Name: three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed tilskud K08 NS061039-01A2, The Program for neurologi forskning &#38; opdagelse, og den A. Alfred Taubman Medical Research Institute på University of Michigan. Dette arbejde anvendte morfologi og billede analyse kernen i Michigan Diabetes Research Center, finansieret af National Institutes af sundhed Grant 5P 90 DK-20572 fra National Institute for Diabetes og Digestive og nyresygdomme. Forfatterne vil gerne takke J. Robinson Singleton og A. Gordon Smith (University of Utah) for deres generøse donation af menneskelige hud prøver.

hud punch biopsier blev indhentet fra emner, der blev rekrutteret fra et stort community-baseret primær pleje netværk på University of Utah Diabetes Center (Salt Lake City, UT). Denne undersøgelse blev godkendt af University of Michigan institutionelle Review Board og overholdt grundsætningerne af Helsinki-erklæringen. Skrevet blev indhentet informeret samtykke fra hvert emne før afprøvningstidspunktet.
 1. fluorescens Immunhistokemi <ol><li>Forbered punch biopsier for intra...

Denne protokol er designet til at isolere, kvantificere og analysere størrelse og fordeling af nerve-specifikke mitokondrier inden for IENFs i 3D fra menneskelige hud biopsier. Der er flere kritiske trin i protokollen. Frit svævende fluorescens Immunhistokemi er designet til at pletten og analysere flere signaler i hver prøve, at give en mere alsidig metodologi for udforskende forskning44,45. Denne procedure giver mulighed for indtrængen af antistoffer i væv...

Mitokondrier tjene vitale cellulære funktioner, der omfatter produktion af celle energi, buffering calcium, og regulering af nekrotisk og apoptotiske celle død1,2,3. Nervesystemet har en høj stofskifte i forhold til kroppen4 tyder på, at neuroner generere en høj grad af cellulære energi i form af adenosin trifosfat (ATP) gennem mitokondrie respiration. En masse beviser dokumenter at neuronal funktioner er afhængige af ATP5, især på synapser6. Fordelingen af mitokondrier i neuroner er derfor vigtig.
I de sidste 10 år en masse oplysninger har vist, at menneskehandel og docking af neuronal mitokondrier er stærkt reguleret. Motor proteiner er involveret i distribution af mitokondrier til specifikke cellulære rum i hele neuron. Handel med mitokondrier er især vigtig, fordi neuroner projekt axoner og dendrites langt væk fra soma. Kinesin motor proteiner direkte primært anterograd (fra soma) handel med mitokondrier langs mikrotubuli mens dynein motor proteiner direkte retrograd (mod soma) motilitet7,8,9 , 10. der er trådløse signaler sådan mitokondrielle membran potentiale og impuls overledning, der påvirker tilstedeværelsen og retning af mitokondrie menneskehandel11,12,13.
Ud over transport af mitokondrier, er der specialiserede proteiner til at lokalisere mitokondrier til specifikke cellulære rum, der har høj energi krav, som noder af Ranvier og synapser8,14, 17. I virkeligheden, fleste af mitokondrier i axoner er ikke-motile9,13,18. Specialiserede proteiner som syntaphilin anker mitokondrier at mikrotubuli langs axoner mens andre proteiner anker mitokondrier til aktin cytoskeleton19-21. Vækstfaktorer og ioner som calcium er blevet rapporteret til at støtte ophør af mitokondrier bevægelse at lokalisere dem til regioner, hvor de nødvendige21,22,23.
Tilsammen, er menneskehandel og docking af mitokondrier afgørende for korrekt funktion af neuroner. Til støtte for dette, har forstyrrelser i mitokondrie handel været forbundet med flere neurologiske tilstande herunder Alzheimers sygdom, amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sygdom, Huntingtons sygdom, arvelig spastisk paraparesis, og optisk atrofi15,24,25,26,27. Nylige undersøgelser har fokuseret på mitokondriel dysfunktion og patologi som en potentiel mekanisme for diabetisk neuropati, sensorisk tab forbundet med diabetes28,29,30,31 ,32,33. Hypotesen er, at diabetes ændrer fordelingen af mitokondrier i de sensoriske fremskrivninger af kutane nerve slutter. Derfor, en teknik blev udviklet for at visualisere og kvantificere mitokondrier i intraepidermal nerve fibre (IENFs), de distale tips af dorsalrods ganglion sensoriske afferenter. Teknikken kombinerer fluorescens Immunhistokemi specifikke mitokondrie og nerve fiber etiketter med konfokalmikroskopi z-serie erhvervelse af signaler med kraftige 3D billede analyse software til at måle fordelingen af nerve-specifikke mitokondrier fra menneskelige kutane punch biopsier at nå dette mål.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:267px;">2% Zamboni&#39;s Fixative</td>
			<td style="width:200px;">Newcomer Supply, Middleton, WI&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1459A</td>
			<td style="width:363px;">2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">BP399-4</td>
			<td style="width:363px;">To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:267px;">Image-iT FX Signal Enhancer</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">I36933</td>
			<td style="width:363px;">enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:267px;">Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td style="width:200px;">Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td>
			<td style="width:199px;">14730-1-AP</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:267px;">Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td>
			<td style="width:200px;">abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:199px;">ab110333</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PDH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11034</td>
			<td style="width:363px;">red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11032</td>
			<td style="width:363px;">green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:267px;">Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">A7906-100</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as BSA</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">Triton X- 100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">T9284</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as TX-100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:267px;">0.22 &#181;m Filter</td>
			<td style="width:200px;">EMD Millipore, Billerica 
			MA</td>
			<td style="width:199px;">MILLEX GP SLGP 033NS</td>
			<td style="width:363px;">0.22 &#181;m Millipore filter</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">13-374-10</td>
			<td style="width:363px;">Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Non-calibrated Loop</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">22-032092</td>
			<td style="width:363px;">inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">96-well Assay Plate</td>
			<td style="width:200px;">Corning Incorporated, Corning, NY</td>
			<td style="width:199px;">3603</td>
			<td style="width:363px;">96-well flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">P-36931</td>
			<td style="width:363px;">DAPI staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:267px;">Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-544E</td>
			<td style="width:363px;">Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-550-15</td>
			<td style="width:363px;">Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:267px;">Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td style="width:200px;">Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">SP5</td>
			<td style="width:363px;">Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Volocity x64 Software&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Perkin Elmer, Waltham , MA</td>
			<td style="width:199px;">version 4.4.0</td>
			<td style="width:363px;">Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td>
			<td style="width:200px;">Bitplane, Concord, MA</td>
			<td style="width:199px;">version 7.7.1</td>
			<td style="width:363px;">Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:267px;">Excel</td>
			<td style="width:200px;">Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td style="width:199px;">version Office 2013</td>
			<td style="width:363px;">Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">Optimum Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:200px;">Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td>
			<td style="width:199px;">4583</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as OCT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Leica Cryostat</td>
			<td style="width:200px;">Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">CM1850</td>
			<td style="width:363px;">Cryostat for cutting 50 &#181;m sections</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">C10600</td>
			<td style="width:363px;">Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

Målet med denne protokol er at studere mitokondrier i intraepidermal nervefibre. Derfor blev 3D imaging og analyse teknikker udviklet for at isolere nerve-specifikke mitokondrier og evaluere sygdom-inducerede ændringer af mitochondrier i distale spidsen af sensoriske nerver. Protokollen kombinerer fluorescens immunhistokemi, Konfokal mikroskopi og 3D billede analyseteknikker til at visualisere og kvantificere nerve-specifikke mitokondrier. Detaljerede parametre er defineret i hele procedurerne for at give et konkret eksempel på, hvordan disse teknikker til at isolere nerve-specifikke mitokondrier. Antistoffer blev brugt til at mærke nerve og mitokondriel signaler inden for væv dele af huden punch biopsier, som blev efterfulgt af indirekte immunfluorescens at visualisere nerver og mitokondrier med en rød og grøn fluorescerende signal henholdsvis. Z-serie billeder blev erhvervet med Konfokal mikroskopi og 3D analyse software blev brugt til at behandle og analysere signalerne. Det er ikke nødvendigt at følge de nøjagtige parametre, der beskrives inden for, men det er vigtigt at være i overensstemmelse med de af dem valgt i hele farvning, erhvervelse og analyse trin. Styrken af denne protokol er, at det finder anvendelse på en bred vifte af omstændigheder hvor en fluorescerende signal bruges til at isolere andre signaler, der ellers ville være umuligt at studere alene.

Visualisering og kvantificering af mitokondrier inden for menneskelige IENFs
Fluorescens Immunhistokemi giver mulighed for den samtidige mærkning af flere signaler inden for menneskelige hud biopsier at visualisere nerver, mitokondrier og kerner. En 96-brønd plade er en praktisk måde til at organisere trin i proceduren Immunhistokemi. Figur 1 viser, at denne konfiguration tegner ...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Denne protokol bruger tre-dimensionelle (3D) billedbehandling og analyse teknikker til at visualisere og kvantificere nerve-specifikke mitokondrier. Teknikkerne, der er gældende for andre situationer, hvor en fluorescerende signal bruges til at isolere et undersæt af data fra en anden fluorescerende signal.

Tre-dimensionelle billedbehandling og analyse af mitochondrier i menneskelige Intraepidermal nervefibre

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Forberedelse og immunfarvning af Mouse sensoriske nervefibre innerverer hud og lemmer Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Three Dimensional Vestibular Ocular Reflex Testing Using a Six Degrees of Freedom Motion Platform

Tre Dimensional Vestibulær Ocular Reflex under anvendelse af en Six Degrees of Freedom Motion Platform

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selektiv Tracing af Auditive fibre i de Avian embryoer Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokol til tredimensionel Konfokal Morfometrisk Analyse af Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Storstilet tredimensional billeddannelse af cellulære organisation i mus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Tredimensionel form modellering og analyse af hjernestrukturer

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Målretning Alpha Synuclein aggregater i kutane perifer nerve fibre af Free-flydende immunofluorescens analyse

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse for funktionel evaluering i rottemodel af iskiasnerven crush skade

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Billeddannelse og analyse af Neurofilament Transport i punkterede mus Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...