Name: multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers
Uploaded: 2015-11-19T15:00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Исследования сообщили в данной публикации поддерживается ВВС Управления научных исследований фундаментальных Инициатива Грант FA9550-12-1-0464.

<ol>
	<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties.">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).</li><li>Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+bimolecular+protein-lipid+membranes+in+aqueous+solution.">Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution.</a> Nature. , (1966).</li><li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Bilayer+Formation+by+Contacting+Monolayers+in+a+Microfluidic+Device+for+Membrane+Protein+Analysis.">Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis.</a> ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).</li><li>Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+bionetworks+from+nanoliter+water+droplets.">Functional bionetworks from nanoliter water droplets.</a> J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Maglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+networks+with+incorporated+protein+diodes+show+collective+properties.">Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties.</a> Nat Nano. 4, 437-440 (2009).</li><li>Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+formation+between+lipid-encased+hydrogels+contained+in+solid+substrates.">Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates.</a> ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+attachment+method+for+reconstituting+lipid+bilayers+of+prescribed+size+within+flexible+substrates.">Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates.</a> ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-based+biomolecular+smart+materials.">Membrane-based biomolecular smart materials.</a> SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+virtual+ground+to+control+transmembrane+voltages+and+measure+bilayer+currents+in+serial+arrays+of+droplet+interface+bilayers.">The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers.</a> SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-inspired+electroactive+polymer+materials+incorporating+biomolecular+materials.">Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials.</a> SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Bayley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayers.">Droplet interface bilayers.</a> MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+torus+surrounding+planar+lipid+bilayer+membranes.">Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes.</a> BIOPHYS J. 12, 432 (1972).</li><li>Tien, H. T., Ottova, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+bilayer+concept+and+its+experimental+realization:+from+soap+bubbles,+kitchen+sink,+to+bilayer+lipid+membranes.">The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes.</a> J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).</li><li>Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+prokaryotic+mechanosensitive+channels.">Gating prokaryotic mechanosensitive channels.</a> NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).</li><li>Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+channels+in+microbes.">Mechanosensitive channels in microbes.</a> ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+census+of+mechanosensitive+channels+in+living+bacteria.">Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria.</a> PLoS ONE. 7, e33077 (2012).</li><li>Levina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+Escherichia+coli+cells+against+extreme+turgor+by+activation+of+MscS+and+MscL+mechanosensitive+channels:+identification+of+genes+required+for+MscS+activity.">Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity.</a> The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).</li><li>Chiang, C. -. S., Anishkin, A., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+the+large+mechanosensitive+channel+in+situ:+estimation+of+the+spatial+scale+of+the+transition+from+channel+population+responses.">Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses.</a> BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).</li><li>Anishkin, A., Chiang, C. -. S., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+reveal+expanded+intermediate+states+and+a+sequential+action+of+two+gates+in+MscL.">Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).</li><li>Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetic+and+Spatial+Parameters+for+Gating+of+the+Bacterial+Large+Conductance+Mechanosensitive+Channel,+MscL.">Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).</li><li>Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+investigation+of+MscL+gating+using+experimental+data+and+coarse+grained+MD+simulations.">Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations.</a> PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).</li><li>Kubalski, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. , (2005).</li><li>Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+MscL+homolog+from+Mycobacterium+tuberculosis:+a+gated+mechanosensitive+ion+channel.">Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel.</a> Science. 282, 2220-2226 (1998).</li><li>Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+prokaryotic+mechanosensitive+channels+MscL+and+MscS.">Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS.</a> Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).</li><li>Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+models+of+the+MscL+gating+mechanism.">Structural models of the MscL gating mechanism.</a> BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).</li><li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels.">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li><li>Betanzos, M., Chiang, C. -. S., Guy, H. R., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+iris-like+expansion+of+a+mechanosensitive+channel+protein+induced+by+membrane+tension.">A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension.</a> NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).</li><li>Corry, B., Jayatilaka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+structure,+orientation,+and+energy+transfer+between+AlexaFluor+molecules+attached+to+MscL.">Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL.</a> BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+FRET+Reveals+Pore+Size+and+Opening+Mechanism+of+MscL.">Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL.</a> eLife. 3, e01834 (2014).</li><li>Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydration+properties+of+mechanosensitive+channel+pores+define+the+energetics+of+gating.">Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating.</a> J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).</li><li>Ko&#231;er, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+voltage-gated+ion+channel+model+inferred+from+the+crystal+structure+of+alamethicin+at+1.5-&#8491;+resolution.">A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-&#8491; resolution.</a> Nature. 300, 325-330 (1982).</li><li>Iwamoto, M., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+Bubble+Bilayers+with+Flush+Drainage.">Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Barriga, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayer+reconstitution+and+activity+measurement+of+the+mechanosensitive+channel+of+large+conductance+from+Escherichia+coli.">Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli.</a> J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Mechanosensation означает один из первых сенсорных трансдукции, которые развились в живых организмах. Использование этого явления для изучения и понимания механико-электрические свойства DIB, является важным шагом в направлении функциональных стимулов проблематику материалов. Это предполагает включение и активацию механочувствительных канала, MSCL, в DIB в mechanoelectrical преобразователя и датчика деформации для обнаружения усилить напряженность в интерфейсе липидного бислоя. С другой стороны, функция MS каналов может регулироваться с помощью основных свойств материала липидных бислоев в том числе толщины, внутренней кривизны, и сжимаемости. В свете вышесказанного, методика микропипетки основе представляет собой ценный инструмент, позволяющий исследователю возможность изучать MS каналов в бабки и дает представление о структуре липидный бислой, а также липидно-белковые взаимодействия. За последние три десятилетияс, патч-зажим был основным методом изучения MS каналов, так как она позволяет зажим напряжения и напряженности. Тем не менее, патч-зажим требует громоздкого оборудования и не подходит для миниатюризации, в собственности, необходимой для проектирования сенсорных и устройств преобразования. DIBs из-за своей простоте, стабильности и компактности представляют собой подходящую среду для изучения активности MSCL. Здесь мы расширим предыдущий прогресс в методах формирования DIB, предложив метод микропипетки основе, с возможностью регулировать размер капель и интерфейс двухслойной, химический состав каждой капли, и напряжение на границе через динамический стимуляции. Техника состоит из крепления водные капельки, содержащие Протеолипосомы, до кончиков соосно противоположные стеклянные капилляры. Капли помещают в ванну с органическим растворителем и при контакте липидный бислой формы на границе раздела. В микропипетки прикреплены к рiezoelectric генераторы, позволяющие горизонтальное смещение капель. Динамически сжатия капель, приводит к увеличению поверхностного натяжения на границе раздела вода масла и, следовательно, к увеличению двухслойной напряжения. Две основные аспекты этого метода дифференцировать от аналогичных и недавно опубликовал контакт пузырь двухслойная (НБР) техники 37. Используя методику, представленную в данном описании, размер бислой управляется с помощью микроманипуляторами и, таким образом объемы капель остается постоянным, в отличие от метода CBB. Кроме того, методика НБР призывает насосов высокого давления, которые не нужны в методе, представленном в этой статье, что делает его проще и легче построить. Мы можем включить и стимулировать бактериальную MSCL впервые без использования патча пипетки или химических модификаций 38. Поскольку система способствует образованию надежных асимметричных мембран липидный бислой, что более точно имитирует лIPID асимметрия нашли в биологических мембранах. Это позволяет нам изучать последствия контролируемым составом мембраны или асимметрии о деятельности MSCL. Кроме того, с помощью методов обработки изображений, этот метод позволяет оценить напряженность на границе двухслойной. Эта техника помогает в понимании принципов взаимного между объемной и поверхностной силы в DIB, облегчает измерения основных свойств мембраны, и улучшает понимание MSCL ответ на мембраны напряжение. Хотя этот метод ведет нас на шаг ближе в сторону биомолекулярной стимулов проблематику материальной системы и в различного физиологического среды для изучения MSCL, существуют ограничения в системе. Напряжение в этой системе не могут быть зажаты в связи с наличием липидного резервуара в форме липосом в каждой капли, который имеет тенденцию уменьшить напряжение на границе раздела масло / вода. Таким образом, в настоящее время механочувствительных каналов может быть стимулированов бабки только в динамическом режиме. Наличие пузырьков воздуха в системе существенно влияет на точность и воспроизводимость экспериментов. Пузырьки воздуха, присутствующие в гидрогелей может привести потери, если электрическое соединение. В то время как мы описали использование микро-пипетки на основе метода для стимуляции MSCL, технология может быть использована для изучения других типов MS каналов и имеет потенциал, который будет использоваться для изучения исследователей различные биомолекул. Например, аналогичные установки была использована в нашей лаборатории для изучения mechanoelectrical отклика канала свободной поверхности раздела капли двухслойной мембраны. Различные белки могут быть восстановлены и активировать с помощью этой весьма контролируемой установки, принимая во внимание, что воссоздание среды каждого биомолекулы изменяются. Метод, описанный в этой статье затрагивает значительно более широком потенциале приложений, который ограничивается только воображением исследователя.

В последнее десятилетие, сборка искусственных липидных бислоев была значительно расширенный за счет развития метода двухслойной интерфейса капли. Известный как стабильный и надежный, DIBs ввели себя в качестве альтернативных модельных систем в классической окрашены (Мюллер) и сложенными (Монтал-Мюллера) плоских двухслойных 1. Хотя идея использования капель, чтобы создать бислоев восходит к 1960 2, он не приобрел популярность не до недавнего времени. Первый успешный попытка была сообщили в группе Takeushi 3, а затем в ряде исследований, демонстрирующих формирование двухслойной используя сеть капель группой Бейли 4-6. Совсем недавно, методы инкапсуляции были предложены группой Лео 7-9, который впервые концепция использования DIBs в качестве строительных блоков новых стимулов проблематику материальных систем 10. В предыдущих исследованиях, DIBs доказали свою способность реагировать на электрической 9,11, химческих 10,12, и оптический стимулы 13. Различные биомолекулы с различными стимулами проблематику функциональных были эффективно стимулировали при восстановлении в DIB 10,14. В свете этих успешных попыток важным вопрос, поднятых: может DIB Ответить на механический стимул, когда соответствующие биомолекулы включены? Межфазное силы, действующие на DIB отличаться от тех, в других двухслойной системы 15,16. Таким образом, напряженность в бислой, проведенного капель можно контролировать путем регулирования напряжения на водно-липидный нефтяных интерфейсов; концепция не применяется с нарисованными или сложенными двухслойных системах. MSCL каналы, широко известные как осмолита выпуска клапанов и основных элементов бактериальной цитоплазматической мембраны, реагируют с увеличением напряженности мембраны 17,18. В случае гипо- осмотическое потрясений, несколько каналов, проживающих в мембране маленькой камере 19 может генерировать масответ SIVE проницаемость быстро отпустите ионы и малые молекулы, экономя бактерий лизиса 20. Биофизически, MSCL хорошо изучена и характеризуется, прежде всего, через технику зажим крупное патч 21-23. Надежные структурные модели, объясняющие механизм стробирования 24,25 MSCL являются предложил на основе кристаллической структуры своего гомолога в 26,27, 28, моделирования и результатов широких экспериментов 24,29-31. Под прикладной натяжения ~ 10 мН / м, закрытый канал, который состоит из жесткой связке трансмембранных спиралей, превращается в кольцо сильно наклоненными спиралями, образующих ~ 28 заполненной водой проводящий пору 21,24,32. Кроме того, было установлено, что гидрофобность плотный ворот, расположенный на пересечении внутренней доменов TM1, определяет порог активации канала 33. Соответственно, было обнаружено, что за счет уменьшения гидрофобности ворот, Tensioп порог может быть снижен 22. Это свойство MSCL возможным проектирование различных управляемых клапанов 34, в первую очередь для целей доставки лекарств. Для всех вышеупомянутых свойств и на основе своей фундаментальной роли перевод клеточной мембраны чрезмерных напряженности в электрофизиологических деятельности, MSCL делает отлично подходит в качестве mechanoelectrical преобразователя в бабки. В этой статье мы представляем оригинальный микропипетки на основе метода для формирования DIBs и измерения активности инкорпорированных каналов MSCL при механическом раздражении. Мы сообщаем впервые, ответ бабки к механическим раздражением и функциональную восстановления в V23T низкопорогового мутанта MSCL в бабки 35. Экспериментальная система состоит из липидов, заключенная водных капель на якоре до кончиков двух противоположных боросиликатного стекла микропипеток. При капли вводят в контакт интерфейс липидный бислой является FOrmed. Эта техника предлагает контролировать химического состава и размера каждого капель (навалом), а также размеры интерфейса двухслойной. Кроме того, асимметричных мембран с различными липидными композициями в каждой створки может быть легко сформирован. Имея один из микропипеток прикрепленных к гармонической пьезоэлектрического привода, обеспечивает возможность применения запрограммированный одного цикла или колебательный стимул. Напряжение подается на искусственном мембраны через сжатие обеих капель, поддерживающих его. В результате капли деформации, области водно-липидный масла интерфейсов увеличения и одновременно угол между капель уменьшается, что приводит к увеличению мембранного напряжения и переходных активации MSCL. Через анализ форм капель в процессе деформации, напряжение создается на границе можно оценить. Даже если в центре внимания в этой статье на механо-трансдукции свойства DIB, мы также подчеркиваем, что другие типы биомолекулы, такие как аламетицина, могут быть активированы с помощью этой многофункциональной платформы. Мы представляем здесь, все технические аспекты подготовки, сборки и проведения измерений с этого нового метода в шаг за шагом образом.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MSCL, А механочувствительных канал большой проводимости (MSC), является вездесущим осмолита выпускной клапан, который помогает бактерии выживают резких Hypo-осмотическое потрясений. Было обнаружено, и строго изучены с помощью метода патч-зажим в течение почти трех десятилетий. Свою основную роль перевода натяжение к клеточной мембране в ответ на проницаемость дает сильный кандидат для работы в качестве датчика mechanoelectrical в искусственных мембран на основе молекулярно-биологических устройств. Работа в качестве строительных блоков для таких устройств, интерфейс капель бислоев (бабки) может быть использован в качестве нового платформы для включения и стимулирования MSCL каналов. Здесь мы опишем метод микропипетки основе сформировать DIBs и измерения активности инкорпорированных каналов MSCL. Этот метод состоит из липидов, заключенная водных капель на якоре до кончиков двух противоположных (соосно) боросиликатного стекла микропипеток. При капли вводят в контакт, интерфейс липидный бислой являетсяформируется. Эта техника предлагает контролировать химического состава и размера каждой капли, а также размеры интерфейса двухслойной. Имея один из микропипеток прикрепленных к гармонической пьезоэлектрического привода обеспечивает возможность доставить желаемого колебательный стимул. Через анализ форм капель в процессе деформации, напряжение создается на границе могут быть оценены. Используя эту технику, сообщает первый активность MSCL каналов в системе DIB. Кроме того, MS каналов, деятельность других типов каналов могут быть изучены с помощью этого метода, доказывая, мульти-функциональность этой платформы. Метод, представленный здесь позволяет измерять свойства фундаментальной мембранных, обеспечивает больший контроль над формированием симметричных и асимметричных мембран, и альтернативный способ, чтобы стимулировать и изучить механочувствительных каналов.

Цифры 1 и 2 отображения экспериментальную установку и оборудование, используемые для записи активности белка в процессе механической стимуляции двухслойной липидной мембраной,. Чтобы свести к минимуму электрический шум в наших измерениях, рабочая станция находится в пределах лабораторного производства клетки Фарадея, заземлен заземления на Axopatch 200 B усилителя. Формирование стабильного изоляционного липидного бислоя является ключевым шагом в данном исследовании. В этом варианте липид монослой собирает на границе раздела масло / вода из водных капелек, погруженных в ванну с органическим растворителем. Когда капли размещены в контакте, избыток масла удаляют, и противостоящие монослоев липидные тонко двух молекул толщиной липидного бислоя. Наиболее общая методика используется в двухслойной характеристика напряжения зажим. С фиксации потенциала, напряжение поперек мембраны поддерживается на постоянном уровне, а ток измеряется. Фиг.4 </stronг&gt; изображает типичную в режиме реального времени текущую запись начального образования двухслойной. Зная удельную емкость (~ 0,6 мкФ / см2) 5 из липидный бислой DPhPC, площадь образованного бислой можно рассчитать. Область бислой можно контролировать, изменяя положение капель (фиг.4А). Использование пьезоэлектрический исполнительный различные типы сигналов (синусоидальные, квадратные, треугольные и т.д.). На разных частотах, амплитуд и циклов могут быть применены к капелькам по горизонтали и аксиально колебания их и таким образом, бислой напряжение и область может быть изменена (4В). Когда DIB механически стимулируется, в то время как поддержание постоянной потенциал постоянного тока через мембрану, с низким порогом (получить-из-функции) V23T мутант MSCL генерирует надежные деятельности, включая, главным образом, к югу от проводящих состояний, а иногда и полное события открытия (Рисунок 5) , Эти EVЭнты идентичны тем, которые записаны с использованием метода патч-зажим с интактными внутренних E.coli, мембран и липосом восстанавливают очищенной V23T MSCL. Результаты на рисунке 5 доказать, что стробирования происходит в ответ на увеличение напряжения, так как все пики тока наблюдаются при пиковой сжатия. В пик сжатия, относительное расширение поверхностная капель максимальна и, следовательно, напряжение на границе максимальна. Аламетицина, напряжение-ионный канал и один из наиболее изученных пептидов, увеличивает проницаемость мембран, когда напряжение постоянного тока прикладывается через мембрану 36. Способность интерфейса липидной двухслойной для размещения трансмембранных белков и пептидов, также проходят проверку выполнения текущих записи вольт-стробирования с помощью аламетицина пептида. Аламетицина смешивают с фосфолипидной раствора до конечной концентрации 100 нг / мл. Рисунок 6 показывает текущие измерения в<html> зажим напряжения (+115 мВ). Капли в этом эксперименте растаскивают, чтобы достичь небольшого интерфейс двухслойную и, таким образом, более высокую устойчивость и меньшую емкость. Поведение стробирования пептида аламетицина показано через дискретные шаги текущего (рис 6). Гистограмма на правой стороне участка показаны изменения проводимости от базового уровня (0.0962 NS), которая в основном первый уровень проводимость самого канала. <img alt="фигура 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> Рисунок 1:. Схематическое описание основных частей и размеры резервуара нефти Масляный резервуар изготовлен в механическом цехе Вирджинии. Он состоит из цилиндрического обработанной акриловой трубки приклеены к поверхности акрилового листа. Размеры и дизайн могут быть изменены, чтобы приспособить различные приложения или более двух микропипетки./53362/53362fig1large.jpg &quot;Целевых =&quot; _blank &quot;&gt; Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> Рисунок 2:. Экспериментальная установка и микропипетки подготовка (А) Стандарт станция для формирования, механически стимулируя и характеризующие интерфейса бислои включает в себя микроскоп, 3-оси манипуляторов, цифровую камеру, пьезоэлектрический генератор, стол виброизоляции, и клетку Фарадея (не показано). (Б) Экспериментальная установка состоит из двух противоположных ПЭГ-ДМА гидрогелевых заполнено микропипетки горизонтально в ванне гексадекан масла. Каждый из микропипетки содержит электрод Ag / AgCl, чтобы обеспечить электрическое соединение. Третий микропипетки заполнены раствором proteoliposome используется для формирования капель на кончике других микропипетки. (С) В настоящее время отклика DIB может быть измеренаиспользуя комбинацию усилителя патч и низким уровнем шума системы сбора данных. (D) закрыл картину, показывающую водных капелек, образованных на кончике микропипетки. (Е) Ag / AgCl электроды изготовлены путем погружения кончик двух серебряных проводов 250 мкм отбеливателя. Электроды затем подается через два боросиликатного стекла капилляров, заполненных ПЭГ-ДМА гидрогеля, который отверждается ультрафиолетовым светом, чтобы затвердеть. Прямой держатель микроэлектрод с мужской разъем используется для подключения одной из микропипеток в headstage усилителя патч. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> Рисунок 3:. Изображения, иллюстрирующие формирование интерфейса бислоев капель (A) 10 мкм микропипетки заполнены протеолипосом расположен под микроскопом в непосредственной близости от кончиков микропипетки. С помощью шприца, соединенный с микропипетки, обойтись небольшие объемыиз протеолипосом с образованием сферических капелек требуемого объема. Пусть форма монослоя, позволяя капли, чтобы сидеть на десять минут. Принесите капельки в контакт; бислой образует ведь масло на границе исключается. (Б) В то время как бислой формируется химический состав на обеих сторонах интерфейса можно контролировать путем введения нужных химических веществ с помощью микро-размера микропипетки. (С) Капли в момент первого контакта. (D), когда капли липидный бислой формируется. <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> Рисунок 4: в режиме реального времени измерения показывают, как первоначальный истончение и последующее расширение интерфейса (A) ток, измеренный в процессе формирования двухслойной путем применения треугольной электрического потенциала.. Величина измеряемого тока прямо пропорциональна Capaciстояние, и, следовательно, площадь поверхности раздела двухслойной. Чем ближе капельки собрал, тем больше площадь интерфейса и наоборот. (В) При применении механического возбуждения, площадь интерфейса увеличивается и уменьшается двухслойных на той же частоте, что и сигнал стимулирующего. <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> Рис. 5: Измерения в реальном времени показывает отклик бислой к механическим возбуждением, а также стробирования в V23T мутанта MSCL Форма отклик тока синусоидальной, который относится к синусоидальной изменения в двухслойной емкости в результате изменение двухслойная площадь. Текущие шипы, происходящие на пике каждого цикла, указывают суб-проводимости стробирования в V23T мутанта. Полярный сюжет далее указывает, что строб происходит на пике сжатия, которая отражает рост напряженности на границе двухслойной. Рисунок 6:. Текущие измерения под зажим напряжения и соответствующей гистограммы уровней проводимости для стробирования деятельности объединенных каналов аламетицина Поведение стробирования пептида аламетицина проявляется через дискретного пошагового увеличения тока. Уровни проводимости соответствует очень хорошо с предыдущих измерений, выполненных нашей исследовательской группы в Вирджинии 7.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Бактериальные механочувствительных каналы могут быть использованы в качестве mechanoelectrical преобразователей в молекулярно-биологических устройств. Воздушно-капельных интерфейс бислои (бабки), сотовые стиле строительные блоки в таких устройствах, представляют собой новые платформы для включения и стимулирования механочувствительных каналов. Здесь мы демонстрируем новый микропипетки на основе метода формирования DIBs, позволяя изучение механочувствительных каналов при механическом раздражении.

Многофункциональный, Микропипетки основе метода для регистрации и стимуляции бактериального механочувствительных ионных каналов в капельной интерфейса Бислои

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Патч зажим Запись ионных каналов, выраженные в ооцитов Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Подготовка Искусственный Бислои для экспериментов электрофизиологии

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Мутагенеза и функционального анализа ионных каналов Heterologously Выраженный в клетках млекопитающих

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Оптимизированная стратегия Трансфекция для выражения и Электрофизиологические Запись рекомбинантных напряжением ионные каналы в НЕК-293T Клетки

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Новый метод культуры и поляризованный Стимуляция кишечника человека Экспланты Слизистая

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Культивирование носа человека эпителиальных клеток в Военно-воздушной жидкость

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Измерение внеклеточного ионных потоков, используя ион-селективный автореферентных Микроэлектродные Техника

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Определение относительной клеточной поверхности и Total экспрессии рекомбинантных ионных каналов с помощью проточной цитометрии

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...