Name: multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers
Uploaded: 2015-11-19T15:00:00
Duration: 9 min 54 s
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이 책에서보고 된 연구는 과학 연구의 기본 구상을 부여 FA9550-12-1-0464의 공군 사무실에 의해 지원됩니다.

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Mechanosensation는 생물 진화 최초의 감각 전달 경로 중 하나를 의미한다. 공부와 DIB의 전기 - 기계 특성을 이해하는데이 현상을 이용하여, 자극 - 반응 기능성 물질 향해 중요한 단계이다. 그것은 mechanoelectrical 변환기 및 지질 이중층 인터페이스 장력 증가를 검출하는 변형 게이지로서 DIB에 mechanosensitive 채널, 후 MsCl의 결합 및 활성화를 수반한다. 다른 주에, MS 채널의 기능은 두께, 극한 곡률 및 압축성을 포함한 지질 이중층의 기본 물성을 통해 조절 될 수있다. 전술의 관점에서, 마이크로 피펫 기반 기술 연구원 DIB의에서 MS 채널을 연구 및 지질 이중층의 구조뿐만 아니라, 지질 - 단백질 상호 작용에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 능력을 허용하는 유용한 도구를 제공한다. 지난 3 년간 이상들, 패치 클램프는 전압과 긴장 모두의 클램핑을 할 수 있기 때문에, MS 채널을 연구하는 기본 방법이었다. 그러나, 패치 클램프는 부피가 큰 장비 소형화, 감각 및 변환 장치의 설계에 필요한 속성에 대한 적합하지가 ​​필요합니다. 그 단순성과 안정성, 소형화로 인해의 MsCl은 DIB의 활성을 연구하기에 적합한 환경을 나타낸다. 여기서는 액적 및 이중층 인터페이스의 크기, 각각의 방울의 화학 조성 및 동적 자극을 통해 계면 장력을 제어 할 수있는 능력과, 마이크로 피펫 기반 기술을 제안하여 DIB 형성 기법 이전 진보를 연장한다. 기술은 동축 유리 모세관 대향 팁, 테오 함유 수성 액 적을 고정 이루어져있다. 접촉 계면에서의 지질 이중층을 형성하게 할 때, 유기 용제 액의 욕조에 넣고있다. P는 마이크로 피펫에 부착된다방울의 수평 변위를 허용 iezoelectric 발진기. 동적 물 오일 계면에서 계면 장력의 증가에 따라서 이중층 장력의 증가 방울 결과를 압축. 두 가지 주요 측면은 유사과 최근 발표 된 연락처 거품 이중층 (CBB) 기술 (37)에서이 방법을 차별화. 여기에 제공된 기술을 사용하여, 이중층의 크기가 미세 조작기를 이용하여 제어되고, 이에 따라 액 적의 볼륨 CBB 방법에서와 달리, 일정하게 유지. 또한, CBB 기술은 단순하고 구축하기 쉬워 본 논문에서 제시된 방법에서 필요하지 않은 가압 펌프를 요구한다. 우리는 통합 및 패치 피펫 또는 화학적 변형 (38)의 사용없이 처음 세균성 후 MsCl을 자극 할 수있다. 시스템은 강력한 지질 이중층 비대칭 막의 형성을 용이하게하므로,보다 밀접 L을 모방생물 세포막에서 발견 IPID 비대칭. 이것의 MsCl 활동 제어 막 조성물 또는 비대칭의 효과를 연구하기 위해있게 해준다. 또한, 화상 처리 기술을 통해,이 방법은 이중층 계면 장력을 추정 할 수 있습니다. DIB에서 벌크 및 표면 세력 사이의 상호의 원리를 이해하는데이 기술 어시스트, 기본적인 막 특성의 측정을 용이하게하고, 긴장을 막 후 MsCl 응답의 이해를 향상시킨다. 이 방법은 후 MsCl을 연구 걸음 더 가까이 생체 분자 자극 - 반응 물질 시스템을 향한와 다른 생리 학적 환경에 우리가 걸립니다 만, 시스템에 대한 제한 사항이 있습니다. 이 시스템에서의 장력으로 인해 오일 / 물 계면 장력을 완화하는 경향이 각 액적에서 리포좀 형태의 지질 저장소의 존재에 클램프 될 수 없다. 따라서, 현재의 mechanosensitive 채널에서 자극 할 수있다단지 동적 정권에서 DIB의에. 시스템에서의 기포의 존재는 상당히 실험의 정밀도 및 재현성에 영향을 준다. 하이드로 겔에 존재하는 기포는 전기 연결의 경우 손실이 발생할 수 있습니다. 우리의 MsCl 자극 마이크로 피펫 기반 방법의 사용을 설명하지만,이 기술은 MS 채널들의 다른 유형을 연구하기 위해 사용되며, 생체 분자의 다양한 연구하는 연구자에 의해 사용될 수있는 잠재력을 보유 할 수있다. 예를 들어, 유사한 설정이없는 채널 액적 인터페이스 이중층 막의 mechanoelectrical 반응을 연구하기 위해 실험에 사용되었다. 다양한 단백질을 재구성하고 각 생체 분자의 재구성 환경 변화를 고려하여 복용이 높은 제어 설정을 사용하여 활성화 할 수있다. 이 문서에서 설명하는 방법은 연구자의 상상력에 제한되어 상당히 넓은 응용 가능성에 감동.

지난 10 년간, 인공 지질 이중층의 조립체는 실질적 액적 인터페이스 이중층 방법의 개발로 발전되고있다. 안정적이고 견고한로 알려진, DIB의은 (뮐러) 그린 고전 접혀 (Montal - 뮐러) 평면 이중층 1 대안 모델 시스템으로 자신을 부과했다. 지질 이중층을 만드는 방울을 사용하는 개념은 1960 년대로 거슬러 2 있지만, 최근까지 인기를 얻고 않았다. 최초의 성공적인 시도는 베일리 그룹 4-6에 의해 소적의 네트워크를 사용하는 이중층의 형성을 보여주는 여러 연구 하였다 Takeushi 군 (3)에 의해보고되었다. 보다 최근에는, 밀봉 기술은 새로운 자극에 반응하는 물질 시스템 (10)의 빌딩 블록으로 DIB의 사용의 개념을 개척 레오 그룹 7-9에 의해 제안되었다. 이전 연구에서, DIB의 전기 9,11, 화학 반응 할 수있는 능력을 입증10, 12의 iCal, 광 자극 (13). DIB 10, 14에서 재구성 할 때 다른 자극에 반응하는 기능을 가진 다양한 생체 분자를 효과적으로 자극하고있다. 중요한 문제가 발생이 성공적인 시도에 비추어 : 기계적인 자극에 DIB의 응답이 때 적절한 생체 분자가 포함되어 있을까? DIB에 작용하는 계면 힘은 다른 이중층 시스템 (15, 16)과 다를. 따라서, 액적 보유한 이중층에 장력 물 지질 오일 계면 장력을 조절함으로써 제어 될 수있다; 페인트 또는 접힌 이중층 시스템에 적용 할 수없는 개념입니다. 널리 osmolyte 릴리스 밸브와 세균의 세포질 막의 기본 요소로 알려진 후 MsCl 채널은, 증가 된 장력 막 (17, 18)에 반응한다. 하이포 삼투압 충격의 경우에, 여러 개의 채널이 작은 셀에 존재하는 막 (19)을 생성 할 수 MAS시브 투과성 반응은 신속하게 용해 (20) 박테리아를 저장, 이온과 작은 분자를 분리합니다. Biophysically, 후 MsCl 잘 연구하고 눈에 띄는 패치 클램프 기법 21-23을 통해 주로 특징. 후 MsCl의 게이팅 메커니즘 (24, 25)을 설명하는 신뢰할 수있는 구조 모델의 동체의 크리스탈 (28) 모델링 구조 26, 27, 및 광범위한 실험 24,29-31의 결과를 바탕으로 제안되고있다. ~의 적용 긴장에서 10 mN의 / M, 횡단 나선의 꽉 번들로 구성되어 닫힌 채널은 ~ (28)의 물이 채워진 도전 기공 21,24,32를 형성 크게 기울어 나선의 고리로 변환합니다. 또한 내측 TM1 도메인의 교차점에 위치하는 게이트 타이트의 소수성은, 채널 (33)의 작동 임계 값을 결정하는 것으로 확립되어있다. 이에 대응하여, 그 발견 된 해당 게이트의 소수성을 감소시킴으로써, 장력N 임계 값 (22)을 낮게 할 수있다. 의 MsCl이 속성은 주로 약물 전달을 위해, 다양한 제어 밸브 (34)의 설계 가능. 모든 전술 특성 및 전기 생리 활동에 세포막 과도한 긴장을 번역하는 근본적인 역할에 따라, 후 MsCl는 DIB의에서 mechanoelectrical 변환기로 좋은 착용감을합니다. 이 글에서, 우리는 기계적인 자극에서 통합 후 MsCl 채널의 활동을 DIB의 형성 및 측정하는 원래의 마이크로 피펫 기반 방법을 제시한다. 우리는 처음과 DIB의 기계적 자극 (35)의 MsCl V23T 낮은 임계 변이체의 기능적 재구성 DIB의 행의 응답을보고한다. 실험 시스템은 두 개의 반대 붕규산 유리 마이크로 피펫의 팁에 고정 지질 쌌다 수성 방울로 구성되어 있습니다. 물방울이 접촉 될 때 지질 이중층 인터페이스는 fo를 인rmed. 이 기법은 각각의 액적 (벌크)의 화학 조성과 크기를 제어 할뿐만 아니라, 이중층 인터페이스의 치수를 제공한다. 또한, 각 전단 각종 지질 조성물 비대칭 막을 용이하게 형성 할 수있다. 고조파 압전 액츄에이터에 연결된 마이크로 피펫 중 하나를 갖는 미리 프로그래밍 된 단일 사이클 또는 진동 자극을 적용 할 수있는 능력을 제공한다. 장력을지지 두 방울의 압축을 통해 인공 막에 전달된다. 액적 변형의 결과로, 수분 - 지질 오일 인터페이스 증가와 동시에 물방울이 이루는 각의 영역은 막의 장력 과도 후 MsCl 활성의 증가를 초래 감소한다. 변형 동안 방울의 형상을 분석 한 결과, 계면에서 생성 된 장력을 추정 할 수있다. 이 문서의 초점은 DIB의 메카 - 전달 특성에 비록, 우리는 또한 강조 다른 종류의 바이오이러한 alamethicin 같은 분자는이 다기능 플랫폼에 의해 활성화 될 수있다. 우리는, 제조, 조립, 및 단계적인 방식으로이 새로운 방법으로 측정을 모든 기술적, 여기에 제시한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

후 MsCl는 큰 전도도 mechanosensitive 채널 (MSC)는 박테리아가 갑작 저자 삼투 충격을 생존하는 데 도움이되는 유비쿼터스 osmolyte 릴리스 밸브입니다. 그것은 발견 엄격 거의 30 년 동안 패치 - 클램프 기술을 이용하여 연구되었다. 투자율 응답으로 세포막에인가 장력 번역 기본적인 역할은 인공 막 기반 장치에 생체 분자 mechanoelectrical 변환기 역할을 유력하게. 이러한 장치에 빌딩 블록으로서, 액적 인터페이스 이중층 (DIB의)는 후 MsCl 채널의 혼입 및 자극 새로운 플랫폼으로 사용될 수있다. 여기서는 인용 후 MsCl 채널의 활성을 DIB의 형성과 측정 마이크로 피펫 기반 방법을 설명한다. 이 방법은 두 상대 (동축 위치) 붕규산 유리 마이크로 피펫의 팁에 고정 지질 쌌다 수성 방울로 구성되어 있습니다. 물방울이 접촉 될 때, 지질 이중층 인터페이스이다형성했다. 이러한 기술은 화학 성분과 각각의 액적 크기를 제어 할뿐만 아니라, 이중층 인터페이스의 크기를 제공한다. 고조파 압전 액츄에이터에 연결된 마이크로 피펫 중 하나를 갖는 원하는 진동 자극을 전달하는 기능을 제공한다. 변형 동안 방울의 형상을 분석 한 결과, 계면에서 생성 된 장력을 추정 할 수있다. 이 기술을 사용하여, DIB 시스템 후 MsCl 채널들의 제 활성이보고되어있다. MS 채널 외에 채널의 다른 유형의 활동이 플랫폼의 다중 기능을 증명하는,이 방법을 이용하여 연구 할 수있다. 여기에 제시된 방법은, 기본 막 특성의 측정을 가능하게 대칭 및 비대칭 막의 형성을 통해 더 큰 제어를 제공하고, 자극 mechanosensitive 채널을 연구하는 또 다른 방법이다.

도 1 및 지질 이중층 막의 기계적 자극의 과정에서 단백질 활성을 기록하는 2 디스플레이 실험 장치 및 장비를 사용 하였다. 우리의 측정에 전기 노이즈를 최소화하기 위해, 워크 스테이션이 실험실 만든 패러데이 케이지 내에 배치되고, AxoPatch 200 B 앰프의 접지 연결에 접지. 안정적인 절연 지질 이중층의 형성은이 연구에서 핵심적인 단계이다. 이러한 구성에서, 지질 단층은 유기 용매 조에 침지 수성 액적 오일 / 물 계면에서 조립. 물방울이 접촉하여 배치되는 경우, 과량의 오일을 제거하고, 두 분자 두께의 지질 이중층에 대향 지질 단층 얇다. 이중층 특성화에 사용되는 가장 일반적인 방법은 전압 클램프이다. 전류를 측정하면서, 전압 클램프, 이중층 양단의 전압은 일정한 값으로 유지된다.도 4 </strong&gt; 초기 이중층 형성의 전형적인 실시간 현재 녹화를 그렸다. 특정 용량 (~ 0.6 μF / cm 2) DPhPC 지질 이중층 5를 알면, 이중층의 형성 영역을 산출 할 수있다. 이중층 영역 방울 (도 4A)의 위치를 변화시킴으로써 제어 될 수있다. 압전 액츄에이터를 이용하여, 상이한 주파수, 진폭과 듀티 사이클에서의 파형 (정현파, 사각형, 삼각형, 등.)의 종류가 가로로 물방울인가 축 방향 그들을 진동하므로, 이중층 장력 영역은 변경 될 수 될 수있다 (그림 4B). DIB 기계적 자극되면 막을 가로 질러 일정한 DC 전위를 유지하면서,의 MsCl 낮은 임계 (기능 획득) V23T 돌연변이는 주로 서브 도전 상태와 때때로 전체 개방 이벤트를 포함하여 안정적인 작업을 생성한다 (도 5) . 이 EV엔트는 정제 후 MsCl V23T으로 재구성 그대로 내부 대장균 및 리포좀 막에서 패치 - 클램프 기술을 이용하여 기록 된 것과 동일하다. 도 5의 결과는 모든 전류 스파이크가 압축 피크에서 관측되기 때문에 그 게이트는, 장력의 증가에 반응하여 발생 증명. 최대 압축에, 물방울의 상대 면적 확대가 최대이므로, 계면 장력은 최대이다. DC 전압이 막 (36)을 가로 질러인가 될 때 Alamethicin, 전압 관문 이온 채널과 가장 공부 펩티드 중 하나는, 세포막 투과성을 증가시킨다. 막 횡단 단백질 및 펩티드를 호스트 지질 이중층 인터페이스의 능력은 또한 펩티드 alamethicin 사용 전압 게이팅 현재 녹화를 수행함으로써 테스트된다. Alamethicin 100 NG / ml의 최종 농도 인지질 용액과 혼합된다. (6)는 아래에 전류 측정을 보여준다<html> 전압 클램프 (115 MV). 이 실험에서 작은 방울 이중층 인터페이스 따라서 더 높은 저항 및 더 작은 커패시턴스를 달성하기 위해 이격 당겨진다. Alamethicin 펩타이드의 게이팅 동작 전류 (그림 6)의 분리 단계를 통해 표시됩니다. 플롯의 우측의 막대 그래프는 기본적 채널 자체의 제 컨덕턴스 레벨 인 기준 레벨 (0.0962하고 nS)의 컨덕턴스 변화를 나타낸다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> 그림 1. 주요 부품, 오일 저장소의 크기를 설명하기위한 개략 오일 리저 버지니아 테크 기계 공장에서 제조된다. 그것은 아크릴 시트의 표면에 접착 가공 원통형 아크릴 튜브로 구성되어 있습니다. 치수 및 디자인은 다른 응용 프로그램 또는 두 개 이상의 마이크로 피펫을 수용하도록 변경 될 수있다./53362/53362fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> 그림 2. 실험 장치 및 마이크로 피펫 제조 (A) 기계적으로 형성하는 자극과 인터페이스 이중층을 특성화 표준 워크 스테이션 현미경, 3 축 매니퓰레이터, 디지털 카메라, 압전 진동자, 방진 테이블 및 패러데이 케이지를 포함 (도시되지 않음). (나) 실험 장치는 수평 헥사 데칸 오일 목욕 내에 위치이 반대 PEG-DMA 하이드로 겔 충전 가능한 Micropipette로 구성되어 있습니다. 마이크로 피펫의 각각은 전기적인 접속을 제공하는 Ag / AgCl 전극 포함. proteoliposome 용액으로 채워진 마이크로 피펫 셋째는 다른 마이크로 피펫의 선단에 액 적을 형성하기 위해 사용된다. (C) DIB 전류 반응을 측정 할 수 있었다패치 증폭기 및 저잡음 데이터 획득 시스템의 조합을 사용. (D)는 마이크로 피펫의 끝 부분에 형성된 수성 방울을 보여주는 그림을 마감했다. (E)의 Ag / AgCl을 전극에 표백제 개의 250 ㎛의은 와이어의 선단을 침지하여 제조된다. 전극은 고화 UV 광 경화 PEG-DMA 하이드로 겔로 충전 두 보로 실리케이트 유리 모세관을 통해 공급된다. 남성 커넥터 직선 미세 전극 홀더는 패치 증폭기의 headstage에 가능한 Micropipette 중 하나에 연결하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> 도 3 :. 액적 인터페이스 이중층의 형성을 도시하는 이미지 (A) 테오 가득 10 μm의 마이크로 피펫을 마이크로 피펫 팁 부근의 현미경으로 위치된다. 마이크로 피펫에 연결된 주사기를 사용하여, 작은 양을 분배테오의 원하는 볼륨으로 구형의 물방울을 형성한다. 방울 10 분 동안 앉아있을 수 있도록하여 단층 양식을 보자. 접촉에 방울을 가져; 계면에서의 모든 오일이 제거 된 후에는 이중층 형성 할 것이다. 이중층이 형성되어 있지만, 인터페이스의 양측 화학 성분은 마이크로 사이즈의 마이크로 피펫을 이용하여, 원하는 약품 주입에 의해 제어 될 수있다 (B). (C) 제의 접촉 순간 방울. (D) 지질 이중층을 형성 방울. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> 도 4 : 실시간 측정은 초기 씨닝 및 인터페이스의 후속 팽창 모두 표시 삼각 전위의인가를 통해 이중층의 형성 과정에서 측정 (A)를 현재.. 측정 된 전류의 크기 capaci 정비례tance 및 이중층 인터페이스 따라서 영역. 인터페이스와 그 반대의 지역 더 큰, 작은 물방울이 함께하게된다 가까이. 기계적 자극인가시 (B)는, 이중층 계면의 면적이 증가하고, 자극 신호와 동일한 주파수에서 감소한다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> 도 5 :. 실시간 측정은 기계적 자극에 이중층의 응답뿐만 아니라의 MsCl V23T 변이체 게이팅 표시 전류 응답의 형상의 결과로서 이중층 커패시턴스에 정현파 변화에 관한 것으로, 이는 사인파 이중층 지역 변경. 전류 스파이크는, 각 사이클의 피크에서 발생, V23T 돌연변이의 하위 전도 게이팅을 나타냅니다. 상기 극성 플롯 게이팅 이중층 계면 장력의 증가를 반영하는 피크 압축 발생 것을 나타낸다. 그림 6 :. 전압 클램프 및 통합 Alamethicin 채널의 게이팅 활동에 대한 전도도 수준의 대응 히스토그램에서 전류 측정 Alamethicin 펩타이드의 게이팅 동작 전류의 이산 단계적인 증가를 통해 표시됩니다. 전도 수준은 버지니아 공대 7에서 우리의 연구 그룹에 의해 수행 이전의 측정과 매우 잘 일치합니다.

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Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

세균 mechanosensitive 채널은 생체 분자 장치에서 mechanoelectrical 트랜스 듀서로 사용할 수 있습니다. 물방울 인터페이스 이중층 (DIB의), 이러한 장치에 휴대 영감 빌딩 블록, 통합 및 mechanosensitive 채널을 자극하는 새로운 플랫폼을 나타냅니다. 여기서 우리는, DIB의 형성 기계적인 자극에서 mechanosensitive 채널의 연구를 허용하는 새로운 마이크로 피펫 기반 방법을 보여줍니다.

다기능, 물방울 인터페이스 이중층에서 세균 Mechanosensitive 이온 채널의 설립과 자극에 대한 방법을 마이크로 피펫 기반

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