Name: three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها المعاهد الوطنية للصحة منح K08 NS061039-01A2، "البرنامج" "أبحاث الأمراض العصبية" &#38; الاكتشاف، وا الفريد توبمان معهد الأبحاث الطبية في جامعة ميشيغان. هذا العمل المستخدمة في مورفولوجيا وصورة التحليل الأساسية لمركز أبحاث مرض السكري ميشيغان، تموله "المعاهد الوطنية للصحة منحة" 5 ف 90 كمبوتشيا الديمقراطية-20572 من المعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي وأمراض الكلي. الكتاب يود أن يشكر ج. روبنسون المفرد وألف غوردون سميث (جامعة يوتا) على التبرع السخي من عينات الجلد البشري.

تم الحصول على خزعات الجلد لكمه من المواضيع التي تم تجنيدهم من شبكة كبيرة من رعاية الأولية المستندة إلى المجتمع المحلي في مركز السكري جامعة يوتا (سولت لايك سيتي، يوتا). هذه الدراسة التي وافق عليها مجلس جامعة ميشيغان الاستعراض المؤسسي والامتثال لمبادئ "إعلان هلسنكي". كتب تم الحصول على الموا?...

ويهدف هذا البروتوكول إلى عزل وتحديد وتحليل حجم وتوزيع الميتوكوندريا العصب على حدة داخل إيينفس في 3D من خزعات الجلد البشري. وهناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول. تم تصميم إيمونوهيستوتشيميستري fluorescence التعويم الحر لوصمة عار وتحليل إشارات متعددة في كل عينة، تقديم منهجية أكثر تنوعاً ل...

الميتوكوندريا تخدم الوظائف الخلوية الحيوية التي تشمل إنتاج طاقة الخلية، التخزين المؤقت الكالسيوم، وتنظم نخرية و apoptotic خلية الموت1،،من23. الجهاز العصبي، ارتفاع معدل الأيض مقارنة ب الجسم4 ، مما يوحي بأن الخلايا العصبية تولد درجة عالية من الطاقة الخلوية في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق التنفس المتقدرية. هناك كثير من وثائق الإثبات أن وظائف الخلايا العصبية تعتمد على ATP5، لا سيما في نهايات6. ولذلك، من المهم توزيع الميتوكوندريا في الخلايا العصبية.
الغاية ينظم على مدى السنوات العشر الماضية كثير من المعلومات قد أظهرت أن الاتجار بالأشخاص والتحام الخلايا العصبية الميتوكوندريا. وتشارك البروتينات موتور في توزيع الميتوكوندريا إلى مقصورات الهاتف الخلوي محددة في جميع أنحاء العصبية. الاتجار في الميتوكوندريا بأهمية خاصة نظراً لأن الخلايا العصبية المشروع محاور عصبية و dendrites بعيداً عن سوما. المقام الأول المباشر البروتينات موتور Kinesin anterograde (بعيداً عن سوما) الاتجار في الميتوكوندريا على طول microtubules بينما دينين البروتينات موتور الحركة الرجعية (نحو سوما) مباشرة7،8،9 , 10-وهناك الإشارات الخلوية هذا غشاء الميتوكوندريا المحتملة والتوصيل الاندفاع التي تؤثر على وجود واتجاه المتقدرية الاتجار11،،من1213.
بالإضافة إلى نقل الميتوكوندريا، هناك بروتينات متخصصة لتعريب الميتوكوندريا إلى مقصورات الهاتف الخلوي محددة التي لها مطالب الطاقة العالية، مثل رانفييه للعقد ونهايات8،14، 17-والواقع أن أغلبية الميتوكوندريا ضمن محاور عصبية من غير متحركة9،،من1318. البروتينات المتخصصة مثل الميتوكوندريا مرساة سينتافيلين إلى ميكروتوبوليس على طول محاور عصبية بينما البروتينات الأخرى الارتساء الميتوكوندريا أكتين سيتوسكيليتون19–21. أبلغ عوامل النمو والايونات مثل الكالسيوم لدعم وقف حركة الميتوكوندريا إلى ترجمة لها إلى المناطق التي تكون فيها الحاجة إليها21،،من2223.
مجتمعة، بالاتجار بالبشر والارساء من الميتوكوندريا حيوية بالنسبة لوظيفة مناسبة للخلايا العصبية. ودعما لهذه الاضطراب في الاتجار المتقدرية ارتبط مع ظروف عصبية عدة بما في ذلك مرض الزهايمر، التصلب العضلي الجانبي، شاركو-ماري الأسنان المرض، ومرض هنتنغتون، وراثية التشنجي خزل سفلي، وضمور الألياف البصرية15،،من2425،،من2627. ركزت الدراسات التي أجريت مؤخرا على خلل mitochondrial وعلم الأمراض كآلية محتملة لاعتلال الأعصاب السكري، فقدان الحواس المرتبطة بمرض السكري28،،من2930،31 ،،من3233. الافتراض أن مرض السكري يغير توزيع الميتوكوندريا ضمن إسقاطات حسية تنتهي الأعصاب الجلدي. ولذلك، تم تطوير تقنية لتصور وتحديد حجم الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال (إيينفس)، نصائح القاصي من العقدة الجذر الظهرية أفيرينتس الحسية. الأسلوب الذي يجمع بين immunohistochemistry الأسفار الخاصة mitochondrial وتسميات الألياف العصبية مجهرية [كنفوكل] اقتناء ض سلسلة من الإشارات مع برمجيات التحليل صورة 3D قوية لقياس توزيع العصب على حدة الميتوكوندريا من خزعات لكمه الجلدية البشرية لتحقيق هذا الهدف.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:267px;">2% Zamboni&#39;s Fixative</td>
			<td style="width:200px;">Newcomer Supply, Middleton, WI&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1459A</td>
			<td style="width:363px;">2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">BP399-4</td>
			<td style="width:363px;">To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:267px;">Image-iT FX Signal Enhancer</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">I36933</td>
			<td style="width:363px;">enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:267px;">Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td style="width:200px;">Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td>
			<td style="width:199px;">14730-1-AP</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:267px;">Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td>
			<td style="width:200px;">abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:199px;">ab110333</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PDH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11034</td>
			<td style="width:363px;">red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11032</td>
			<td style="width:363px;">green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:267px;">Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">A7906-100</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as BSA</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">Triton X- 100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">T9284</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as TX-100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:267px;">0.22 &#181;m Filter</td>
			<td style="width:200px;">EMD Millipore, Billerica 
			MA</td>
			<td style="width:199px;">MILLEX GP SLGP 033NS</td>
			<td style="width:363px;">0.22 &#181;m Millipore filter</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">13-374-10</td>
			<td style="width:363px;">Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Non-calibrated Loop</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">22-032092</td>
			<td style="width:363px;">inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">96-well Assay Plate</td>
			<td style="width:200px;">Corning Incorporated, Corning, NY</td>
			<td style="width:199px;">3603</td>
			<td style="width:363px;">96-well flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">P-36931</td>
			<td style="width:363px;">DAPI staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:267px;">Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-544E</td>
			<td style="width:363px;">Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-550-15</td>
			<td style="width:363px;">Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:267px;">Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td style="width:200px;">Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">SP5</td>
			<td style="width:363px;">Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Volocity x64 Software&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Perkin Elmer, Waltham , MA</td>
			<td style="width:199px;">version 4.4.0</td>
			<td style="width:363px;">Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td>
			<td style="width:200px;">Bitplane, Concord, MA</td>
			<td style="width:199px;">version 7.7.1</td>
			<td style="width:363px;">Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:267px;">Excel</td>
			<td style="width:200px;">Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td style="width:199px;">version Office 2013</td>
			<td style="width:363px;">Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">Optimum Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:200px;">Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td>
			<td style="width:199px;">4583</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as OCT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Leica Cryostat</td>
			<td style="width:200px;">Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">CM1850</td>
			<td style="width:363px;">Cryostat for cutting 50 &#181;m sections</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">C10600</td>
			<td style="width:363px;">Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

والهدف من هذا البروتوكول دراسة الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال. ولذلك، تم تطوير تقنيات تصوير وتحليل 3D لعزل الميتوكوندريا العصب على حدة وتقييم التعديلات التي يسببها مرض الميتوكوندريا في تلميح القاصي من الأعصاب الحسية. يجمع البروتوكول immunohistochemistry الأسفار والفحص المجهري [كنفوكل] وتقنيات تحليل الصور الثلاثية الأبعاد لتصور وتحديد حجم الميتوكوندريا العصب على حدة. يتم تعريف المعلمات مفصلة طوال الإجراءات بغية تقديم مثالاً ملموسا على كيفية استخدام هذه التقنيات لعزل الميتوكوندريا العصب على حدة. الأجسام المضادة استخدمت لتسمية العصب وإشارات المتقدرية داخل أقسام الأنسجة الجلد لكمه الخزعات، الذي أعقب الفلورة غير المباشرة وضع تصور للأعصاب والميتوكوندريا مع إشارة فلورية الخضراء والحمراء على التوالي. الصور ض سلسلة تم الحصول عليها مع الفحص المجهري [كنفوكل] وتم استخدام برمجيات التحليل ثلاثي الأبعاد لمعالجة وتحليل الإشارات. فإنه ليس من الضروري لمتابعة المعلمات المحدد وصف داخل، ولكن من المهم أن تكون متسقة مع تلك التي اختارت في جميع أنحاء تلطيخ، اقتناء وتحليل الخطوات. أن قوة هذا البروتوكول هو أنها تنطبق على مجموعة متنوعة من الظروف حيث يتم استخدام إشارة الفلورسنت واحدة لعزل الإشارات الأخرى التي وإلا سيكون من المستحيل لدراسة وحدها.

والتصور والتقدير الكمي الميتوكوندريا داخل إيينفس البشرية
إيمونوهيستوتشيميستري fluorescence يسمح للعلامات المتزامنة لإشارات متعددة داخل خزعات الجلد البشري لتصور الأعصاب، الميتوكوندريا، ونوى. صفيحة 96-جيدا طريقة ملائمة لتنظيم الخطو...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

هذا البروتوكول يستخدم تقنيات التصوير والتحليل (3D) ثلاثي الأبعاد لتصور وتحديد حجم الميتوكوندريا العصب على حدة. التقنيات قابلة للتطبيق على حالات أخرى حيث يتم استخدام إشارة الفلورسنت واحدة لعزل مجموعة فرعية بيانات من آخر إشارة الفلورسنت.

تصوير ثلاثي الأبعاد وتحليل الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال البشرية

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

تحضير الأنسجة وImmunostaining من الألياف العصبية الحسية ماوس التعصيب الجلد والعظام الاطراف

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Three Dimensional Vestibular Ocular Reflex Testing Using a Six Degrees of Freedom Motion Platform

ثلاثي الأبعاد الدهليزي العيني اختبار رد الفعل باستخدام ست درجات من الحرية منصة الحركة

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

انتقائية للبحث عن المفقودين من ألياف العصب السمعي في الطيور الدهليزي القوقعي الجنينية

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

تصوير ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع من المنظمة الخلوية في اللحاء الجديد الماوس

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

نمذجة الاشكال ثلاثية الابعاد وتحليل هياكل المخ

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

استهداف المجاميع ألفا سينوكلين في ألياف الأعصاب الطرفية الجلدية عن طريق اختبار المناعة العائمة الحرة

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D تحليل الحركية للتقييم الوظيفي في نموذج الفئران من عرق النسا الأعصاب سحق الإصابة

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

التصوير والتحليل لنقل الليفية العصبية في العصب الذبي الماوس المخزّن

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...