Name: bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the arabidopsis thaliana-pseudomonas syringae pathosystem
Uploaded: 2015-10-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem at JoVE

We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.

Følgende tekst beskriver en trinnvis protokoll for å utføre optimalisert Psm ES4326 sprøyte infiltrasjon analysen i Arabidopsis. De viktigste prosedyrer for denne analysen er vist i et forenklet flytdiagram (figur 1). 1. plantevekst betingelser <ol><li> Sår frø <ol><li> Forbered 2 Potter (4 i diameter, 3,75 i høye) løst fylt med jord og vann potter ved å dyppe dem fra bunnen O / N før du tømmer overflødig vann. </li><li> Sow 50-100 Arabidopsis frø, vi...

Med avtagende tilgjengelig jordbruksareal og økende befolkning, er forskere rundt om i verden utfordret med presserende behov for avling forbedring. Utbyttet kan bli sterkt påvirket av ulike biotiske og abiotiske påkjenninger. Blant dem er patogen smitte en av de viktigste årsakene til avling reduksjon, ansvarlig for omtrent 12% tap i USA alene 45. For å løse dette problemet, har massiv forskning utført i modellen Arabidopsis - P. syringae pathosystem til omfattende karakterisere komponenter o...

På grunn av deres fastsittende natur, planter stadig truet av en mengde patogener stiller ulike livsstiler og ernæringsmessige strategier 1. Til en første tilnærming, biotrophic patogener opprettholde sin verten i live for å hente næringsstoffer, mens necrotrophic patogener aktivt hemmelige giftstoffer og enzymer for å drepe verten vev og lever av døde celler 1. En annen gruppe av patogener, betegnes hemibiotrophs begynner sin infeksjon kurs med biotrophic scenen og skift til necrotrophic scenen ved oppnådd en viss terskel for patogen opphopning to. For effektivt å forsvare seg mot disse mikroorganismer, planter har utviklet seg en komplisert medfødte immunsystemet utstyrt med flere overvåkningsmekanismer for å detektere patogene angrepet og utløse lokalisert programmert celledød 3 samt systemisk ervervet resistens (SAR) 4. Aktuell forskning er fokusert på å karakterisere den essensielle signaling komponenter og kryss-forhandlingene i anlegget immunsystemet 5. Som foreslått i &quot;sikk-sakk&quot; modell 5, det første laget av anlegget medfødte immunrespons krever tilstedeværelse av plasmamembran-lokaliserte mønstergjenkjenning reseptor (PRRS) for å detektere invasjonen av en mikrobe. PRRS er i stand til å gjenkjenne mikrobe-Associated Molecular Patterns (MAMPs) og etablere MAMP utløste immunitet (MTI) 6. I tillegg til å indusere en transkripsjons oppregulering av gener som koder for antimikrobiell PR-proteiner 7, fører MTI til en rekke hendelser som arrest patogen vekst, inkludert produksjon av reaktive oksygen arter (ROS) og reaktive nitrogenforbindelser (RNS), avsetning av callose til celleveggen så vel som aktivering av flere kinase signalveier 8. Inntil nå har flere MAMPs blitt identifisert til å utløse MTI i Arabidopsis, inkludert bakteriell flg22 9 </sup&gt; (En 22 aminosyre-fragment avledet fra flagellin), elf18 10 (18 aminosyrer fra det bakterielle oversettelses elongeringsfaktor Tu) og et strukturelt celleveggkomponent 11 peptidoglykaner. Å etablere en vellykket infeksjon, har noen spesialiserte patogener utviklet evnen til hemmelige virulens effektor proteiner i de intracellulære eller mellomrom mellom, og dermed undertrykke MTI og utløse Effector utløste Følsomhet (ETS) 12,13. For eksempel kan virulens effektorer inaktivere mitogenaktiverte Protein kinase (MAPK) fosforyleringsseter kaskader av MTI å indusere sykdom utvikling innen infisert vev 14-16. Under den dynamiske co-evolusjon mellom vertene og patogener, planter også utviklet Kontringen strategi for å gjenkjenne effektor proteiner og dempe patogenet virulens molekyler 17. Denne direkte eller indirekte effektor anerkjennelse formidles av sykdom motstand (R) proteiner 18. Mesteparten av them er medlemmer av NB-LRR (Nucleotide innbinding og leucine-Rich repriser) familie 19. Oppfatningen av en avirulent effector av en R protein utløser en sterkere og bredere immunrespons karakterisert som Effector utløste immunitet (ETI) 20. Foruten å indusere uttrykk for forsvarsgener 21 og produksjon av forsvars metabolitter 22, fører ETI ofte til en rask lokalisert programmert celledød kalles Overfølsom Response (HR) for å begrense patogenet spre seg i nærliggende vev tre. I tillegg til den lokaliserte programmert celledød 23 planter er i stand til å initiere et langsiktig og system-wide immunrespons kalt Systemisk tilegnet resistens (SAR) 4. Ved utfordring med en biotrophic patogen, planteceller utløse biosyntese og akkumulering av en endogen phytohormone salisylsyre (SA) og PR-proteiner i både lokale og systemiske vev 24. Gjennom thans prosess blir en økt tilstand av beredskap oppnådd i de ikke-infiserte blader som gjør det mulig for montering hurtigere forsvar svar i løpet av en etterfølgende infeksjon av et bredt spekter av patogener 24. SA og dets syntetiske analoger som for eksempel benzo- (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioic syre S-methylester (BTH) og 2,6-diklorisonikotinsyre (INA) er i stand til kjemisk å indusere Salisylsyre (SA) -Triggered immunitet (STI) ved eksternt program 24. Nonexpressor av patogeneserelaterte gener 1 (NPR1) er foreslått å være en av de SA reseptorer og fungerer som en viktig transcriptional regulator under SA-mediert forsvar respons i både lokale og systemiske vev 21,25,26. Det har entydig vist at NPR1 kreves for SAR etablering og tap av NPR1 fører til dramatiske mottakelighet mot Pseudo syringae 25. Til omfattende karakterisere molekylære bidrag av plantekomponenter i anlegget-patogen interaksjoner, har flere bioassay blitt utviklet for å måle spesifikke forsvars hendelser, herunder ROS brast 27 callose deponering 28, forsvarsgener uttrykk og akkumulering av sine protein produkter 21. Mens disse individuelle analyser kan gi innsikt i en spesifikk form av anlegget immunrespons, er ingen av dem, men er i stand til å representere hele forsvaret respons på hele anlegget nivå. Motsatt, kvantifisering av patogen vekst etter infeksjon gir en samlet beregning av immunrespons på organismenivå. Derfor er kritisk til drivstoff opp forskning og funn på Arabidopsis immunresponser utvikling og optimalisering av en presis og svært standardisert patogen vaksinasjon analysen. Pseudomonas syringae, en Gram-negativ bakterie, ble identifisert som en phytopathogen stand til å forårsake sykdom hos et utvalg plante verter, inkludert Arabidopser 29. Ettersom modellen plante-patogen system, Arabidopsis - P. syringae samhandling har blitt mye brukt til å forstå de molekylære mekanismene bak plante forsvar svar 29. Inntil nå, over 50 P. syringae pathovars har blitt identifisert basert på deres evne til å infisere forskjellige plantearter 30 . P. syringae pv. tomat DC3000 (Pst DC3000) 31 og P. syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) 32 er de to mest brukte og utstrakt preget virulente stammer. Bortsett fra å bli anerkjent av anlegget og utløser MTI respons, Pst DC3000 og Psm ES4326 er i stand til å skille ut virulente effektor proteiner for å undertrykke MTI og utløse ETS å favorisere patogenet vekst 31,33. Til funksjonelt dissekere samspillet mellom Arabidopsis og P. syringae, multippel0; patogen infeksjon metoder har blitt utviklet basert på patogen levering tilnærming. For jord dyrket planter, kan patogen leveres med sprøyte infiltrasjon, vakuum infiltrasjon, dip vaksinasjon og spray inokulasjon 29,34. Nylig ble frøplante flom-vaksinasjon analyse utviklet til å utføre store skjermer på vevskulturplater voksen unge Arabidopsis planter 35. Sprøyte infiltrasjon, som en av de mest brukte metode, leverer patogenet inn i apoplast gjennom naturlig bladåpningene betegnet stomata 29 manuelt. Gjennom denne tilnærmingen, like mengder P. syringae kan infiltreres inn i den infiserte blad og styrken av anlegget immunrespons er inverst korrelert til de patogen vekstnivåer. Derfor kvantifisering av patogen vekst tjener som en optimal tilnærming for å vurdere immunfunksjonen hos hele anlegget nivå. I tillegg kan sprøyte infiltrasjon skille de lokale og systemiske vev, noe som kan be anvendelig for å karakterisere de molekylære mekanismer som ligger under SAR-36. I det følgende protokollen, beskriver vi en optimalisert sprøyte infiltrasjon analysen med Psm ES4326 å skjerme Arabidopsis mutanter for økt sykdom mottakelighet (EDS). Denne protokollen vil ansette to Arabidopsis genotyper: en vill-type ecotype Columbia-0 (Col-0) planter (kontroll) og npr1-1 tap-av-funksjon mutanter (hypersusceptible) som vil bli smittet med virulent bakteriestamme Psm ES4326 37. Den npr1-1 mutant bærer en punktmutasjon i det ankyrin-repeat konsensussekvensen til NPR1 molekylet, som endrer den svært konserverte histidin til tyrosin og gjengir protein som ikke er funksjonelt 25. I tillegg er en rekke modifikasjoner av sprøyten infiltrasjons analysen beskrevet som tillater kvantifisering av defekter i de enkelte lag av immunresponsen, inkludert MTI og STI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MetroMix 360&#160;</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>SNGMM360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large pots</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>TEKUVCC10TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x6 Inserts</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11x21 Flats with no holes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11x21 Flats with holes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1020H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl propagation domes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>CW-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0122-17-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>151946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>SB0494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150x15mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R80150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-450&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Hexahydrate</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>MB0328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>MN1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9992493&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding tubes&#160;</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>B1257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for grinding tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>B1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Salicylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>s3007-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>Made to order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>Made to order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td>146308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>952000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen High-Throughput Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu spin micro centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (10-100 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122 000.043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (30-300&#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122 000.060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (20&#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120 000.038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3552-HR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpie permanent marker</td>
			<td>Staples</td>
			<td>507130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-890</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the arabidopsis thaliana-pseudomonas syringae pathosystem

I fravær av spesialiserte mobilimmunceller, planter utnytte sine lokaliserte programmert celledød og Systemisk tilegnet resistens å forsvare seg mot patogen angrep. Bidraget fra en bestemt Arabidopsis gen til den samlede anlegget immunrespons kan være spesielt og kvantitativt vurdert av analysering patogenet vekst innenfor infisert vev. I over tre tiår har hemibiotrophic bakterien Pseudo syringae pv. Maculicola ES4326 (Psm ES4326) blitt mye brukt som modell patogen å undersøke de molekylære mekanismene bak Arabidopsis immunrespons. Å levere patogener i bladet vev, har flere inokulerings metoder er etablert, for eksempel sprøyte infiltrasjon, dip vaksinasjon, spray, vakuum infiltrasjon, og flom vaksinasjon. Følgende protokoll beskriver en optimalisert sprøyte infiltrering metode for å levere virulente Psm ES4326 inn i bladene av voksenjord dyrket Arabidopsis planter og nøyaktig screene for økt sykdom mottakelighet (EDS) mot dette patogenet. I tillegg kan denne protokollen bli supplert med flere pre-behandlinger for å ytterligere dissekere spesifikke immundefekter innenfor ulike lag av planteforsvar, inkludert Salisylsyre (SA) -Triggered immunitet (STI) og MAMP utløste immunitet (MTI).

Protokollen vi beskriver her representerer en optimalisert P. syringae sprøyte infiltrasjon assay for kvantitativt å vurdere immunresponsen i Arabidopsis planter. Som illustrert i figur 1, er sprøyten infiltrasjon av Psm ES4326 fulgt av patogen ekstraksjon og kvantifisering via serielle fortynninger og kolonier telling. Som beskrevet i trinn 3 i protokollen teksten, kan Enhanced Disease Følsomhet (EDS) mot Psm ES4326 vurderes ved infek...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem at JoVE

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Bakteriell Leaf Infiltrasjon analysen for Fine Karakterisering av Plant forsvar svar bruker<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudo syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Plant Biology

Plant Responses to the Environment

SCIENTISTS IN ACTION

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern PAMP-Triggered Immunity PTI in Plants

To perceive potential pathogens in their environment, plants use pattern recognition receptors (PRRs) present on their plasma membranes. PRRs recognize ...

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakteriell Toxin Utførte Responses ved hjelp av Live Cell fluorescensmikroskopi

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemisk bakteriell infeksjon og immunforsvar fenotyper i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Påføring av Long-term kultivert Interferon-γ Enzyme-linked immunospot analyse for Assessing Cell Responses Effector og Memory T i Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakteristikk av Thymus avhengig og uavhengig av Thymus immunglobulin Isotype svar i mus med enzym knyttet Immunosorbent analysen

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Bruke en bakteriell patogen Probe for mobilnettet og Organismic-nivå vert svar

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic drepe analysen å vurdere immunologiske svar mot bakteriell patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...