Name: multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers
Uploaded: 2015-11-19T15:00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Bu yayında bildirilen Araştırma Bilimsel Araştırma Temel Girişimi Hibe FA9550-12-1-0464 Hava Kuvvetleri Ofisi tarafından desteklenmektedir.

<ol>
	<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties.">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).</li><li>Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+bimolecular+protein-lipid+membranes+in+aqueous+solution.">Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution.</a> Nature. , (1966).</li><li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Bilayer+Formation+by+Contacting+Monolayers+in+a+Microfluidic+Device+for+Membrane+Protein+Analysis.">Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis.</a> ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).</li><li>Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+bionetworks+from+nanoliter+water+droplets.">Functional bionetworks from nanoliter water droplets.</a> J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Maglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+networks+with+incorporated+protein+diodes+show+collective+properties.">Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties.</a> Nat Nano. 4, 437-440 (2009).</li><li>Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+formation+between+lipid-encased+hydrogels+contained+in+solid+substrates.">Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates.</a> ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+attachment+method+for+reconstituting+lipid+bilayers+of+prescribed+size+within+flexible+substrates.">Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates.</a> ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-based+biomolecular+smart+materials.">Membrane-based biomolecular smart materials.</a> SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+virtual+ground+to+control+transmembrane+voltages+and+measure+bilayer+currents+in+serial+arrays+of+droplet+interface+bilayers.">The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers.</a> SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-inspired+electroactive+polymer+materials+incorporating+biomolecular+materials.">Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials.</a> SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Bayley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayers.">Droplet interface bilayers.</a> MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+torus+surrounding+planar+lipid+bilayer+membranes.">Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes.</a> BIOPHYS J. 12, 432 (1972).</li><li>Tien, H. T., Ottova, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+bilayer+concept+and+its+experimental+realization:+from+soap+bubbles,+kitchen+sink,+to+bilayer+lipid+membranes.">The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes.</a> J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).</li><li>Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+prokaryotic+mechanosensitive+channels.">Gating prokaryotic mechanosensitive channels.</a> NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).</li><li>Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+channels+in+microbes.">Mechanosensitive channels in microbes.</a> ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+census+of+mechanosensitive+channels+in+living+bacteria.">Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria.</a> PLoS ONE. 7, e33077 (2012).</li><li>Levina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+Escherichia+coli+cells+against+extreme+turgor+by+activation+of+MscS+and+MscL+mechanosensitive+channels:+identification+of+genes+required+for+MscS+activity.">Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity.</a> The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).</li><li>Chiang, C. -. S., Anishkin, A., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+the+large+mechanosensitive+channel+in+situ:+estimation+of+the+spatial+scale+of+the+transition+from+channel+population+responses.">Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses.</a> BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).</li><li>Anishkin, A., Chiang, C. -. S., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+reveal+expanded+intermediate+states+and+a+sequential+action+of+two+gates+in+MscL.">Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).</li><li>Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetic+and+Spatial+Parameters+for+Gating+of+the+Bacterial+Large+Conductance+Mechanosensitive+Channel,+MscL.">Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).</li><li>Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+investigation+of+MscL+gating+using+experimental+data+and+coarse+grained+MD+simulations.">Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations.</a> PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).</li><li>Kubalski, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. , (2005).</li><li>Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+MscL+homolog+from+Mycobacterium+tuberculosis:+a+gated+mechanosensitive+ion+channel.">Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel.</a> Science. 282, 2220-2226 (1998).</li><li>Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+prokaryotic+mechanosensitive+channels+MscL+and+MscS.">Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS.</a> Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).</li><li>Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+models+of+the+MscL+gating+mechanism.">Structural models of the MscL gating mechanism.</a> BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).</li><li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels.">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li><li>Betanzos, M., Chiang, C. -. S., Guy, H. R., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+iris-like+expansion+of+a+mechanosensitive+channel+protein+induced+by+membrane+tension.">A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension.</a> NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).</li><li>Corry, B., Jayatilaka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+structure,+orientation,+and+energy+transfer+between+AlexaFluor+molecules+attached+to+MscL.">Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL.</a> BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+FRET+Reveals+Pore+Size+and+Opening+Mechanism+of+MscL.">Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL.</a> eLife. 3, e01834 (2014).</li><li>Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydration+properties+of+mechanosensitive+channel+pores+define+the+energetics+of+gating.">Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating.</a> J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).</li><li>Ko&#231;er, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+voltage-gated+ion+channel+model+inferred+from+the+crystal+structure+of+alamethicin+at+1.5-&#8491;+resolution.">A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-&#8491; resolution.</a> Nature. 300, 325-330 (1982).</li><li>Iwamoto, M., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+Bubble+Bilayers+with+Flush+Drainage.">Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Barriga, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayer+reconstitution+and+activity+measurement+of+the+mechanosensitive+channel+of+large+conductance+from+Escherichia+coli.">Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli.</a> J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Mechanosensation yaşayan organizmaların gelişti ilk duyusal iletim yollarının biri anlamına gelir. Okuyan ve DIB mekano-elektriksel özelliklerini anlamak için bu olguyu kullanarak, fonksiyonel uyaranlara duyarlı malzemeler doğru önemli bir adımdır. Bu mekanoelektriksel dönüştürücü ve çift katlı lipid arayüzünde gerginlik artışı tespit etmek için bir zorlanma göstergesi olarak DIB bir mechanosensitive kanalı, MsCl, birleşmesini ve aktivasyonunu içerir. Bir başka not, MS kanallarının fonksiyon kalınlığı, içsel eğrilik ve kompresibilite dahil lipit bilayers temel malzeme özelliklerine düzenlenir olabilir. Yukarıda bahsedilen ışığında, mikropipet bazlı bir tekniktir araştırmacı Dıb&#39;leri MS kanallar çalışma ve çift katlı lipid yapısına, aynı zamanda, lipid-protein etkileşimleri kavranmasını sağlar yeteneği sağlayan değerli bir araç sağlar. Son üç on yıl içindes, patch-kelepçe o gerilim ve gerginlik hem kenetlenmesini sağlar beri, MS kanallarını incelemek için birincil yöntem oldu. Ancak, patch-kelepçe hantal ekipman ve minyatür, duyusal ve dönüşüm cihazlarının mühendislik için gerekli bir özellik için uygun değildir gerektirir. Onların basitlik, kararlılık ve kompakt nedeniyle Dıb&#39;leri MsCl aktivitesini incelemek için uygun bir ortam oluşturmaktadır. Burada, damlacıklar ve iki katmanlı arayüzü boyutunu her damla kimyasal kompozisyonunu ve dinamik uyarılması yoluyla arayüzünde gerginliği kontrol etme yeteneği ile, bir mikropipet tabanlı tekniği önererek DIB oluşum teknikleri önceki gelişmeler uzatmak. Tekniği eş eksenli cam kapilerleri karşıt uçlarına, proteoliposomes içeren sulu damlacıkları ankraj oluşur. Temas ara yüzeyde bir lipid iki katmanlı formları getirdi damlacıkları organik çözücünün bir banyoda üstüne yerleştirilmiştir. Mikropipetler p bağlandıklarıdamlacıkların, yatay yer değiştirmesine izin iezoelectric osilatörler. Dinamik Su-yağ ara yüzeyinde ara yüzey geriliminde bir artış ve bu nedenle iki tabakalı geriliminde bir artış damlacıklar sonuçları sıkıştırılması. İki önemli yönleri benzer ve yakın zamanda yayınlanan iletişim kabarcık iki tabakalı (CBB) tekniği 37 bu yöntemi ayırt. Burada sunulan tekniği kullanarak, iki katmanlı boyutu mikromanipülatörler kullanılarak kontrol edilir ve böylece damlacıklar hacimleri CBB yönteminde aksine, sabit kalır. Buna ek olarak, CBB tekniği daha basit ve inşa etmek kolaylaşır, bu yazıda sunulan yöntemde gerekli değildir basınç pompaları için çağırır. Biz birleştirmek ve bir yama pipet veya kimyasal modifikasyonlar 38 kullanılmadan ilk kez bakteriyel MsCl uyarabilen. Sistem sağlam asimetrik çift katlı lipid membranların oluşumunu kolaylaştırmaktadır beri, daha yakından l taklitBiyolojik membranların bulunan IPID asimetri. Bu MsCl aktivitesi kontrollü membran bileşimi ya da asimetri etkilerini incelemek için bize izin verir. Ayrıca, görüntü işleme teknikleri ile, bu yöntem iki tabakalı arayüzünde gerilimi tahmin etmenize yardımcı olur. DIB toplu ve yüzey kuvvetleri arasındaki interconversion prensiplerini anlamada Bu teknik asist, temel zar özelliklerinin ölçümleri kolaylaştırır ve gerginlik membran MsCl yanıtının anlayışı geliştirir. Bu yöntem MsCl incelemek için bir adım daha yakın biyomoleküler uyaranlara duyarlı malzeme sistemi doğru ve farklı fizyolojik ortama bizi alır da, sisteme sınırlamalar vardır. Bu sistemde Gerilim nedeniyle yağ / su ara yüzeyinde gerilimini azaltmak için, eğilimi her damla, lipozomların şeklinde lipid rezervuarın varlığı sıkıştırılır edilemez. Bu nedenle, bu mechanosensitive kanallarda stimüle edilebilirsadece dinamik bir rejimde Dıb&#39;leri bölgesindeki. Sistemdeki hava kabarcıklarının varlığı önemli ölçüde deney hassasiyet ve tekrarlanabilirlik etkiler. Hidrojeller mevcut hava kabarcıkları Elektrik bağlantısı varsa kaybına neden olabilir. Biz MsCl uyarılması için mikro-pipet bazlı yöntemin kullanımını tarif ederken, bu teknik MS kanalların diğer tip incelemek için kullanılan ve biyomoleküllerin çeşitli çalışma için araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere bir potansiyele sahip olabilir. Örneğin, benzer kurulum kanalsız damlacık arayüzü iki tabakalı zarın mekanoelektriksel tepkisini incelemek için laboratuarımızda kullanılmıştır. Çeşitli proteinler yeniden ve her biyomolekülün sulandırma ortamları farklılık göz önüne alarak, bu son derece kontrollü kurulumu kullanarak aktive edilebilir. Bu makalede açıklanan yöntemi yalnızca araştırmacı hayal gücünüzle sınırlı bir ölçüde geniş bir uygulama potansiyeline dokunur.

Son on yılda, yapay lipid iki katmanlı montajı ölçüde damlacık arayüzü iki tabakalı yönteminin geliştirilmesi yoluyla ileri olmuştur. Istikrarlı ve sağlam olarak bilinen, Dıb&#39;leri (Mueller) boyalı klasik ve katlanmış (Montal-Mueller) düzlemsel bilayers 1 alternatif model sistemler olarak kendilerini empoze. Lipit katmanlarını oluşturmak için damlacıkları kullanma fikri 1960&#39;larda 2 büyük olsa da, yakın zamana kadar popülerlik kazandı değildir. İlk başarılı girişim Bayley gruptan 4-6 damlacıkların bir ağ kullanarak iki tabakalı oluşumunu gösteren çeşitli çalışmalar takip Takeushi grubunda 3, tarafından rapor edilmiştir. Daha yakın zamanlarda, kapsülleme teknikleri yeni uyaranlara duyarlı malzeme sistemlerinin 10 yapı taşları olarak Dıb&#39;leri kullanarak kavramını öncülük Leo grubunun 7-9, tarafından önerilmiştir. Daha önceki çalışmalarda, Dıb&#39;leri elektrik 9,11, kimya yanıt yeteneklerini kanıtladılar10,12 ical ve optik uyaranlar 13. DIB 10,14 sulandırılmış zaman farklı uyaranlara duyarlı fonksiyonları ile çeşitli biyomoleküllerin etkin bir teşvik edilmiştir. Önemli bir soru ortaya çıkar bu başarılı girişimleri ışığında: mekanik uyarana cevap DIB, uygun biyomoleküllerin dahil edilmiştir ki? Bir DIB etkiyen arayüzey kuvvetleri diğer iki tabakalı sistem 15,16 olarak farklıdır. Bu nedenle, damlacıklar tarafından tutulan iki tabakalı gerilim Su-lipit yağ ara yüzlerinde gerilimin düzenlenerek kontrol edilebilir; boyalı veya katlanmış iki tabakalı sistemler ile uygulanamaz bir kavram. Yaygın osmolite bırakma vanaları ve bakteriyel sitoplazmik membran temel unsurları olarak bilinen MsCl kanalları, artan membran gerilimi 17,18 tepki. Hipo-osmotik şok durumunda, birkaç kanal küçük hücre membranında bulunan 19 mas oluşturabilirsive geçirgenlik tepkisi hızlı lizis 20 bakteri tasarruf iyonları ve küçük molekülleri serbest bırakmak için. Biyofizik, MsCl iyi incelenir ve belirgin yama kelepçe tekniği 21-23 ile öncelikle karakterizedir. MsCl en yolluk mekanizması 24,25 açıklayan Güvenilir yapısal modeller kendi homolog kristal 28 modelleme yapısı 26,27, ve kapsamlı deneylerle 24,29-31 sonuçlarına göre önerdi almaktadır. ~, Uygulanan gerilim altında 10 mN / m, zar geçiş sarmallarının sıkı bir demet oluşur kapalı kanal, bir p 28 bir su dolu ileten ve gözenekleri 21,24,32 oluşturan büyük ölçüde eğik sarmallarının bir halka dönüşür. Ayrıca, iç TM1 etki kesişme yerleştirilmiş sıkı bir kapının hidrofobiklik, kanal 33 aktivasyon eşiğini belirler olduğu tespit edilmiştir. Buna bağlı olarak, bulunmuştur ki, kapının hidrofobikliğini azaltarak, tension eşiği 22 indirdi olabilir. MsCl bu özelliği öncelikle ilaç dağıtım amaçlı çeşitli kontrol valfleri 34 tasarımı mümkün kıldı. Tüm yukarıda belirtilen özellikleri için ve elektrofizyolojik faaliyetler içine hücre zarı aşırı gerilimleri tercüme onun temel rolü dayalı MsCl Dıb&#39;leri bir mekanoelektriksel transdüser olarak büyük bir uyum yapar. Bu yazıda, mekanik uyarım altında birleşmiş MsCl kanallarının aktivitesini Dıb&#39;leri oluşturmak ve ölçmek için orijinal bir mikropipet tabanlı yöntem mevcut. Biz ilk defa, mekanik uyarıcı ve Dıb&#39;leri 35 içinde MsCI ve V23T düşük eşikli mutant fonksiyonel rekonstitüsyondan KYB&#39;lerin yanıt rapor. Deneysel sistem karşılıklı iki borosilikat cam mikropipet uçlarına sabitlenmiş lipid kaplı, sıvı damlacıklarının meydana gelir. Damlacıklar temas ettirildiği zaman, bir lipid iki katmanlı arayüzü fo olduğuonaylanmamis. Bu teknik, her damlacık (dökme) kimyasal bileşimi ve boyutu üzerinde kontrol, hem de iki tabakalı arayüzünün bir boyut sunar. Buna ek olarak, her bir broşür koşullarında çeşitli lipid bileşimleri ile asimetrik membranlar kolayca oluşturulabilir. , Harmonik piezoelektrik aktüatörün bağlanmış mikropipetler birine sahip bir önceden programlanmış tek siklus ya da titreşimli uyarıcı uygulamak olanağı sağlar. Gerginlik onu destekleyen hem damlacıkların sıkıştırma yoluyla yapay membran teslim edilir. Damlacık deformasyonun bir neticesi olarak, su-lipit yağlı arayüzler artış, ve aynı zamanda damlacıklar arasındaki açının alanları membran gerilimi ve geçici MsCl aktivasyonunda bir artışa neden azalır. Deformasyon sırasında damlaların şekil analizi sayesinde, ara yüzeyde oluşan gerilim tahmin edilebilir. Bu makaledeki odak DIB mekano-transdüksiyon özelliklerine olsa bile, biz de vurgulayan diğer tip biyoörneğin alamethicin gibi moleküller, bu çok fonksiyonlu platform tarafından aktive edilebilir. Biz hazırlanması montaj ve adım adım bir şekilde bu yeni yöntem ile ölçüm tüm teknik özellikleri, burada sunulmuştur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MsCl, büyük bir iletkenliğe mechanosensitive kanalı (MSC), bakteri ani hipo-osmotik şok hayatta yardımcı olan bir yerde osmolite salma valfidir. Keşfedilmiştir ve sıkı yaklaşık üç yıl için patch-clamp tekniği kullanılarak araştırılmıştır. Geçirgenliği yanıta hücre zarına uygulanan gerilme çevirme Temel rolü yapay membran bazlı biyomoleküler cihazlarda mekanoelektriksel transdüktör olarak işlev için güçlü bir aday yapar. Bu tür aygıtlara yapı blokları olarak hizmet veren, damlacık ara biriminde iki katlı tabakalar (Dıb&#39;leri) MsCl kanallarının dahil edilmesi ve uyarılması için yeni bir platform olarak kullanılabilir. Burada, ilave MsCl kanallarının aktivitesini Dıb&#39;leri oluşturulması ve ölçmek için bir mikropipet dayalı bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, iki karşılıklı (ortak eksenli bir konuma) borosilikat cam mikropipet uçlarına sabitlenmiş lipid kaplı, sıvı damlacıklarının meydana gelir. Damlacıklar temas ettirildiği zaman, bir lipid iki katmanlı arayüzükurdu. Bu teknik, kimyasal bileşime ve her bir damlacık boyutu üzerinde kontrol, hem de iki tabakalı arayüzünün bir boyut sunar. Harmonik piezoelektrik aktüatör bağlı mikropipetler birine sahip istenen salınım uyaran sunmak için yeteneği sağlar. Deformasyon sırasında damlaların şekil analizi sayesinde, ara yüzeyde oluşan gerilim tahmin edilebilir. Bu tekniği kullanarak, DIB sisteminde MsCl kanallarının ilk etkinlik bildirilmektedir. MS kanalları Bunun yanı sıra, kanalların diğer tip aktiviteler, bu platformun çoklu işlevselliğini kanıtlayarak, bu yöntem kullanılarak incelenebilir. Burada sunulan yöntem, temel zar özelliklerinin ölçümü sağlayan simetrik ve asimetrik membranların oluşumu üzerinde daha fazla kontrol sağlar ve teşvik ve mechanosensitive kanalları incelemek için alternatif bir yoldur.

1 Şekil ve çift katlı lipid membran mekanik uyarılması sırasında protein aktivitesini kaydetmek için 2 ekran deney düzeneği ve ekipman kullanılan. Bizim ölçümlerde içine elektriksel gürültü en aza indirmek için, iş istasyonu, bir laboratuvar yapımı Faraday kafesi içine yerleştirilir, Axopatch 200 B Amplifikatör bir toprak bağlantısına topraklı. Istikrarlı bir yalıtım çift katlı lipid oluşumu bu çalışmada önemli bir adımdır. Bu düzenlemede, bir lipit tek katmanlı bir organik çözücü bir banyo içerisine batırılmıştır, sıvı damlacıklarının yağ / su ara yüzeyinde toplanır. Damlacıklar temas halinde yerleştirilir, fazla yağ elendiği, ve bir iki molekül, kalın lipid ikili tabakasına göre karşıt bir lipid mono tabakalar, ince bir. Iki tabakalı karakterizasyonu kullanılan en yaygın tekniktir gerilim kelepçe olduğunu. Mevcut ölçülür ve voltaj-kelepçe ile, çift-tabakanın gerilimi sabit bir değerde muhafaza edilmektedir. Şekil 4 </strong&gt; İlk iki katmanlı oluşumunun tipik bir gerçek zamanlı akım kayıt canlandırıyor. Belirli kapasitans (~ 0.6 jxF / cm 2) DPhPC çift katlı lipid 5 bilen kurdu iki tabakalı alanı hesaplanabilir. Iki tabakalı alan damlacıkları (Şekil 4A) pozisyonunu değiştirerek kontrol edilebilir. Piezoelektrik erişim düzeneğini kullanarak, farklı frekanslarda, amplitüdleri ve görev çevrimlerinde dalga formu (sinüs, kare, üçgen, vb.) Farklı türleri, döner damlacıklar tatbik edilir ve eksenel olarak salınım ve böylece iki tabakalı gerilimi ve alan değişmiş olabilir olabilir (Şekil 4B). DIB mekanik olarak uyarıldığında zaman zarından sabit DC potansiyeli korurken, MsCl düşük eşik (kazanç fonksiyon-) V23T mutant ağırlıklı alt iletken devletleri ve bazen tam açılış etkinlikleri de dahil olmak üzere güvenilir faaliyetleri oluşturur (Şekil 5) . Bu evhastalar saflaştırılmış V23T MsCl ile yeniden sağlam iç E.coli membran ve lipozomlardan patch-clamp tekniği kullanılarak kaydedilen özdeştir. Şekil 5&#39;te sonuçlar mevcut tüm sivri tepe sıkıştırma gözlenmiştir, çünkü bu geçitleme, geriliminde bir artış tepki olarak ortaya çıkar kanıtlamaktadır. Pik sıkıştırma da damlacıkların göre alansal genişlemesi maksimumdur ve bu nedenle, ara yüzeyde gerilimi gözlenir. Bir DC gerilimi zar 36 boyunca uygulandığında Alamethicin bir voltaj kapılı iyon kanalı ve en çok çalışılan peptidlerin biri zar geçirgenliğini artırır. Transmembran proteinlerin ve peptidlerin barındırmak için lipid iki katmanlı arayüzünün becerisi aynı zamanda peptid alamethicin ile voltaj-akım kayıtları yolluk performans ile test edilir. Alamethicin 100 ng / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar fosfolipid çözeltisi ile karıştırılır. 6 kapsamında akım ölçümleri göstermektedir<html> gerilim kelepçe (115 mV). Bu deneyde, küçük damlacıklar iki katmanlı arayüzü ve böylece daha yüksek bir direnç ve daha küçük kapasitans elde etmek için ayrı çekilir. Alamethicin peptid yolluk davranışı akımı (Şekil 6) ayrık adımlarda gösterilir. Arsa sağ tarafındaki histogram temelde kanalın kendisinin birinci iletkenlik seviyesi taban seviyesine (0,0962 nS) &#39;dan iletkenlikteki değişiklik gösterir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> Şekil 1:. Ana bölümden ve yağ haznesi boyutları anlatan şematik yağ haznesi Virginia Tech makine dükkanında imal edilir. Bu akrilik levhanın yüzeyine yapıştırılmış bir işlenmiş silindirik akrilik tüptür. Boyutları ve tasarımı, farklı uygulamalar ve ikiden fazla mikropipetler uyum için değiştirilebilir./53362/53362fig1large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> Şekil 2:. Deneysel kurulum ve mikropipetler hazırlanması (A) mekanik şekillendirme uyarıcı ve arayüz bilayers tanımlamak için standart iş istasyonu bir mikroskop, 3-eksenli manipülatörler, bir dijital kamera, piezoelektrik osilatör, titreşim izolasyonu tablo ve Faraday kafesi içerir (gösterilmemiş). (B) Deney düzeneği yatay heksadekan bir yağ banyosu içine yerleştirilmiş iki karşılıklı PEG-DMA hidrojel dolu mikropipetler oluşur. Mikropipetler her elektrik bağlantısı sağlamak için bir Ag / AgCI elektrot içerir. Proteoliposome çözeltisi ile doldurulmuş bir üçüncü mikropipet diğer mikropipetler ucundaki damlacıkların meydana getirilmesi için kullanılır. (C) DIB geçerli yanıt ölçülebiliryama amplifikatörü ve düşük gürültü veri toplama sisteminin bir arada kullanarak. (D) A mikropipetlerin ucunda oluşan sulu damlacıklarını gösteren resmi kapattı. (E) Ag / AgCİ elektrotlar ağartıcı iki 250 | im&#39;lik gümüş tel ucu daldırma ile yapılır. Elektrodlar katılaşmaya UV ışığı ile sertleştirilir PEG-DMA hidrojel, dolu iki borosilikat cam kılcal damarlar yoluyla beslenir. Erkek konnektörü ile düz bir mikroelektrod tutucu yama amplifikatör headstage için mikropipetlerin biri bağlamak için kullanılır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> Şekil 3:. Damlacık arayüz iki katmanlı oluşumunu gösteren resim (A) proteoliposomes dolu bir 10 um mikropipet mikropipet uçları yakınına mikroskop altında konumlandırılır. Mikropipet bağlı bir şırınga kullanarak, küçük hacimli dağıtımproteoliposomes istenen hacme misket şeklinde olan damlaların oluşturulması için. Damlacıklar on dakika oturmak için izin vererek tek tabakalı formu edelim. Temas damlacıkları getirin; arayüzde tüm petrol elimine edilir sonra iki tabakalı oluşturacaktır. Iki tabakalı oluşturulduğu birlikte, arayüz her iki kimyasal bileşimi, bir mikro-boyutlu mikropipet kullanılarak arzu edilen kimyasal enjekte edilmesiyle kontrol edilebilir (B). (C) ilk temas anında damlacıkları. (D) lipid iki katmanlı oluşturulur damlacıkları. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> Şekil 4: Gerçek zamanlı ölçümleri ilk incelme ve arayüz sonraki genişleme hem de gösteren bir üçgen elektrik potansiyelin uygulanması yoluyla iki tabakalı oluşumu sırasında ölçülen (A) Akım.. Ölçülen akımın büyüklüğü Capaci ile doğru orantılıdırmesafe, ve iki katmanlı arayüzü böylece alanı. Arayüzü ve tersi alanı daha büyük damlacıklar bir araya getirilir yakın. Mekanik uyarma uygulanması üzerine (B), iki tabakalı bir arayüz artar alanı ve uyarıcı sinyali ile aynı frekansta azalır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> Şekil 5:. Gerçek zaman ölçümleri, mekanik uyarma ile iki katmanlı bir yanıt olarak MsCl bir V23T mutantı yolluk göstermektedir mevcut yanıt şekli sonucunda iki tabakalı kapasitans bir sinüzoidal bir değişiklik ile de ilgilidir sinüzoidaldır iki tabakalı alan değişikliği. Geçerli sivri, her döngünün zirvesinde ortaya çıkan, V23T mutant alt iletkenlik yolluk gösterir. Diğer bir kutupsal yolluk iki tabakalı arayüzünde geriliminde bir artışı yansıtır pik sıkıştırma meydana gösterir. Şekil 6:. Voltaj kelepçe ve anonim Alamethicin kanallarının yolluk aktivitesi için iletkenlik seviyeleri gelen histogram altında Akım ölçümleri Alamethicin peptid yolluk davranışı akımında ayrı aşamalı bir artış ile gösterilir. Iletkenlik seviyeleri Virginia Tech 7 bizim araştırma grubu tarafından yapılan daha önceki ölçümlerle çok iyi maç.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Bakteriyel mechanosensitive kanallar biyomoleküler cihazlarda mekanoelektriksel dönüştürücüler olarak kullanılabilir. Damlacık arayüz bilayers (Dıb&#39;leri), bu tür cihazlara hücre ilham yapı blokları, birleştirmek ve mechanosensitive kanallar teşvik etmek, yeni platformlar temsil etmektedir. Burada, biz, Dıb&#39;leri oluşturan mekanik stimülasyonu altında mechanosensitive kanalların çalışma izin yeni bir mikropipet tabanlı bir yöntem göstermektedir.

Çok fonksiyonlu, Damlacık Arayüz Bilayers Bakteriyel Mechanosensitive İyon Kanallarının Kuruluş Ve Uyarım için Yöntemi Mikropipet tabanlı

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Elektrofizyoloji Deneyler Yapay Bilayers hazırlanması

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

İnsan bağırsak mukozasının eksplantlar Kültür ve Polarize Uyarım için Yeni Bir Yöntem

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...