Name: multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers
Uploaded: 2015-11-19T15:00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Forskning rapportert i denne publikasjonen er støttet av Air Force Office of Scientific Research Basic Initiative Grant FA9550-12-1-0464.

<ol>
	<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties.">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).</li><li>Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+bimolecular+protein-lipid+membranes+in+aqueous+solution.">Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution.</a> Nature. , (1966).</li><li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Bilayer+Formation+by+Contacting+Monolayers+in+a+Microfluidic+Device+for+Membrane+Protein+Analysis.">Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis.</a> ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).</li><li>Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+bionetworks+from+nanoliter+water+droplets.">Functional bionetworks from nanoliter water droplets.</a> J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Maglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+networks+with+incorporated+protein+diodes+show+collective+properties.">Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties.</a> Nat Nano. 4, 437-440 (2009).</li><li>Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+formation+between+lipid-encased+hydrogels+contained+in+solid+substrates.">Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates.</a> ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+attachment+method+for+reconstituting+lipid+bilayers+of+prescribed+size+within+flexible+substrates.">Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates.</a> ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-based+biomolecular+smart+materials.">Membrane-based biomolecular smart materials.</a> SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+virtual+ground+to+control+transmembrane+voltages+and+measure+bilayer+currents+in+serial+arrays+of+droplet+interface+bilayers.">The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers.</a> SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-inspired+electroactive+polymer+materials+incorporating+biomolecular+materials.">Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials.</a> SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Bayley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayers.">Droplet interface bilayers.</a> MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+torus+surrounding+planar+lipid+bilayer+membranes.">Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes.</a> BIOPHYS J. 12, 432 (1972).</li><li>Tien, H. T., Ottova, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+bilayer+concept+and+its+experimental+realization:+from+soap+bubbles,+kitchen+sink,+to+bilayer+lipid+membranes.">The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes.</a> J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).</li><li>Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+prokaryotic+mechanosensitive+channels.">Gating prokaryotic mechanosensitive channels.</a> NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).</li><li>Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+channels+in+microbes.">Mechanosensitive channels in microbes.</a> ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+census+of+mechanosensitive+channels+in+living+bacteria.">Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria.</a> PLoS ONE. 7, e33077 (2012).</li><li>Levina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+Escherichia+coli+cells+against+extreme+turgor+by+activation+of+MscS+and+MscL+mechanosensitive+channels:+identification+of+genes+required+for+MscS+activity.">Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity.</a> The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).</li><li>Chiang, C. -. S., Anishkin, A., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+the+large+mechanosensitive+channel+in+situ:+estimation+of+the+spatial+scale+of+the+transition+from+channel+population+responses.">Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses.</a> BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).</li><li>Anishkin, A., Chiang, C. -. S., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+reveal+expanded+intermediate+states+and+a+sequential+action+of+two+gates+in+MscL.">Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).</li><li>Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetic+and+Spatial+Parameters+for+Gating+of+the+Bacterial+Large+Conductance+Mechanosensitive+Channel,+MscL.">Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).</li><li>Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+investigation+of+MscL+gating+using+experimental+data+and+coarse+grained+MD+simulations.">Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations.</a> PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).</li><li>Kubalski, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. , (2005).</li><li>Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+MscL+homolog+from+Mycobacterium+tuberculosis:+a+gated+mechanosensitive+ion+channel.">Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel.</a> Science. 282, 2220-2226 (1998).</li><li>Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+prokaryotic+mechanosensitive+channels+MscL+and+MscS.">Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS.</a> Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).</li><li>Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+models+of+the+MscL+gating+mechanism.">Structural models of the MscL gating mechanism.</a> BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).</li><li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels.">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li><li>Betanzos, M., Chiang, C. -. S., Guy, H. R., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+iris-like+expansion+of+a+mechanosensitive+channel+protein+induced+by+membrane+tension.">A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension.</a> NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).</li><li>Corry, B., Jayatilaka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+structure,+orientation,+and+energy+transfer+between+AlexaFluor+molecules+attached+to+MscL.">Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL.</a> BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+FRET+Reveals+Pore+Size+and+Opening+Mechanism+of+MscL.">Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL.</a> eLife. 3, e01834 (2014).</li><li>Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydration+properties+of+mechanosensitive+channel+pores+define+the+energetics+of+gating.">Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating.</a> J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).</li><li>Ko&#231;er, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+voltage-gated+ion+channel+model+inferred+from+the+crystal+structure+of+alamethicin+at+1.5-&#8491;+resolution.">A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-&#8491; resolution.</a> Nature. 300, 325-330 (1982).</li><li>Iwamoto, M., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+Bubble+Bilayers+with+Flush+Drainage.">Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Barriga, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayer+reconstitution+and+activity+measurement+of+the+mechanosensitive+channel+of+large+conductance+from+Escherichia+coli.">Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli.</a> J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Mechanosensation betegner en av de første sensoriske overføringsveier som utviklet seg i levende organismer. Ved hjelp av dette fenomenet for å studere og forstå Mekano-elektriske egenskapene til DIB, er et avgjørende skritt mot funksjonelle stimuli-responsive materialer. Det innebærer inkorporering og aktivering av en mechanosensitive kanal, MsCl, i DIB som en mechanoelectrical transduser, og en strekkmåler for å detektere spenning økning i lipid bilaget grensesnittet. På et annet merke, kan funksjonen av MS kanaler reguleres gjennom de grunnleggende materialegenskaper lipiddobbeltlag inkludert tykkelse, egenverdi kurvatur, og kompressibilitet. I lys av ovennevnte, tilveiebringer mikropipette basert teknikk et verdifullt verktøy slik at forskeren evnen til å studere MS kanaler i Dibs og gir innsikt i strukturen i det ytre lipid bilaget, samt lipid-protein interaksjoner. Over de siste tre tiårs, patch-clamp var den primære metode for å studere MS kanaler, da den tillater fastklemming av både spenning og strekk. Men patch-clamp krever noe utstyr og ikke egnet for miniatyrisering, en egenskap som kreves for prosjektering av sensoriske og konvertering enheter. Dibs på grunn av sin enkelhet, stabilitet og kompakthet representerer et egnet miljø for å undersøke aktiviteten av MsCl. Her har vi utvider tidligere fremskritt i DIB-dannelsesteknikker ved å foreslå en mikropipette basert teknikk, med muligheten til å kontrollere størrelsen på dråpene og bilaget grensesnitt, den kjemiske sammensetningen av hver dråpe, og spenningen ved grenseflaten gjennom dynamisk stimulering. Teknikken består av forankring vanndråper, som inneholder proteoliposomes, til tuppen av koaksielt motstridende glasskapillærer. Dråpene blir plassert i et bad av organisk løsningsmiddel, og når de bringes i kontakt med et lipidbilag dannes i grenseflaten. De mikropipetter er festet til piezoelectric oscillatorer, slik at horisontal forskyvning av dråpene. Dynamisk komprimering av dråpene, resulterer i en økning av grenseflatespenningen i vannet oljeovergangen, og derfor en økning i dobbeltlaget spenning. To viktige aspekter skille denne metoden fra lignende og nylig publisert kontakt boble bilaget (CBB) teknikk 37. Ved å bruke den teknikk som presenteres her, er størrelsen av bilaget styres ved hjelp micromanipulators og dermed volumet av dråpene forblir konstant, i motsetning til i CBB metoden. I tillegg krever den CBB teknikk for trykkpumper, som ikke er nødvendig i metoden som presenteres i denne artikkelen å gjøre det enklere og enklere å bygge. Vi er i stand til å innlemme og stimulere bakteriell MsCl for første gang, uten bruk av en patch pipette eller kjemiske modifikasjoner 38. Siden systemet letter dannelsen av robuste asymmetriske lipidbllag membraner, nærmere etterligner det lipid asymmetri i biologiske membraner. Dette gir oss muligheten til å studere effekter av kontrollert membran sammensetning eller asymmetri på aktiviteten til MsCl. I tillegg, gjennom bildebehandlingsteknikker, denne fremgangsmåten bidrar til å estimere spenningen på bilaget grensesnittet. Denne teknikken hjelper til å forstå prinsippene for interconversion mellom bulk og overflatekrefter i DIB, letter målinger av grunnleggende egenskapene membran, og bedrer forståelsen av MsCl respons til membran spenning. Selv om denne metoden tar oss et skritt nærmere mot en biomolekylære stimuli-reagerende materiale og system til et annet fysiologisk miljø for å studere MsCl, er det begrensninger i systemet. Spenning i dette systemet ikke kan klemmes fast på grunn av tilstedeværelse av lipid-reservoaret i form av liposomer i hver dråpe, som har en tendens til å avlaste spenninger ved olje / vann-grenseflaten. Derfor, i dag mechanosensitive kanaler kan stimuleresi Dibs bare i en dynamisk regime. Tilstedeværelsen av luftbobler i systemet i betydelig grad påvirker den presisjon og reproduserbarhet av forsøkene. Luftbobler som er tilstede i hydrogelene kan medføre tap hvis elektrisk forbindelse. Mens vi beskriver bruken av mikro pipette basert metode for stimulering av MsCl, kan den teknikk som brukes til å studere andre typer av MS-kanaler, og har potensiale til å bli brukt av forskere for å studere en rekke biomolekyler. For eksempel har lignende oppsett vært brukt i vårt laboratorium for å studere mechanoelectrical responsen for en kanal-fri dråpe grensesnitt dobbeltlag-membranen. Ulike proteiner kan bli rekonstruert og aktiveres ved hjelp av denne svært kontrollert oppsett, tar i betraktning at rekonstitusjonstiden miljøer i hver biomolekyl variere. Metoden som beskrives i denne artikkelen berører et betydelig bredere anvendelsespotensial som er bare begrenset til fantasien av forskeren.

I det siste tiåret har monteringen av kunstige lipidbilag blitt vesentlig avanserte gjennom utviklingen av dråpe grensesnittet bilaget metoden. Kjent som stabil og robust, pålegges DIBS seg som alternative modellsystemer til den klassiske malt (Mueller) og foldet (Montal-Mueller) planar bilag 1. Selv om ideen om å bruke dråper å skape lipidbilag dateres tilbake til 1960-tallet 2, har det ikke fått popularitet inntil nylig. Den første vellykkede forsøk ble rapportert av Takeushi gruppe 3, etterfulgt av flere studier som viser bilagsdannelse ved hjelp av et nettverk av små dråper av Bayley gruppe 4-6. Mer nylig ble innkapslingsteknikker foreslått av Leo gruppe 7-9, som var en pioner konseptet med å bruke DIBS som byggeklosser av nye stimuli-responsive materielle systemer 10. I tidligere studier har DIBS bevist sin evne til å svare på elektrisk 9,11, chemical 10,12, og optisk stimuli 13. Ulike biomolekyler med ulike stimuli-responsive funksjoner har blitt effektivt stimulert når tilberedt i DIB 10,14. I lys av disse vellykkede forsøk et viktig spørsmål blir reist: kunne DIB reagerer på mekanisk stimulans når egnede biomolekyler er innarbeidet? Grenseflate krefter som virker på en DIB forskjellige fra de i andre dobbeltlag system 15,16. Derfor kan spenningen i bilaget holdt av dråpene reguleres ved å regulere spenningen på vann-lipid-oljegrenseflater; et konsept ikke aktuelt med malte eller brettet bilags systemer. MsCl kanaler, viden kjent som osmolyte slipper ventiler og grunnleggende elementer av bakteriell cytoplasmamembranen, reagerer på økt membran spenning 17,18. I tilfelle av hypo-osmotiske sjokk, flere kanaler bosatt i membranen av en liten celle 19 kan generere en massive permeabilitet respons til raskt frigjøre ioner og små molekyler, sparer bakterier fra lyse 20. Biophysically, MsCl er godt studert og karakterisert primært gjennom fremtredende patch clamp teknikken 21-23. Pålitelige strukturelle modeller som forklarer MsCl sin portmekanisme 24,25 foreslås basert på sin homolog krystallstruktur 26,27, modellering 28, og resultatene av omfattende eksperimentering 24,29-31. I henhold til en påført spenning på ~ 10 mN / m, lukket kanal, som består av en tett bunt av transmembran-helikser, transformeres inn i en ring av sterkt vinklet helikser som danner en ~ 28 en vannfylt pore ledende 21,24,32. Det er også blitt fastslått at hydrofobisiteten til tett port, plassert i skjæringspunktet mellom de indre TM1 domenene, bestemmer aktivering terskelen av kanalen 33. Tilsvarende ble det funnet at ved å redusere hydrofobisiteten av porten, den tension terskel kunne senkes 22. Denne egenskapen av MsCl gjort mulig utforming av forskjellige styrbare ventiler 34, primært for medikamentleverings formål. For alle de nevnte egenskapene, og basert på sin grunnleggende rolle sette cellemembranen dreven spenninger i elektrovirksomhet, gjør MsCl en flott plass som en mechanoelectrical svinger i Dibs. I denne artikkelen presenterer vi en original mikropipette basert metode for å danne DIBS og måle aktiviteten av de inkorporerte MsCl kanaler under mekanisk stimulering. Vi rapporterer for første gang, responsen fra DIBS til mekanisk stimuli og funksjonell rekonstituering av V23T lavterskel mutant av MsCl i Dibs 35. Den eksperimentelle systemet består av lipid innkapslet vanndråper forankret til tuppen av to motstridende borsilikatglass mikropipetter. Når dråpene bringes i kontakt med en lipid bilag-grensesnitt er foRMED. Denne teknikken gir kontroll over den kjemiske sammensetningen og størrelsen av hver dråpe (bulk), så vel som dimensjonene av bilaget grensesnittet. I tillegg kunne asymmetriske membraner med forskjellig lipid sammensetning i hvert blad lett bli dannet. Ha en av de mikropipetter festet til en harmonisk piezoelektrisk aktuator, gjør det mulig å anvende en forprogrammert enkelt syklus eller oscillerende stimulus. Spenningen blir levert til den kunstige membran gjennom komprimering av begge dråper som støtter den. Som et resultat av dråpedeformasjon, de områdene av vann-lipid-olje-grensesnitt øke, og samtidig vinkelen mellom dråpene synker, forårsaker en økning i membran spenning og forbigående MsCl aktivering. Gjennom analyse av former av dråpene under deformasjon, kan den i spenn ved grenseflaten estimeres. Selv om fokuset i denne artikkelen er på mekanisk-transduksjon egenskapene til DIB, vi også understreke at andre typer biomolekyler, slik som alamethicin, kan bli aktivert av denne multi-funksjonelle plattform. Vi presenterer her, alle de tekniske aspektene ved utarbeidelse, montering, og ta målinger med denne nye metoden i en steg-for-steg måte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MsCl, en stor ledningsevne mechanosensitive kanal (MSC), er en allestedsnærværende osmolyte utløsningsventil som hjelper bakteriene overlever brå hypo-osmotisk sjokk. Det har blitt oppdaget og strengt studert ved hjelp av patch-clamp teknikk for nesten tre tiår. Dens grunnleggende rolle sette spenning påføres til cellemembranen inn i permeabilitet respons det er en sterk kandidat for å fungere som en mechanoelectrical transduser i kunstige membran-baserte biomolekylære enheter. Visning som byggesteiner til slike enheter, kan dråpe grensesnitt dobbeltlag (DIBS) brukes som en ny plattform for inkorporering og stimulering av MsCl kanaler. Her beskriver vi en mikropipette basert metode for å danne dibs og måle aktiviteten av de inkorporerte MsCl kanaler. Denne metoden består av lipid-innkapslet vanndråper forankret til tuppen av to motstridende (koaksialt posisjon) borsilikatglass mikropipetter. Når dråpene bringes i kontakt, i en lipid bilag-grensesnittdannet. Denne teknikken gir kontroll over den kjemiske sammensetningen og størrelsen av hver dråpe, så vel som dimensjonene av bilaget grensesnittet. Ha en av de mikropipetter festet til en harmonisk piezoelektrisk aktuator gir muligheten til å levere en ønsket svingnings stimulus. Gjennom analyse av former av dråpene under deformasjon, kan den i spenn ved grenseflaten estimeres. Ved hjelp av denne teknikken, er den første aktivitet av MsCl kanaler i et system DIB rapportert. Foruten MS kanaler, kan virksomheten til andre typer kanaler bli studert ved hjelp av denne metoden for å bevise at multi-funksjonaliteten til denne plattformen. Metoden som presenteres her muliggjør måling av egenskaper fundamental membran, gir en bedre kontroll over dannelsen av symmetriske og asymmetriske membraner, og er en alternativ måte for å stimulere og studere mechanosensitive kanaler.

Figurene 1 og 2 viser det eksperimentelle oppsettet, og utstyr som brukes til å registrere proteinaktivitet i løpet av mekanisk stimulering av lipid dobbeltlag-membranen. For å minimere elektrisk støy i våre målinger, er arbeidsstasjonen plassert i en lab-laget Faraday bur, jordet til jording på AxoPatch 200 B forsterker. Dannelse av et stabilt isolerende lipid bilag er et viktig steg i denne studien. I dette arrangement sammen et lipid monolag ved olje / vann-grenseflaten av de vandige dråper nedsenket i et bad av et organisk løsningsmiddel. Når dråpene bringes i kontakt, er overflødig olje elimineres, og de motstående lipid monolag tynn til en to-molekyl tykt lipidbilag. Den vanligste teknikken som brukes i bilags karakterisering er spennings klemme. Med spennings-klemme, blir spenningen over bilaget holdes på en konstant verdi, mens strømmen blir målt. Figur 4 </strong&gt; skildrer en typisk sanntids aktuelle opptaket av den opprinnelige bilagsdannelse. Å vite den spesifikke kapasitans (~ 0,6 uF / cm 2) 5 av DPhPC lipid bilaget, kan arealet av den dannede dobbeltlaget beregnes. Bilaget området kan kontrolleres ved å endre posisjonen av dråpene (figur 4A). Ved hjelp av den piezoelektriske aktuatoren, kan forskjellige typer av bølgeformer (sinusformet, firkantet, trekantet, osv.) Ved forskjellige frekvenser, amplituder, og driftsperioder påføres på dråpene til horisontalt og aksialt svinge dem og dermed kunne bilags spenning og området endres (Figur 4B). Når DIB er mekanisk stimulert, og samtidig opprettholde en konstant DC potensial over membranen, genererer et lavterskel (gain-of-funksjon) V23T mutant av MsCl pålitelige aktiviteter som hovedsakelig sub-ledende stater og tidvis fulle åpnings hendelser (Figur 5) . Disse eventene er identiske med de som er registrert ved hjelp av patch-clamp teknikk fra intakte indre E. coli-membraner og liposomer rekonstituert med det rensede V23T MsCl. Resultatene i figur 5 viser at portstyrings oppstår i respons til en økning i spenning, siden alle strømtopper observeres ved maksimal komprimering. På det meste kompresjon, er den relative areal utvidelse av dråpene maksimal og derfor er maksimal spenning på grensesnittet. Alamethicin, en spenning-gated ionekanal og en av de mest studerte peptider, øker membranpermeabilitet når en likespenning påtrykkes over membranen 36. Evnen til det ytre lipid bilaget grensesnittet for å være vert for transmembranproteiner og peptider blir også testet ved å utføre spennings gating strømopptak ved hjelp alamethicin peptid. Alamethicin blandes med fosfolipid oppløsning til en endelig konsentrasjon på 100 ng / ml. Figur 6 viser strømmålinger i henhold<html> spenning klemme (115 mV). Dråpene i dette eksperiment er trukket fra hverandre for å oppnå liten bilags-grensesnitt og dermed høyere motstand og mindre kapasitans. Den gating oppførselen til Alamethicin peptid er vist gjennom diskrete trinn av strøm (figur 6). Histogrammet på høyre side av tomten viser endringene i konduktans fra basisnivået (0.0962 NS), som er i hovedsak den første ledningsevnenivået av kanalen selv. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> Figur 1:. En skjematisk beskriver de viktigste deler og dimensjoner på oljereservoaret oljereservoaret er produsert ved maskinen butikk på Virginia Tech. Den består av en maskinert sylindrisk akryl rør limt til overflaten av en akrylplate. Dimensjonene og design kan endres for å tilpasses forskjellige applikasjoner eller mer enn to mikropipetter./53362/53362fig1large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> Figur 2:. Experimental oppsett og mikropipetter forberedelse (A) Standarden arbeidsstasjon for forming, mekanisk stimulerende, og karakterisere grensesnittet dobbeltlag inkluderer et mikroskop, 3-akslet manipulatorer, et digitalt kamera, piezoelektrisk oscillator, vibrasjon isolasjon bord, og et Faraday bur (ikke vist). (B) Den eksperimentelle oppsett består av to motstående PEG-DMA-hydrogel fylt mikropipetter horisontalt plassert inne i et bad av heksadekan olje. Hvert av mikropipetter inneholder en Ag / AgCl-elektrode for å tilveiebringe elektrisk forbindelse. En tredje mikropipette fylt med proteoliposome Oppløsningen brukes til å danne dråper på spissen av de andre mikropipetter. (C) Den DIB aktuelle reaksjon kan målesved hjelp av en kombinasjon av plasteret forsterkeren og lav støy datainnsamlingssystem. (D) En lukket opp bilde som viser de vandige dråper som dannes ved spissen av mikropipetter. (E) Ag / AgCl-elektroder er laget ved å dyppe enden av to 250 mikrometer sølvtråder i blekemiddel. Elektrodene blir så matet gjennom to borsilikatglass kapillærer fylt med PEG-DMA hydrogel, som herdes med UV-lys for å størkne. En rett microelectrode holder med mannlige kontakten brukes til å koble en av mikropipetter til heads av plasteret forsterkeren. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> Fig. 3: bilder som illustrerer dannelsen av dråpegrensesnitt dobbeltlag (A) En 10 mikrometer mikropipette fylt med proteoliposomes er plassert under mikroskopet i nærhet til mikropipette tips. Ved hjelp av en sprøyte koblet til mikropipette, dispensere små volumerav proteoliposomes å danne sfæriske små dråper til ønsket volum. La monolaget skjema ved å la dråpene til å sitte i ti minutter. Ta dråpene i kontakt; bilaget danner etter all olje på grenseflaten elimineres. (B) Når dobbeltlaget er dannet, kan den kjemiske sammensetningen på begge sider av grenseflaten kan styres ved å injisere ønskede kjemikalier ved anvendelse av en mikro-størrelse mikropipette. (C) Dråpene i øyeblikket for første kontakt. (D) De små dråper når det ytre lipid bilaget er dannet. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> Figur 4: sanntidsmålinger viser både den opprinnelige tynning og påfølgende utvidelse av grensesnittet (A) Current målt i løpet av bilagsdannelse gjennom anvendelse av en trekantet elektrisk potensial.. Størrelsen av den målte strøm er direkte proporsjonal med capaciheten, og dermed området av bilaget grensesnittet. Jo nærmere dråpene bringes sammen, jo større arealet av grenseflaten, og vice versa. (B) Ved anvendelse av mekanisk eksitasjon, området av bilaget grensesnitt øker og minker på samme frekvens som det stimulerende signal. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> Fig. 5: sanntidsmålinger viser responsen av bilaget til mekanisk eksitasjon, så vel som portstyringen av V23T mutant av MsCl Formen av strømresponsen er sinusformet, som er relatert til en sinusformet forandring i bilaget kapasitans som et resultat av bilaget området endres. De nåværende pigger, som opptrer ved toppen av hver syklus, indikerer sub-konduktans gating av V23T mutant. En polar tomten videre indikerer at gating oppstår på topp komprimering, noe som gjenspeiler en økning i spenning på bilaget grensesnittet. Fig. 6: Strøm målinger i henhold til spenningsklemmen og tilhørende histogram av ledningsevnenivåer for gating aktivitet av inkorporerte Alamethicin kanaler gating oppførselen til Alamethicin peptid er vist gjennom den diskrete trinnvis økning i strøm. De konduktans nivåer matche godt med tidligere målinger utført av vår forskningsgruppe ved Virginia Tech 7.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Kan brukes bakterie mechanosensitive kanaler som mechanoelectrical transdusere i biomolekylære enheter. Dråpe grensesnitt bilag (DIBS), celle-inspirerte byggesteinene til slike enheter, representerer nye plattformer å innlemme og stimulere mechanosensitive kanaler. Her viser vi en ny mikropipette-basert fremgangsmåte for å danne dibs, slik at studiet av mechanosensitive kanaler under mekanisk stimulering.

Multifunksjonell Mikropipette-basert metode for innlemmelse og Stimulering av bakteriell Mechanosensitive ionekanaler i dråpe Interface bilag

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

En ny metode for kultur og polarisert Stimulering av menneskelige tarmslimhinnen explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Dyrking av menneskelig Nasal Epitelceller på Air Flytende Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Måling av Ekstracellulær Ion Flukser Bruke Ion-selektive selvreferanser microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Bestemmelse av relativ celle overflaten og Total ekspresjon av rekombinante ionekanaler ved hjelp av flowcytometri

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...