Name: multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers
Uploaded: 2015-11-19T15:00:00
Duration: 9 min 54 s
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S., Anishkin, A., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+the+large+mechanosensitive+channel+in+situ:+estimation+of+the+spatial+scale+of+the+transition+from+channel+population+responses.">Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses.</a> BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).</li><li>Anishkin, A., Chiang, C. -. S., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+reveal+expanded+intermediate+states+and+a+sequential+action+of+two+gates+in+MscL.">Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).</li><li>Sukharev, S. I., Sigurdson, W. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+MscL+homolog+from+Mycobacterium+tuberculosis:+a+gated+mechanosensitive+ion+channel.">Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel.</a> Science. 282, 2220-2226 (1998).</li><li>Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+prokaryotic+mechanosensitive+channels+MscL+and+MscS.">Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS.</a> Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).</li><li>Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. 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著者らは、開示することは何もありません。

Mechanosensationは生物に進化した第1の感覚の伝達経路のいずれかを意味します。 DIBのメカノ電気的特性を研究し、理解するため、この現象を利​​用して、機能的な刺激応答性材料に向けた重要なステップです。これは、脂質二重層インターフェースの張力の増加を検出することmechanoelectrical変換器とひずみゲージとしてDIBに、機械受容チャネル​​、MSCLの取り込みおよび活性化を伴います。別のノートでは、MSチャネルの機能は、厚さ、内部曲率、および圧縮を含む脂質二重層の基本的な材料特性を介して調節することができます。前述の光では、マイクロピペットベースの技術は、研究者のDIBで、MSチャンネルを研究し、脂質二重層の構造と同様に、脂質 - タンパク質相互作用への洞察を提供する能力を可能にする貴重なツールを提供します。 過去3十年にわたってSは、パッチクランプは、電圧と緊張の両方のクランプを可能にするので、MSチャネルを研究する主な方法でした。しかし、パッチクランプは小型化、感覚および変換デバイスのエンジニアリングのために要求される特性に適しかさばる機器ではなく、する必要があります。そのシンプルさ、安定性、および小型化に起因するのDIBはMSCLの活性を研究するために適した環境を表しています。ここでは、液滴と二層インターフェイスのサイズ、各液滴の化学組成、および動的刺激を介して界面における張力を制御する能力を、マイクロピペットベースの手法を提案することによってDIB形成技術の前の進歩を拡張します。技術は同軸上にガラスキャピラリーに反対の先端に、プロテオリポソー​​ムを含む、水性液滴を固定する構成されています。液滴は、有機溶媒の浴中に置き、界面での接触脂質二重層の形態で運ばれているとき。 マイクロピペットは、pに接続されています液滴の水平変位を可能iezoelectric発振器、。動的に液滴を圧縮し、水中油界面二重層と張力の増​​加したがってにおける界面張力の増加をもたらします。二つの主要な側面が類似しており、最近発表されたコンタクトバブル二重層（CBB）技術37からこのメソッドを区別しています。本明細書に提示される技術を使用して、二層の大きさは、マイクロマニピュレーターを使用して制御されるため、液滴の体積は、CBB法とは異なり、一定のままです。また、CBB技術が構築することが簡単で容易になり、本論文で提示された方法で必要とされていない圧力ポンプ、を求めています。 私たちは、組み込み、パッチピペットまたは化学修飾38を使用せず、初めての細菌MSCLを刺激することができます。システムは堅牢な非対称脂質二重膜の形成を促進するので、より密接リットルを模倣生体膜で見つかったIPID非対称。これは、私たちはMSCLの活性に対する制御膜組成や非対称性の影響を研究することができます。さらに、画像処理技術を介して、この方法は、二層界面における張力を推定するのに役立ちます。 DIBにバルクと表面力の間の相互変換の原理を理解する上でこの技術を支援は、基本的な膜特性の測定を容易にし、膜張力にMSCL応答の理解を向上させます。 この方法はMSCLを研究するために生体分子刺激応答性材料系に向けて、さまざまな生理的環境に歩近づく私たちがかかりますが、システムには限界があります。このシステムでは、張力により油/水界面での緊張を緩和する傾向が各小滴中のリポソームの形態で脂質リザーバの存在にクランプすることができません。そのため、現在では機械受容チャネル​​を刺激することができますのみ動的政権でのDIBインチシステム中の気泡の存在は、かなりの実験の精度、再現性に影響を与えます。ヒドロゲル内に存在する気泡は、電気的な接続の場合の損失を生じる可能性があります。 我々はMSCLの刺激のためのマイクロピペットに基づく方法の使用を記載しているが、技術は、MSのチャネルの他の種類を研究するために使用され、生体分子の多様性を研究するために研究者によって使用される可能性を有することができます。例えば、同様の設定は、チャネルフリー液滴界面の二分子膜のmechanoelectrical応答を研究するために我々の研究室で使用されています。様々なタンパク質が再構成し、各生体分子の再構築環境が変化することを考慮して取って、この高度に制御された設定を使用して活性化することができます。この資料に記載されているメソッドは、研究者の想像力に制限されてかなり広い応用の可能性にも触れて。

過去十年間に、人工脂質二重層のアセンブリは、実質的に液滴界面の二重層法の開発を通して進められています。安定した、堅牢として知られ、DIBには（ミューラー）塗装古典と折り畳まれた（Montal-ミューラー）の平面二重層1の代替モデル系として自分自身を課しました。脂質二重層を作成するための液滴を使用してのアイデアは1960年代2にさかのぼりますが、それは最近まで人気を獲得していません。最初に成功した試みはベイリー・グループ4-6により液滴のネットワークを使用して、二重層形成を証明するいくつかの研究が続いTakeushiグループ3、によって報告されました。より最近では、カプセル化技術は、新規な刺激反応材料システム10の構成要素としてのDIBを使用する概念を開拓レオグループ7-9によって提案されました。以前の研究では、DIBには、電気9,11、CHEMに対応する能力を証明していますiCalの10,12、および光刺激13。 DIB 10,14で再構成したときに別の刺激応答性官能基を有する様々な生体分子を効果的に刺激されました。これらの成功した試みの​​光の中で重要な問題が提起されています。適切な生体分子が組み込まれている場合、DIBは、機械的刺激に反応するだろうか？ DIBに作用する界面力は、他の2層系15,16と異なります。そのため、液滴に保持された二重層の張力は水 - 脂質 - 油界面の張力を調整することによって制御することができます。塗装または折り畳まれた二層システムでは適用できない概念。 広く浸透圧調節物質のリリースバルブおよび細菌細胞膜の基本的な要素として知られているMSCLチャンネルは、増加した膜張力17,18に反応します。低浸透性ショックの場合に、いくつかのチャネルは、小さい細胞の膜に存在する19 MASを生成することができSIVE透過性応答は、迅速溶解20から細菌を保存し、イオンおよび小分子を放出します。生物物理学的に、MSCLはよく研究されており、著名なパッチクランプ法21-23を通じて、主に特徴とします。 MSCLのゲーティング機構24,25を説明する信頼性の高い構造モデルは28をモデル化し 、その同族体の結晶構造26,27に基づいており、大規模な実験24,29-31の結果提案されています。 〜の張力下では10mN / mで、膜貫通ヘリックスの緊密な束で構成され、閉じたチャネルは、〜28オングストロームの水で満たされた導電性の孔21,24,32を形成大きく傾いたヘリックスのリングに変身。また、インナーTM1ドメインの交差点に位置する緊密なゲートの疎水性は、チャネル33の活性化閾値を決定することが確立されています。それに応じて、それが判明したゲートの疎水性を減少させることによって、tension個の閾値は、22に低減することができました。 MSCLのこのプロパティは、主に薬物送達のために、様々な制御バルブ34の設計可能にしました。電気生理学的活動に細胞膜過度の緊張を翻訳し、その基本的な役割に基づいて、すべての前述の特性とは、MSCLはDIBの中mechanoelectricalトランスデューサとしてぴったりになります。 この記事では、DIBのを形成し、機械的刺激に基づき設立されたMSCLチャネルの活性を測定するために、元のマイクロピペットベースの方法を提示します。私たちは、初めての機械的刺激とDIBの35でMSCLのV23T低閾値変異体の機能的再構成するのDIBの反応を報告しています。 実験システムは、2つの対向ホウケイ酸ガラスマイクロピペットの先端に固定された脂質包まれた水性液滴で構成されています。液滴が接触するときに脂質二重層インタフェースはFOでありますrmed。この技術は、各液滴（バルク）の化学組成とサイズの制御だけでなく、二層インターフェイスの寸法を提供しています。また、各リーフレットの様々な脂質組成を有する非対称膜を容易に形成することができました。 、高調波圧電アクチュエータに取り付けられたマイクロピペットのいずれかを持つことは、事前にプログラムされたシングルサイクルや振動刺激を適用する機能を提供します。張力はそれをサポートする両方の液滴の圧縮を介して人工膜に送達されます。液滴の変形の結果として、水 - 脂質 - 油界面の増加と同時に液滴との間の角度の領域は、膜張力および過渡MSCLの活性化の増加を引き起こし、減少します。変形中の液滴の形状を分析することによって、界面で作成された張力を推定することができました。この記事の焦点は、DIBのメカノトランスダクションの性質にあるにもかかわらず、我々はまた、バイオの他のタイプを強調例えば、アラメチシンなどの分子は、この多機能プラットフォームによって活性化することができます。我々は、ここでは、準備組み立て、および段階的にこの新しい方法で測定を行うのすべての技術的側面を提示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MSCL、大コンダクタンス機械受容チャネル​​（MSC）は、細菌が急激に低浸透性ショックを乗り切る助けユビキタスオスモライトリリースバルブです。これは、発見され、厳密にはほぼ三十年のためのパッチクランプ法を用いて研究されています。透過性応答に細胞膜の張力を翻訳するその基本的な役割は、人工膜ベースの生体分子デバイスでmechanoelectrical変換器として機能する有力な候補になります。そのようなデバイスのビルディングブロックとして、液滴界面二重層（のDIB）はMSCLチャネルの取り込みおよび刺激のための新たなプラットフォームとして使用することができます。ここでは、のDIBを形成し、組み込まれたMSCLチャネルの活性を測定するためにマイクロピペットベースの方法を記載します。この方法は、二つの対向（同軸上に位置）ホウケイ酸ガラスマイクロピペットの先端に固定された脂質包まれた水性液滴で構成されています。液滴が接触するときに、脂質二重層のインタフェースであります形成されました。この技術は、化学組成と各液滴の大きさだけでなく、二重層界面の大きさを制御しています。高調波圧電アクチュエータに取り付けられたマイクロピペットの1つを有する、所望の振動刺激を送達する能力を提供します。変形中の液滴の形状を解析して、界面で作成張力を推定することができます。この技術を使用して、DIBシステム内のMsClチャネルの最初の活性が報告されています。 MSチャンネルに加えて、チャネルの他の種類の活動が、このプラットフォームの多機能性を証明し、この方法を用いて研究することができます。ここで紹介する方法は、基本的な膜特性の測定を可能に対称および非対称膜の形成をより細かく制御を提供し、刺激し、機械受容チャネル​​を研究する別の方法です。

図1及び脂質二重膜の機械的刺激の過程でタンパク質活性を記録するために2ディスプレイ実験および機器を使用しました。我々の測定に電気的なノイズを最小限に抑えるため、ワークステーションは、ラボ製ファラデーケージ内に配置され、AxoPatch 200 Bアンプのアース接続に接地されています。 安定した絶縁脂質二重層の形成は、この研究の重要なステップです。この構成では、脂質単層は、有機溶剤の浴に浸漬水性液滴の油/水界面で組み立てます。液滴が接触するように配置されると、余分な油を排除し、2つの分子の厚さの脂質二重層に対向する脂質単分子層が薄くされます。二層の特性評価に使用される最も一般的な手法は、電圧クランプです。電流を測定しながら、電圧クランプを用いて、二重層の両端の電圧を一定値に維持される。 図4 </stronG&gt;は、最初の二層形成の典型的なリアルタイムの現在の記録を描いています。 DPhPC脂質二重層の比容量（〜0.6μF/ cm 2）を5知ること、形成された二層の面積を算出することができます。二重層の領域は、液滴（ 図4A）の位置を変えることによって制御することができます。圧電アクチュエータを使用して、異なる周波数、振幅およびデューティサイクルの波形（正弦波、方形、三角形、 等 ）の異なるタイプが水平の液滴に適用され、軸方向にそれらを振動、したがって、二重層の張力及び面積を変更することができることができ（ 図4B）。 DIBを機械的に刺激されると、膜を横切る一定のDC電位を維持しながら、MSCLの低しきい値（機能獲得）V23T変異体は、主にサブ導通状態と時折フルオープンイベントを含む信頼性の高い活動を生成する（ 図5） 。これらのEVエントは、精製V23T MSCLで再構成し、無傷の内側大腸菌膜及びリポソームからのパッチクランプ法を用いて記録したものと同じです。 図5の結果は、ゲーティングを証明するすべての電流スパイクがピーク圧縮で観察されているので、張力の増加に応じて発生します。ピーク圧縮では、液滴の相対面積の拡大が最大であるため、界面での張力が最大です。 DC電圧は、膜36を横切って印加されたときアラメチシン、電位依存性イオンチャネルであり、最も研究されたペプチドの一つは、膜透過性を増加させます。膜貫通タンパク質およびペプチドをホストする脂質二重層界面の能力もアラメチシンペプチドを用いた電圧 - ゲート電流の記録を行うことによりテストされます。アラメチシンは、100ng / mlの最終濃度にリン脂質溶液と混合される。 図6は、下の電流測定値を示しています<html>電圧クランプ（115 MV）。この実験では、小滴二層インターフェイスとより高い抵抗とより小さな静電容量を達成するために、引き離されています。アラメチシンペプチドのゲーティング動作は、現在の（ 図6）の離散的なステップを通して示されています。プロットの右側のヒストグラムは、基本的には、チャネル自体の最初のコンダクタンスレベルである基準レベル（0.0962 NS）から、コンダクタンスの変化を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> 図1：メイン部品やオイルリザーバの寸法を説明する模式オイルリザーバーはバージニア工科大学の機械工場で製造されています。これは、アクリル板の表面に接着し、機械加工、円筒状のアクリルの管で構成されています。寸法および設計は、異なるアプリケーションまたは二つ以上のマイクロピペットを収容するように修正することができます。/53362/53362fig1large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> 図2：実験セットアップとマイクロピペットの調製（A）を形成するための標準的なワークステーション、機械的刺激、及び界面二重層を特徴付けることは、顕微鏡、3軸マニピュレータ、デジタルカメラ、圧電発振器、除振台、ファラデーケージを含みます。 （図示せず）。 （B）実験は、水平ヘキサデカン油浴内に配置された2つの対向PEG-DMAヒドロゲル満たさマイクロピペットで構成されています。マイクロピペットの各々は、電気的接続を提供するためのAg / AgCl電極を含んでいます。プロテオリポソー​​ム溶液で満たされた第三のマイクロピペットは、他のマイクロピペットの先端で液滴を形成するために使用されます。 （C）DIB電流応答を測定することができますパッチ増幅器及び低雑音データ収集システムの組み合わせを使用して。 （D）Aは、マイクロピペットの先端に形成された水性液滴を示す写真をクローズアップ。 （E）のAg / AgCl電極は、漂白剤二つ250μmの銀ワイヤの先端を浸漬することによりなされます。電極はその後固化するUV光で硬化されるPEG-DMAのヒドロゲルで充填された2つのホウケイ酸ガラスキャピラリーを介して供給されます。オスコネクタストレート微小電極ホルダーはパッチ増幅器のヘッドステージにマイクロピペットのいずれかを接続するために使用されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> 図3：液滴界面二重層の形成を示す写真（A）プロテオリポソームを充填した10μmのマイクロピペットは、マイクロピペット先端に近接する、顕微鏡の下に配置されています。マイクロピペットに接続された注射器を使用して、小容量を分配プロテオリポソー​​ムの所望の体積の球状液滴を形成します。液滴は10分間座ってできるようにすることで、単層の形をしてみましょう。接触液滴をもたらします。界面でのすべての油が除去された後、二重層が形成されます。 （B）二重層が形成されているが、界面の両側の化学組成は、マイクロサイズのマイクロピペットを使用して所望の化学物質を注入することによって制御することができます。 （C）最初の接触の瞬間に液滴。 （D）脂質二重層が形成された液滴。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> 図4：リアルタイム測定値は初期間伐やインタフェースのその後の展開の両方を示し、（A）電流は、三角形の電位のアプリケーションを介して二層形成の過程で測定しました。測定された電流の大きさはCapaciのに正比例していますタンス、したがって、二重層界面の面積。インタフェース、およびその逆の面積より大きく、液滴が一緒にされる近づきます。機械的励起を印加する（B）は 、二重層界面の面積が増加し、刺激信号と同じ周波数で減少します。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> 図5：リアルタイム測定は、機械的励起に二重層の応答だけでなく、MSCLのV23T変異体のゲーティングを示す電流応答の形状は、結果として二重層容量の正弦波変化に関係する、正弦波です。二層の面積変化。電流スパイクは、各サイクルのピーク時に発生する、V23T変異体のサブコンダクタンスゲーティングを示しています。さらに極座標プロットは、二層の界面での緊張の増加を反映して、ゲートがピーク圧縮で生じていることを示しています。 図6：電圧クランプと組み込まれたアラメチシンチャネルのゲーティング活動のためのコンダクタンスレベルの対応するヒストグラムの下の電流測定アラメチシンペプチドのゲーティング動作は、電流の個別の段階的増加によって示されています。コンダクタンスレベルはバージニア工科大学7で私たちの研究グループによって行われる前の測定値と非常によく一致します。

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

細菌機械受容チャネル​​は、生体分子デバイスでmechanoelectricalトランスデューサとして使用することができます。そのようなデバイスへの液滴のインタフェース二重層（DIBを）、セル風のビルディングブロックは、機械受容チャネル​​を組み込むと刺激する新しいプラットフォームを表します。ここでは、機械的な刺激の下で機械受容チャネル​​の研究を可能にする、のDIBを形成する新しいマイクロピペットベースの方法を示しています。

液滴界面二重層中に細菌機械受容イオンチャネルの取り込みおよび刺激のための多機能、マイクロピペットベースの方法

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

Research

JoVE Journal

Biology

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