patch-clamp était la principale méthode pour étudier les canaux MS, car elle permet à la fois de la tension de serrage et de tension. Cependant, patch-clamp nécessite un équipement encombrant et ne convient pas pour la miniaturisation, une propriété nécessaire pour l&#39;ingénierie des dispositifs sensoriels et de conversion. DIB en raison de leur simplicité, de stabilité, et la compacité représentent un environnement approprié pour étudier l&#39;activité de MscL. Ici, nous présentons avances précédentes dans les techniques de formation DIB en proposant une technique basée micropipette, avec la capacité de contrôler la taille des gouttelettes et de l&#39;interface de deux couches, la composition chimique de chaque gouttelette, et la tension à l&#39;interface à travers la stimulation dynamique. La technique consiste à ancrer gouttelettes aqueuses, contenant des protéoliposomes, aux extrémités opposées de façon coaxiale capillaires en verre. Les gouttelettes sont placés dans un bain de solvant organique et lorsqu&#39;ils sont mis en contact un lipide formes bicouches à l&#39;interface. Les micropipettes sont attachés à piezoelectric oscillateurs, ce qui permet un déplacement horizontal de gouttelettes. Comprimer dynamiquement les gouttelettes entraîne une augmentation de la tension interfaciale à l&#39;interface eau-huile et donc une augmentation de la tension de la bicouche. Deux aspects majeurs différencient cette méthode à partir de la technique 37 contacts bulle similaire et a récemment publié bicouche (CBB). Utilisation de la technique présenté ici, la taille de la bicouche est contrôlé en utilisant des micromanipulateurs et donc les volumes des gouttelettes restent constantes, contrairement à la méthode CBB. En outre, la technique CBB appelle des pompes à pression, qui ne sont pas nécessaires dans la méthode présentée dans ce document rendant plus simple et plus facile à construire. Nous sommes en mesure d&#39;intégrer et de stimuler MscL bactérienne pour la première fois sans l&#39;utilisation d&#39;une pipette de patch ou de modifications chimiques 38. Étant donné que le système facilite la formation de membranes asymétriques robustes bicouches lipidiques, il imite plus étroitement la lasymétrie ipid trouvé dans les membranes biologiques. Cela nous permet d&#39;étudier les effets de la composition de la membrane contrôlée ou d&#39;asymétrie sur l&#39;activité de MscL. En outre, grâce à des techniques de traitement d&#39;image, ce procédé permet d&#39;estimer la tension à l&#39;interface de deux couches. Cette technique aide à comprendre les principes de interconversion entre les forces de surface et de volume dans la DIB, facilite les mesures des propriétés fondamentales de la membrane, et améliore la compréhension de la réponse à la membrane MscL tension. Bien que cette méthode nous emmène un pas de plus vers un système matériel de stimuli-sensibles biomoléculaire et à un environnement physiologique différente pour étudier MscL, il ya des limites au système. La tension dans ce système ne peut pas être serré en raison de la présence du réservoir de lipide sous la forme de liposomes dans chaque gouttelette, ce qui tend à réduire la tension à l&#39;interface huile / eau. Par conséquent, à l&#39;heure actuelle les canaux mécanosensibles peut être stimuléedans DIB que dans un régime dynamique. La présence de bulles d&#39;air dans le système affecte de manière significative la précision et la reproductibilité des expériences. Les bulles d&#39;air présentes dans les hydrogels pourraient entraîner la perte si la connexion électrique. Bien que nous décrivons l&#39;utilisation de la méthode de la micro-pipette pour la stimulation de MscL, la technique peut être utilisée pour étudier d&#39;autres types de canaux de sclérose en plaques et a le potentiel d&#39;être utilisée par les chercheurs pour étudier une variété de biomolécules. Par exemple, la configuration similaire a été utilisée dans notre laboratoire pour étudier la réponse de mécano une interface gouttelette membrane bicouche libre en forme de canal. Diverses protéines pourraient être reconstituées et activés à l&#39;aide de cette configuration très contrôlé, en prenant en considération que les environnements de reconstitution de chaque biomolécule varient. La méthode décrite dans cet article touche à un potentiel d&#39;application beaucoup plus large qui est limitée seulement à l&#39;imagination du chercheur.

Dans la dernière décennie, l&#39;assemblage des bicouches lipidiques artificielles a été avancé à travers sensiblement la mise au point de la méthode de la double couche d&#39;interface des gouttelettes. Connu comme stable et robuste, DIB se sont imposés comme des systèmes de modèle alternatif à la classique peint (Mueller) et pliés (Montal-Mueller) planes bicouches 1. Bien que l&#39;idée d&#39;utiliser des gouttelettes de créer bicouches lipidiques remonte aux années 1960 2, il n&#39;a pas gagné en popularité jusqu&#39;à récemment. La première tentative réussie a été rapporté par le groupe Takeushi 3, suivie par plusieurs études démontrant la formation de bicouche en utilisant un réseau de gouttelettes par le groupe Bayley 4-6. Plus récemment, des techniques d&#39;encapsulation ont été proposées par le groupe Leo 7-9, qui a lancé le concept de l&#39;utilisation de fichiers DIB comme blocs de construction de 10 nouveaux systèmes matériels stimuli-sensibles. Dans des études antérieures, DIB ont prouvé leur capacité à répondre à 9,11 électrique, chemical 10,12, et 13 stimuli optique. Diverses biomolécules avec des fonctionnalités différentes de stimuli-sensibles ont été effectivement stimulé lorsqu&#39;il est reconstitué dans la DIB 10,14. À la lumière de ces tentatives réussies une question importante se pose: la DIB pourrait répondre à un stimulus mécanique lors de biomolécules appropriées sont incorporés? Les forces interfaciales agissant sur ​​un DIB diffèrent de ceux des autres 15,16 système bicouche. Par conséquent, la tension dans la bicouche est tenue par des gouttelettes peut être contrôlée par le contrôle de la tension aux interfaces eau-lipide-huile; un concept pas applicable aux systèmes bicouches peintes ou pliées. MscL canaux, largement connu que les vannes osmolyte de libération et les éléments fondamentaux de la membrane cytoplasmique bactérienne, réagissent à l&#39;augmentation de la tension de la membrane 17,18. Dans le cas de chocs hypo-osmotique, plusieurs canaux résidant dans la membrane d&#39;une petite cellule 19 peut générer un masréponse de perméabilité sive pour libérer rapidement les ions et les petites molécules, sauver les bactéries de lyse 20. Biophysique, MscL est bien étudié et caractérisé principalement par le biais de la technique de patch clamp éminent 21-23. Modèles structurels fiables expliquant le mécanisme de déclenchement de 24,25 de MscL sont proposées sur la base de la structure de son homologue de cristal 26,27, 28 modélisation, et les résultats d&#39;une expérimentation 24,29-31. Sous une tension appliquée de ~ 10 mN / m, le canal fermé qui est constitué d&#39;un faisceau serré des hélices transmembranaires, se transforme en un anneau d&#39;hélices fortement inclinés formant un ~ 28 Å rempli d&#39;eau pores conducteur 21,24,32. Il a également été établi que le caractère hydrophobe de la porte étanche, placé à l&#39;intersection des domaines TM1 interne, détermine le seuil d&#39;activation de la voie 33. En conséquence, il a été trouvé que l&#39;hydrophobicité en diminuant de la porte, le tensioseuil de n 22 pourrait être abaissé. Cette propriété de MscL rendu possible la conception de diverses vannes contrôlables 34, principalement à des fins de délivrance de médicaments. Pour toutes les propriétés mentionnées ci-dessus et sur la base de son rôle fondamental de traduire la membrane cellulaire des tensions excessives dans les activités électrophysiologiques, MscL fait un grand ajustement comme un transducteur mécano dans DIB. Dans cet article, nous présentons une méthode basée sur la micropipette d&#39;origine pour former des DIB et de mesurer l&#39;activité des canaux MscL constituée en vertu de la stimulation mécanique. Nous rapportons pour la première fois, la réponse de DIB à un stimulus mécanique et la reconstitution fonctionnelle du mutant V23T faible seuil de MscL dans DIB 35. Le système expérimental est constitué de lipides enfermé gouttelettes aqueuses ancrés aux conseils de deux micropipettes de verre borosilicate opposées. Lorsque les gouttelettes sont mises en contact d&#39;une interface de bicouche lipidique est formée. Cette technique permet de contrôler la composition chimique et la taille de chaque gouttelette (en vrac), ainsi que les dimensions de l&#39;interface à deux couches. En outre, des membranes asymétriques avec différentes compositions lipidiques dans chaque feuillet pourraient facilement être formés. Ayant l&#39;une des micropipettes attachés à un actionneur piézo-électrique harmonique, permet d&#39;appliquer un seul cycle préprogrammé ou stimulus oscillatoire. La tension est fournie à la membrane artificielle par la compression de deux gouttelettes qui le soutiennent. À la suite de la déformation de la gouttelette, les domaines de l&#39;eau-huile-lipide interfaces augmentation, et simultanément l&#39;angle entre les gouttelettes diminue, ce qui provoque une augmentation de la tension de la membrane et MscL activation transitoire. Grâce à l&#39;analyse de la forme des gouttelettes lors de la déformation, la tension créée à l&#39;interface peut être estimé. Même si l&#39;accent dans cet article est sur les propriétés mécano-transduction de la DIB, nous soulignons également que d&#39;autres types de biomolécules, telles que alaméthicine, peuvent être activés par cette plate-forme multi-fonctionnel. Nous présentons ici, tous les aspects techniques de la préparation, de l&#39;assemblage, et en prenant des mesures avec cette nouvelle méthode d&#39;une manière étape-par-étape.

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		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MscL, un canal mécanosensible grande conductance (MSC), est une soupape de libération osmolyte omniprésente qui aide les bactéries survivent chocs hypo-osmotique brusques. Il a été découvert et étudié rigoureusement en utilisant la technique de patch-clamp pendant près de trois décennies. Son rôle de base de la conversion tension appliquée à la membrane cellulaire en réponse à perméabilité en fait un candidat solide pour fonctionner comme un transducteur mécano biomoléculaires dans des dispositifs à base de membranes artificielles. Servir comme blocs de construction de tels appareils, bicouches d&#39;interface des gouttelettes (de DIB) peuvent être utilisés comme une nouvelle plateforme pour l&#39;intégration et la stimulation des canaux MscL. Ici, nous décrivons une méthode basée micropipette pour former DIB et de mesurer l&#39;activité des canaux MscL incorporés. Cette méthode consiste à gouttelettes aqueuses lipides enfermé ancrés aux conseils de deux opposées (coaxiale) positionnés micropipettes de verre borosilicate. Lorsque les gouttelettes sont mises en contact, une interface bicouche lipidique estformée. Cette technique permet de contrôler la composition chimique et la taille de chaque gouttelette, ainsi que les dimensions de l&#39;interface à deux couches. Ayant l&#39;une des micropipettes attachés à un actionneur piézo-électrique harmonique permet de délivrer une impulsion d&#39;oscillation désirée. Grâce à l&#39;analyse de la forme des gouttelettes lors de la déformation, la tension créée à l&#39;interface peut être estimée. En utilisant cette technique, la première activité des canaux MsCl dans un système de DIB est rapporté. Outre les canaux MS, activités d&#39;autres types de canaux peuvent être étudiés en utilisant cette méthode, prouvant la multi-fonctionnalité de cette plate-forme. La méthode présentée ici permet la mesure des propriétés de la membrane fondamentale, offre un plus grand contrôle sur la formation des membranes symétriques et asymétriques, et est une autre façon de stimuler et étudier canaux mécanosensibles.

Figures 1 et 2 affichage de la configuration et de l&#39;équipement expérimental utilisé pour enregistrer l&#39;activité de la protéine au cours de la stimulation mécanique de la membrane bicouche lipidique. Pour minimiser le bruit électrique dans nos mesures, le poste de travail est placé dans une cage de Faraday de laboratoire réalisés, à la terre pour une connexion de terre sur la Axopatch 200 B Amplificateur. Formation d&#39;une écurie isolant bicouche lipidique est une étape clé dans cette étude. Dans cet agencement, une monocouche lipidique assemble à l&#39;interface huile / eau des gouttelettes aqueuses immergés dans un bain d&#39;un solvant organique. Lorsque les gouttelettes sont mises en contact, l&#39;excès d&#39;huile est éliminée, et les monocouches lipidiques opposées mince à une épaisseur de deux molécules bicouche lipidique. La technique la plus couramment utilisée dans la caractérisation bicouche est voltage-clamp. Avec voltage-clamp, la tension aux bornes de la double couche est maintenue à une valeur constante tandis que le courant est mesuré. Figure 4 </strong&gt; dépeint un enregistrement actuel en temps réel typique de la formation initiale de la bicouche. La connaissance de la capacité spécifique (~ 0,6 uF / cm 2) de la 5 bicouche lipidique DPhPC, la zone de la bicouche formée a pu être calculée. La zone de la bicouche peut être contrôlée en changeant la position des gouttelettes (figure 4A). Utilisation de l&#39;actionneur piézo-électrique, différents types de formes d&#39;onde (sinusoïdale, carrée, triangulaire, etc.) À des fréquences différentes, des amplitudes et des cycles de service pourraient être appliquées aux gouttelettes à horizontalement et axialement entre eux oscillent et donc, la tension de la bicouche et de la zone pourraient être modifiées (Figure 4B). Si la DIB est mécaniquement stimulée, tout en conservant un potentiel continu constant à travers la membrane, un seuil bas (gain de fonction) mutant V23T de MscL génère des activités fiables, y compris surtout les États sous-conducteurs et des événements parfois pleins d&#39;ouverture (Figure 5) . Ces events sont identiques à ceux enregistrés en utilisant la technique patch-clamp de membranes intactes intérieures E. coli et des liposomes reconstitués avec le V23T MscL purifiée. Les résultats de la figure 5 montrent que déclenchement se produit en réponse à une augmentation de la tension, étant donné que toutes les pointes de courant sont observés à la compression maximale. Au compression de crête, l&#39;expansion par rapport surfacique des gouttelettes est maximale et, par conséquent, la tension à l&#39;interface est maximale. Alaméthicine, un canal ionique voltage-dépendant et l&#39;un des peptides les plus étudiés, augmente la perméabilité de la membrane lorsqu&#39;une tension continue est appliquée à travers la membrane 36. La capacité de l&#39;interface lipide bicouche d&#39;accueillir transmembranaires protéines et des peptides est également testée en effectuant des enregistrements de courant à tension gating en utilisant alaméthicine peptide. Alaméthicine est mélangé avec la solution de phospholipide à une concentration finale de 100 ng / ml. La figure 6 montre les mesures de courant de moins de<html> pince de tension (115 mV). Les gouttelettes dans cette expérience sont séparés afin de réaliser petite interface à deux couches et donc une résistance plus élevée et plus faible capacité. Le comportement de déclenchement du peptide alaméthicine est représenté par les étapes discrètes de courant (figure 6). L&#39;histogramme sur le côté droit de la parcelle présente les variations de la conductance de la niveau de base (0.0962 ns), qui est essentiellement le premier niveau de la chaîne elle-même de la conductance. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> Figure 1:. Un schéma décrivant les principales parties et les dimensions du réservoir d&#39;huile Le réservoir d&#39;huile est fabriqué dans l&#39;atelier d&#39;usinage à Virginia Tech. Il se compose d&#39;un tube cylindrique usiné acrylique collé à la surface d&#39;une feuille acrylique. Les dimensions et le design peuvent être modifiés pour accueillir différentes applications ou plus de deux micropipettes./53362/53362fig1large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> Figure 2:. Configuration et micropipettes expérimentale préparation (A) Le poste de travail standard pour former, mécaniquement stimulant, et la caractérisation des bicouches d&#39;interface comprend un microscope, manipulateurs à 3 axes, un appareil photo numérique, un oscillateur piézo-électrique, table d&#39;isolation des vibrations, et une cage de Faraday (pas montré). (B) Le dispositif expérimental se compose de deux opposés PEG-DMA hydrogel rempli micropipettes placés horizontalement dans un bain d&#39;huile Hexadécane. Chacune des micropipettes contient une électrode Ag / AgCl pour fournir une connexion électrique. Un troisième micropipette remplie de protéoliposome solution est utilisée pour former des gouttelettes à la pointe des autres micropipettes. (C) La réponse en courant peut être mesuré de DIBen utilisant une combinaison de l&#39;amplificateur de patch et le système d&#39;acquisition de données à faible bruit. (D) Un fermé photo montrant les gouttelettes aqueuses formées à la pointe des micropipettes. Électrodes (E) Ag / AgCl sont fabriqués en trempant le bout de deux 250 um fils d&#39;argent dans l&#39;eau de Javel. Les électrodes sont ensuite introduites à travers les deux tubes capillaires en verre de borosilicate remplis d&#39;hydrogel de PEG-DMA, qui est durci avec de la lumière UV à se solidifier. Le titulaire de microélectrodes droite avec connecteur mâle est utilisé pour connecter un des micropipettes à l&#39;headstage de l&#39;amplificateur de patch. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> Figure 3:. Images qui illustrent la formation de bicouches gouttelettes d&#39;interface (A) à 10 pm micropipette remplie de protéoliposomes est placé sous le microscope à proximité de la pointe de micropipette. En utilisant une seringue reliée à la micropipette, distribuer de petits volumesdes protéoliposomes pour former des gouttelettes sphériques de volume désiré. Laissez la forme de monocouche en permettant aux gouttelettes reposer pendant dix minutes. Apportez les gouttelettes en contact; la bicouche se forme après toute l&#39;huile à l&#39;interface est éliminée. (B) Pendant la bicouche est formé, la composition chimique des deux côtés de l&#39;interface peut être contrôlé par l&#39;injection de produits chimiques désirés au moyen d&#39;un micro-taille micropipette. (C) Les gouttelettes au moment du premier contact. (D) Les gouttelettes lorsque la bicouche lipidique est formée. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> Figure 4: Mesures en temps réel montrent à la fois l&#39;amincissement initial et l&#39;expansion subséquente de l&#39;interface (A) actuelle mesurée au cours de la formation de bicouche par l&#39;application d&#39;un potentiel électrique triangulaire.. L&#39;intensité du courant mesurée est directement proportionnelle à la capacidistance, et donc la zone de l&#39;interface à deux couches. Plus les gouttelettes sont amenées ensemble, plus la zone de l&#39;interface et vice versa. (B) Lors de l&#39;application de l&#39;excitation mécanique, la zone de l&#39;interface bicouches augmente et diminue à la même fréquence que le signal de stimulation. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> Figure 5:. Mesures en temps réel Les montrent la réponse de la bicouche à une excitation mécanique ainsi que le déclenchement du mutant V23T de MscL La forme de la réponse en courant est sinusoïdal, qui se rapporte à un changement sinusoïdal en bicouche capacité à la suite de le changement de zone de bicouche. Les pointes de courant, se produisant à la pointe de chaque cycle, indiquent sous-conductance déclenchement du mutant V23T. Un tracé polaire indique en outre que déclenchement se produit à la compression de pointe, ce qui reflète une augmentation de la tension à l&#39;interface de la bicouche. Figure 6:. Les mesures de courant dans le cadre de serrage et de tension correspondant histogramme de niveaux de conductance de l&#39;activité de déclenchement de canaux incorporés alaméthicine Le comportement de déclenchement du peptide alaméthicine est signalée par l&#39;augmentation par étapes discrètes en cours. Les niveaux de conductance correspondent très bien avec les mesures précédentes effectuées par notre groupe de recherche à Virginia Tech 7.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Canaux mécanosensibles bactériennes peuvent être utilisés comme capteurs dans des dispositifs mécano biomoléculaires. Bicouches gouttelettes d&#39;interface (DIB), blocs de construction inspiré de cellule à ces dispositifs, représentent de nouvelles plateformes pour intégrer et stimuler les canaux mécanosensibles. Ici, nous démontrons une nouvelle méthode de formation de DIB, permettant l&#39;étude des canaux mécanosensibles sous stimulation mécanique basé micropipette.

Multifonctionnel, Micropipette à base Méthode de constitution et la stimulation de la société Bacterial mécanosensible Canaux ioniques en gouttelettes interface Bilayers

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

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