Name: multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers
Uploaded: 2015-11-19T15:00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Pesquisa relatada nesta publicação é apoiada pelo escritório da força aérea da Scientific Research Initiative Básico Grant FA9550-12-1-0464.

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R., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+iris-like+expansion+of+a+mechanosensitive+channel+protein+induced+by+membrane+tension.">A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension.</a> NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).</li><li>Corry, B., Jayatilaka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+structure,+orientation,+and+energy+transfer+between+AlexaFluor+molecules+attached+to+MscL.">Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL.</a> BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+FRET+Reveals+Pore+Size+and+Opening+Mechanism+of+MscL.">Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL.</a> eLife. 3, e01834 (2014).</li><li>Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydration+properties+of+mechanosensitive+channel+pores+define+the+energetics+of+gating.">Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating.</a> J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).</li><li>Ko&#231;er, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayer+reconstitution+and+activity+measurement+of+the+mechanosensitive+channel+of+large+conductance+from+Escherichia+coli.">Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli.</a> J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Mechanosensation significa uma das primeiras vias de transdução sensoriais que evoluíram em organismos vivos. Usando esse fenômeno para estudar e compreender as propriedades mecano-elétrica do DIB, é um passo crucial para materiais de estímulos de resposta funcionais. Ela envolve a incorporação e a activação de um canal mechanosensitive, MsCl, no DIB como um transdutor mecanoelétrica e um medidor de tensão para detectar o aumento da tensão na interface bicamada lipídica. Em outra nota, a função de canais MS pode ser regulado através das propriedades do material de base de bicamadas lipídicas, incluindo a espessura, curvatura intrínseca, e compressibilidade. À luz do acima referido, a técnica baseada no micropipeta fornece uma ferramenta valiosa permitindo que o investigador a capacidade para estudar os canais MS em DIB e proporciona perspectivas sobre a estrutura da bicamada lipídica, bem como as interacções lípido-proteína. Nos últimos três décadas, de patch-clamp foi o principal método para estudar MS canais, uma vez que permite a fixação de tensão e a tensão. No entanto, patch-clamp requer equipamento volumoso e não é adequado para a miniaturização, uma propriedade necessária para a engenharia de dispositivos sensoriais e de conversão. DIB, devido à sua simplicidade, estabilidade, compacidade e representam um ambiente adequado para o estudo da actividade de MsCl. Aqui, estendemos avanços nas técnicas anteriores de formação de DIB, propondo uma técnica baseada na micropipeta, com a capacidade para controlar o tamanho das gotículas e a interface de camada dupla, a composição química de cada gotícula, e a tensão na interface através da estimulação dinâmica. A técnica consiste em ancorar gotículas aquosas, contendo proteoliposomes, até as pontas dos coaxialmente opostas capilares de vidro. As gotículas são colocadas em um banho de dissolvente orgânico e, quando trazido em contacto de formas bicamada lipídica na interface. As micropipetas estão ligados a posciladores iezoelectric, permitindo o deslocamento horizontal das gotículas. Dinamicamente comprimindo as gotículas, resulta num aumento da tensão interfacial na interface do óleo e da água, por conseguinte, um aumento da tensão bicamada. Dois aspectos principais diferenciam este método do semelhante e recentemente publicado contato bolha bicamada (CBB) técnica 37. Usando a técnica aqui apresentada, o tamanho da bicamada é controlado utilizando micromanipuladores e, assim, os volumes das gotículas permanecem constantes, ao contrário do método CBB. Além disso, a técnica CBB apela para bombas de pressão, que não são necessários no método apresentado neste trabalho tornando-o mais simples e mais fácil de construir. Nós somos capazes de incorporar e estimular bacteriana MsCl para o primeiro tempo, sem a utilização de uma pipeta patch ou modificações químicas 38. Uma vez que o sistema possibilita a formação de membranas de bicamada lipídica assimétricos robustas, que imita mais de perto a lassimetria IPID encontrado em membranas biológicas. Isso nos permite estudar os efeitos da composição da membrana controlada ou assimetria na atividade de MSCL. Além disso, por meio de técnicas de processamento de imagem, este método ajuda a estimar a tensão na interface bicamada. Esta técnica auxiliam na compreensão dos princípios da interconversão entre as forças de superfície em massa e o DIB, facilita as medições de propriedades fundamentais de membrana, e melhora a compreensão da resposta MsCl a membrana de tensão. Embora este método nos dá um passo para mais perto de um sistema de material de estímulos-responsivo biomolecular e a um ambiente fisiológico diferente para estudar MsCl, existem limitações para o sistema. A tensão neste sistema não pode ser fixada devido à presença do reservatório de lípidos sob a forma de lipossomas em cada gotícula, o que tende a aliviar a tensão na interface óleo / água. Portanto, no presente canais mechanosensitive pode ser estimuladaem DIBs única em regime dinâmico. A presença de bolhas de ar no sistema afeta significativamente a precisão e reprodutibilidade dos experimentos. As bolhas de ar presentes nos hidrogéis pode resultar perda se a ligação eléctrica. Enquanto que descrevem a utilização do método baseado micro-pipeta para a estimulação de MsCl, a técnica pode ser utilizada para estudar outros tipos de canais de MS e tem o potencial para ser usado por investigadores a estudar uma variedade de biomoléculas. Por exemplo, a configuração semelhante foi usado no nosso laboratório para estudar a resposta mecanoelétrica de uma membrana de bicamada de interface gotícula livre de canal. Várias proteínas poderia ser reconstituído e ativado usando esta configuração altamente controlado, levando em consideração que os ambientes de reconstituição de cada biomolécula variar. O método descrito neste artigo aborda um potencial de aplicação consideravelmente maior que é limitada apenas à imaginação do pesquisador.

Na última década, o conjunto de bicamadas lipídicas artificiais foi substancialmente avançado através do desenvolvimento do método de dupla camada de interface de gota. Conhecido como estável e robusto, DIBs se impuseram como sistemas modelo alternativo para o clássico pintado (Mueller) e dobrados bilayers (Montal-Mueller) planares 1. Embora a idéia de usar gotas para criar camadas duplas lipídicas remonta à década de 1960 2, que não ganhou popularidade até recentemente. A primeira tentativa bem sucedida foi relatado pelo Grupo Takeushi 3, seguido por vários estudos demonstrando a formação de bicamada utilizando uma rede de gotículas pelo grupo Bayley 4-6. Mais recentemente, técnicas de encapsulamento foram propostas pelo grupo de Leo 7-9, que foi pioneiro no conceito de usar DIBs como blocos de construção de novos sistemas de material de estímulo de resposta 10. Em estudos anteriores, DIBs provaram a sua capacidade de responder a 9,11 elétrica, chemiCal 10,12, e óptica estímulos 13. Vários biomoléculas com diferentes funcionalidades estímulos de resposta foram efetivamente estimulada quando reconstituída no DIB 10,14. À luz dessas tentativas bem sucedidas uma importante questão é levantada: poderia a responder ao estímulo mecânico DIB quando biomoléculas adequadas são incorporadas? As forças interfaciais que actuam em um DIB diferem daquelas em outros 15,16 sistema de duas camadas. Por conseguinte, a tensão na bicamada realizada pelas gotículas pode ser controlado através do controlo da tensão nas interfaces óleo-água-lípido; um conceito não aplicável com os sistemas de duas camadas pintadas ou dobradas. Canais MSCL, amplamente conhecidas como válvulas de liberação osmólito e elementos fundamentais da membrana citoplasmática bacteriana, reagir ao aumento da tensão da membrana 17,18. No caso de choques hipo-osmótico, vários canais que reside na membrana de uma pequena célula 19 pode gerar um masresposta permeabilidade sive para liberar rapidamente os íons e moléculas pequenas, poupando bactérias de lise 20. Biofísico, MSCL é bem estudada e caracterizada principalmente por meio da técnica de patch clamp proeminente 21-23. Modelos estruturais que explicam confiáveis ​​do mecanismo de gating MSCL 24,25 são propostas com base na estrutura do seu homólogo de cristal 26,27, modelagem de 28, e os resultados de extensa experimentação 24,29-31. Sob uma tensão aplicada de ~ 10 mN / m, o canal fechado que consiste em um pacote apertado de hélices transmembranares, transforma-se em um anel de hélices muito inclinado formando um ~ 28 Å cheio de água dos poros condutora 21,24,32. Também foi estabelecido que a hidrofobicidade do portão apertado, posicionada na intersecção dos domínios TM1 interiores, determina o limiar de activação do canal 33. Correspondentemente, descobriu-se que ao diminuir a hidrofobicidade do portão, o tension limiar poderia ser reduzido 22. Este estabelecimento de MSCL tornou possível a concepção de várias válvulas controláveis ​​34, principalmente para fins de distribuição de drogas. Para todas as propriedades acima mencionadas e com base no seu papel fundamental de traduzir membrana celular tensões excessivas em atividades eletrofisiológicas, MSCL faz um grande ajuste como um transdutor mecanoelétrica em DIBs. Neste artigo, apresentamos um método baseado em micropipeta original para formar DIBs e medir a atividade dos canais MSCL constituída sob estímulo mecânico. Relatamos pela primeira vez, a resposta de DIB para estímulos mecânicos e a reconstituição funcional de mutante V23T baixo limiar de MsCl em 35 DIB. O sistema experimental é composto por lipídios envolto gotículas aquosas ancoradas até as pontas dos dois micropipetas de vidro borosilicato opostas. Quando as gotas são postas em contacto uma interface bicamada lipídica é formou. Esta técnica permite o controlo sobre a composição química e o tamanho de cada gota (em massa), bem como as dimensões da interface bicamada. Além disso, as membranas assimétricas com várias composições de lípidos em cada folheto poderia ser formada facilmente. Tendo uma das micropipetas ligados a um actuador piezoeléctrico harmónica, oferece a possibilidade de aplicar uma pré-programado de ciclo único ou de estímulo oscilatório. A tensão é enviada para a membrana artificial através da compressão de ambas as gotículas que o suportam. Como um resultado da deformação das gotas, as zonas de interfaces de aumento de lípidos-água-óleo, e, simultaneamente, o ângulo entre as gotículas diminui, provocando um aumento na tensão da membrana e activação transiente MsCl. Por meio da análise das formas das gotículas durante a deformação, a tensão criada na interface pode ser estimada. Mesmo que o foco neste artigo é sobre as propriedades mecano-transdução do DIB, nós também enfatizar que outros tipos de biomoléculas, tais como alameticina, pode ser activado por esta plataforma multi-funcional. Nós apresentamos aqui, todos os aspectos técnicos da preparação, montagem e tomando medidas com esse novo método em uma maneira passo-a-passo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MsCl, um canal de grande condutância mechanosensitive (MSC), é uma válvula de libertação de osmólito ubíquo que ajuda a bactéria sobreviver choques hipo-osmótico abruptas. Foi descoberto e rigorosamente estudado usando a técnica de patch-clamp de quase três décadas. O seu papel de base de traduzir a tensão aplicada à membrana celular em resposta a permeabilidade torna um forte candidato para funcionar como um transdutor de mecanoelétrica em dispositivos biomoleculares artificiais à base de membrana. Servindo como blocos de construção para esses dispositivos, bicamadas de interface gotícula (DIBs) pode ser utilizada como uma nova plataforma para a incorporação e a estimulação de canais de MsCl. Aqui, nós descrevemos um método baseado na micropipeta para formar DIB e medir a actividade dos canais de MsCl incorporados. Este método consiste em gotículas aquosas envolto em lípidos ancorados até as pontas dos dois opostos (coaxialmente posicionadas) micropipetas de vidro de borosilicato. Quando as gotas são postas em contacto, uma interface de bicamada lipídica éformado. Esta técnica permite o controlo sobre a composição química e o tamanho de cada gota, bem como as dimensões da interface bicamada. Tendo uma das micropipetas ligados a um actuador piezoeléctrico harmónica fornece a capacidade de entregar um estímulo oscilatório desejado. Por meio da análise das formas das gotículas durante a deformação, a tensão criada na interface pode ser estimada. Usando esta técnica, a primeira atividade de canais MSCL em um sistema de DIB é relatado. Além canais MS, as actividades de outros tipos de canais pode ser estudada utilizando este método, demonstrando a multi-funcionalidade desta plataforma. O método aqui apresentado permite a medição das propriedades da membrana essencial, proporciona um maior controlo sobre a formação de membranas simétricas e assimétricas, e é uma forma alternativa para estimular e estudar canais mechanosensitive.

As Figuras 1 e 2 mostram a configuração e equipamento experimental utilizado para registar a actividade da proteína no decurso da estimulação mecânica da membrana bicamada lipídica. Para minimizar ruídos elétricos em nossas medições, a estação de trabalho é colocado dentro de uma gaiola de Faraday fez-lab, aterrado para uma ligação à terra na Axopatch 200 B amplificador. A formação de uma bicamada lipídica estável isolante é um passo chave neste estudo. Neste arranjo, uma monocamada lipídica monta na interface óleo / água das gotículas aquosas imerso num banho de um solvente orgânico. Quando as gotículas são colocadas em contacto, o excesso de óleo é eliminada, e as monocamadas lipídicas finas opostas a uma de duas moléculas de espessura bicamada lipídica. A técnica mais comum utilizada na caracterização da bicamada é de tensão-grampo. Com tensão-grampo, a tensão através da bicamada é mantida a um valor constante, enquanto a corrente é medida. A Figura 4 </strong&gt; retrata uma gravação de corrente em tempo real típica de formação de bicamada inicial. Sabendo a capacitância específica (~ 0,6 uF / cm 2) 5 da bicamada lipídica DPhPC, a área da bicamada formado podia ser calculada. A área da bicamada pode ser controlado alterando a posição das gotículas (Figura 4A). Usando o actuador piezoeléctrico, diferentes tipos de formas de onda (senoidal, quadrada, triangular, etc.) Em diferentes frequências, amplitudes, e os ciclos de funcionamento podem ser aplicados para as gotas para horizontalmente e axialmente oscilar eles e, assim, a tensão de duas camadas e a área pode ser alterada (Figura 4B). Quando o DIB é estimulada mecanicamente, mantendo ao mesmo tempo um potencial DC constante em toda a membrana, um limiar baixo (ganho de função) mutante V23T de MsCl gera actividades fiáveis, incluindo estados principalmente sub-condutoras e eventos de abertura ocasionalmente completos (Figura 5) . Estes eventos são idênticos aos registados utilizando a técnica de patch-clamp de membranas internas intactas de E. coli e lipossomas reconstituídos com o V23T purificada MsCl. Os resultados na Figura 5 gating provar que ocorre em resposta a um aumento da tensão, uma vez que todos os picos de corrente são observados no pico de compressão. Na compressão de pico, a expansão de área relativa das gotículas é máxima e, por conseguinte, a tensão na interface é máxima. Alameticina, um canal de iões dependentes da voltagem e uma das mais estudadas péptidos, aumenta a permeabilidade da membrana, quando uma tensão de CC é aplicada através da membrana 36. A capacidade da interface bicamada lipídica para acolher as proteínas de transmembrana e os péptidos também é testado através da realização de gravações de corrente-tensão gating usando alameticina péptido. Alameticina é misturado com a solução de fosfolípido para uma concentração final de 100 ng / ml. A Figura 6 mostra as medições de corrente sob<html> fixador de tensão (115 mV). As gotículas nesta experiência são separadas, a fim de alcançar a interface de bicamada pequena e, portanto, resistência mais elevada e menor capacitância. O comportamento de propagação do péptido Alameticina é mostrada através dos passos discretos de corrente (Figura 6). O histograma no lado direito do gráfico mostra as alterações na condutância do nível de base (0,0962 NS), que é, basicamente, o primeiro nível de condutibilidade do próprio canal. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> Figura 1:. Um esquema que descreve as partes principais e as dimensões do reservatório de óleo O reservatório de óleo é fabricado na oficina mecânica na Universidade Virginia Tech. É constituída por um tubo cilíndrico maquinado acrílico colada à superfície de uma folha de acrílico. As dimensões e design pode ser modificado para acomodar diferentes aplicações ou mais de duas micropipetas.&quot;Target =&quot; _ blank /53362/53362fig1large.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> Figura 2:. Preparação e configuração micropipetas Experimental (A) A estação de trabalho padrão para a formação, mecanicamente estimulando, e caracterizar as duplas camadas de interface inclui um microscópio, manipuladores de 3 eixos, uma câmera digital, oscilador piezoelétrico, mesa de isolamento de vibração, e uma gaiola de Faraday (não mostrado). (B) A montagem experimental é constituído por dois opostos PEG-DMA hidrogel preenchido micropipetas horizontalmente posicionado dentro de um banho de óleo Hexadecano. Cada uma das micropipetas contém um eléctrodo de Ag / AgCl para proporcionar ligação eléctrica. Um terceiro micropipeta cheia com solução de proteolipossoma é utilizado para formar as gotículas na ponta dos outros micropipetas. (C) A resposta actual DIB poderia ser medidoutilizando uma combinação do amplificador de patch e o sistema de aquisição de dados de baixo ruído. (D) Uma fechada acima da imagem que mostra as gotículas aquosas formadas na ponta das micropipetas. Eléctrodos (E) de Ag / AgCl são feitas mergulhando a ponta de dois fios 250 um de prata em água sanitária. Os eléctrodos são então alimentados através de dois capilares de vidro de borossilicato cheios com PEG-DMA hidrogel, que é curado com luz UV para solidificar. Um detentor de microeletrodos em linha reta com conector macho é utilizado para conectar uma das micropipetas ao headstage do amplificador de patch. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> Figura 3:. Imagens que ilustram a formação de bicamadas de interface de gotículas (A) Um 10 um micropipeta cheia com proteolipossomas está posicionado sob o microscópio na proximidade das pontas micropipeta. Usando uma seringa ligada ao micropipeta, dispensar pequenos volumesdos proteolipossomas para formar gotas esféricas para volume desejado. Deixe o formulário monocamada, permitindo que as gotas se sentar por dez min. Traga as gotas em contato; bicamada irá formar após todo o óleo na interface é eliminada. (B) Embora a bicamada é formada, a composição química em ambos os lados da interface pode ser controlada através da injecção de produtos químicos desejados utilizando uma micropipeta de micro porte. (C) As gotículas no momento do primeiro contato. (D) As gotículas quando a bicamada de lípido é formado. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> Figura 4: Real-time medições mostram tanto o desbaste inicial e subsequente expansão da interface (A) A corrente medida no decurso de formação de duas camadas por meio da aplicação de um potencial eléctrico triangular.. A magnitude da corrente medida é directamente proporcional à capacitância, e assim a área da interface bicamada. Quanto mais perto as gotas são reunidas, maior a área da interface e vice-versa. (B), após aplicação de excitação mecânica, a área da interface de duas camadas aumenta e diminui na mesma frequência que o sinal de estimulação. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> Figura 5:. Medições em tempo real mostra a resposta da bicamada de excitação mecânica, bem como a propagação do mutante V23T de MsCl A forma da resposta da corrente é sinusoidal, a qual se refere a uma mudança sinusoidal em bicamada capacitância como um resultado de a mudança área bicamada. Os picos de corrente, que ocorrem no pico de cada ciclo, indicam sub-condutância propagação do mutante V23T. Um diagrama polar indica ainda que gating ocorre no pico de compressão, o que reflecte um aumento da tensão na interface bicamada. Figura 6:. Medições atuais sob braçadeira de tensão e histograma correspondente de níveis de condutância para a actividade de selecção de canais alameticina incorporados O comportamento gating do peptídeo Alameticina é mostrado através do aumento gradual discreto na atual. Os níveis de condutância combinar muito bem com medições anteriores realizados por nosso grupo de pesquisa na Virginia Tech 7.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Canais mechanosensitive bacterianas podem ser utilizados como transdutores mecanoelétrica em dispositivos biomoleculares. Bilayers de interface de gotículas (DIBs), de inspiração celulares blocos de construção para tais dispositivos, representam novas plataformas para incorporar e estimular canais mechanosensitive. Aqui, demonstramos um novo método baseado na micropipeta de formar DIB, permitindo que o estudo de canais mechanosensitive sob estimulação mecânica.

Método multifuncional, baseado em Micropipeta de Incorporação e estimulação do bacteriana Mechanosensitive canais iônicos em gotículas de interface Bicamadas

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

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