Name: three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé subventions K08 NS061039-01A2, le programme de recherche de neurologie &#38; découverte et l’a. Alfred Taubman Medical Research Institute à l’Université du Michigan. Ce travail a utilisé la morphologie et l’Image analyse Core du Michigan Diabetes Research Center, financé par les instituts nationaux de santé subvention 5P 90 DK-20572 du National Institute of Diabetes et digestives et les maladies des reins. Les auteurs tiens à remercier J. Robinson Singleton et A. Gordon Smith (Université de l’Utah) pour leur généreux don d’échantillons de peau humaine.

punch biopsies de la peau ont été extraites des sujets qui ont été recrutés dans un réseau de grands soins primaires communautaires au centre du diabète de l’Université de l’Utah (Salt Lake City, Utah). Cette étude a été approuvée par l’Université du Michigan Institutional Review Board et respecter les principes de la déclaration d’Helsinki. Écrit le consentement éclairé a été obtenu auprès de chaque personne concernée avant le test.
 1. immunohistochimie fluorescen...

Ce protocole est conçu pour isoler, de quantifier et d’analyser la taille et la distribution des mitochondries nerveuses spécifiques au sein de la IENFs en 3D de biopsies de la peau humaine. Il y a plusieurs étapes cruciales dans le protocole. L’immunohistochimie de fluorescence flottant est conçu pour souiller et analyser des signaux multiples dans chaque échantillon, fournissant une méthodologie plus souple pour la recherche exploratoire44,45. Cette p...

Mitochondries remplissent des fonctions cellulaires vitales qui comprennent la production d’énergie cellulaire, mise en mémoire tampon de calcium et réglementer nécrotiques et apoptose cellulaire mort1,2,3. Le système nerveux a un métabolisme élevé par rapport au corps4 suggérant que les neurones génèrent un degré élevé d’énergie cellulaire sous la forme d’adénosine triphosphate (ATP) par le biais de la respiration mitochondriale. Un grand nombre de documents de preuve que les fonctions neuronales dépendent de l’ATP5, surtout dans les synapses6. Par conséquent, la répartition des mitochondries dans les neurones est importante.
Au cours des 10 dernières années, que beaucoup d’information a montré que le trafic et l’accostage des mitochondries neuronales est très réglementées. Protéines motrices sont impliqués dans la distribution des mitochondries à compartiments cellulaires spécifiques tout au long du neurone. Traite des mitochondries est particulièrement importante parce que les neurones du projet les axones et les dendrites loin de soma. Les protéines motrices kinésine directement essentiellement antérograde (à l’opposé le soma) traite des mitochondries le long des microtubules pendant la dynéine protéines motrices direct motilité rétrograde (vers le soma)7,8,9 , 10. il sont a des signaux cellulaires un tel potentiel de membrane mitochondrial et la conduction d’impulsion qui influent sur la présence et la direction de mitochondrial trafic11,12,13.
En plus de transporter les mitochondries, il y a des protéines spécialisées à localiser les mitochondries pour les compartiments cellulaires spécifiques qui ont des exigences de haute énergie, tels que les nœuds de Ranvier et synapses8,14, 17. en effet, la majorité des mitochondries dans les axones sont non motiles9,13,18. Les protéines spécialisées comme mitochondries ancre syntaphilin aux microtubules le long des axones tandis que les autres protéines d’ancrage mitochondries à l’actine cytosquelette19–21. Facteurs de croissance et d’ions tels que le calcium ont été signalées à l’appui de la cessation du mouvement des mitochondries afin de les localiser dans des régions où ils sont nécessaires21,22,23.
Pris ensemble, le trafic et d’amarrage des mitochondries sont vitales pour le bon fonctionnement des neurones. À l’appui de cela, perturbation dans le trafic mitochondriale a été associée liée plusieurs maladies neurologiques dont la maladie d’Alzheimer, sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth, maladie de Huntington, spastique héréditaire paraparésie et atrophie optique15,24,25,26,27. Des études récentes ont mis l’accent sur le dysfonctionnement mitochondrial et la pathologie comme un mécanisme potentiel pour la neuropathie diabétique, la perte sensorielle associée diabète28,29,30,31 ,32,,33. L’hypothèse est que le diabète altère la distribution des mitochondries dans les projections sensorielles de terminaison nerveuse cutanée. Par conséquent, il a développé une technique pour visualiser et quantifier les mitochondries dans les fibres de nerf intra-épidermiques (IENFs), l’extrémité distale de la racine dorsale ganglion afférences sensorielles. La technique combine immunohistochimie de fluorescence spécifique mitochondriale et étiquettes de fibres nerveuses avec acquisition de série z microscopie confocale de signaux avec logiciel d’analyse d’image 3D puissant pour mesurer la distribution du nerf spécifiques mitochondries des biopsies punch cutanée humaine pour atteindre cet objectif.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:267px;">2% Zamboni&#39;s Fixative</td>
			<td style="width:200px;">Newcomer Supply, Middleton, WI&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1459A</td>
			<td style="width:363px;">2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">BP399-4</td>
			<td style="width:363px;">To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:267px;">Image-iT FX Signal Enhancer</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">I36933</td>
			<td style="width:363px;">enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:267px;">Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td style="width:200px;">Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td>
			<td style="width:199px;">14730-1-AP</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:267px;">Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td>
			<td style="width:200px;">abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:199px;">ab110333</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PDH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11034</td>
			<td style="width:363px;">red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11032</td>
			<td style="width:363px;">green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:267px;">Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">A7906-100</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as BSA</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">Triton X- 100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">T9284</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as TX-100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:267px;">0.22 &#181;m Filter</td>
			<td style="width:200px;">EMD Millipore, Billerica 
			MA</td>
			<td style="width:199px;">MILLEX GP SLGP 033NS</td>
			<td style="width:363px;">0.22 &#181;m Millipore filter</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">13-374-10</td>
			<td style="width:363px;">Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Non-calibrated Loop</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">22-032092</td>
			<td style="width:363px;">inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">96-well Assay Plate</td>
			<td style="width:200px;">Corning Incorporated, Corning, NY</td>
			<td style="width:199px;">3603</td>
			<td style="width:363px;">96-well flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">P-36931</td>
			<td style="width:363px;">DAPI staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:267px;">Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-544E</td>
			<td style="width:363px;">Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-550-15</td>
			<td style="width:363px;">Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:267px;">Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td style="width:200px;">Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">SP5</td>
			<td style="width:363px;">Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Volocity x64 Software&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Perkin Elmer, Waltham , MA</td>
			<td style="width:199px;">version 4.4.0</td>
			<td style="width:363px;">Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td>
			<td style="width:200px;">Bitplane, Concord, MA</td>
			<td style="width:199px;">version 7.7.1</td>
			<td style="width:363px;">Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:267px;">Excel</td>
			<td style="width:200px;">Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td style="width:199px;">version Office 2013</td>
			<td style="width:363px;">Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">Optimum Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:200px;">Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td>
			<td style="width:199px;">4583</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as OCT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Leica Cryostat</td>
			<td style="width:200px;">Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">CM1850</td>
			<td style="width:363px;">Cryostat for cutting 50 &#181;m sections</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">C10600</td>
			<td style="width:363px;">Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

Le but du présent protocole est d’étudier les mitochondries dans les fibres nerveuses intra-épidermiques. Par conséquent, des techniques d’imagerie et d’analyse 3D ont été développés pour isoler les mitochondries nerveuses spécifiques et évaluer les altérations induites par la maladie des mitochondries dans l’extrémité distale des nerfs sensitifs. Le protocole associe immunohistochimie de fluorescence, microscopie confocale et techniques d’analyse des images 3D de visualiser et de quantifier les mitochondries nerveuses spécifiques. Paramètres détaillés sont définies dans les procédures afin de fournir un exemple concret d’utilisation de ces techniques pour isoler les mitochondries nerveuses spécifiques. Anticorps ont été utilisés pour étiqueter le nerf et signaux mitochondriales dans des sections de tissu de peau punch biopsies, qui a été suivie par immunofluorescence indirecte pour visualiser les nerfs et les mitochondries avec un signal fluorescent vert et rouge respectivement. Z-série images ont été acquises avec la microscopie confocale et logiciel d’analyse 3D a été utilisé pour traiter et analyser les signaux. Il n’est pas nécessaire de suivre les paramètres décrits dans, mais il est important d’être cohérent avec ceux choisis tout au long de la coloration, les étapes d’acquisition et d’analyse. La force de ce protocole est qu’il est applicable à une grande variété de circonstances où un signal fluorescent est utilisé pour isoler les autres signaux qui serait autrement impossibles à étudier seul.

Visualisation et la quantification des mitochondries dans les IENFs humaines
Fluorescence immunohistochimie permet l’étiquetage simultanée de signaux multiples dans les biopsies de la peau humaine pour visualiser les nerfs, les mitochondries et les noyaux. Une plaque à 96 puits constitue un moyen pratique d’organiser les étapes de la procédure de l’immunohistochimie. La figure 1</...

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Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Ce protocole utilise des techniques d’imagerie et d’analyse en trois dimensions (3D) de visualiser et de quantifier les mitochondries nerveuses spécifiques. Les techniques sont applicables à d’autres situations où un signal fluorescent est utilisé pour isoler un sous-ensemble des données d’un autre signal fluorescent.

Imagerie en trois dimensions et l’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Préparation des tissus et des fibres Immunocoloration souris nerveuses sensitives innervant la peau et les os du membre

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Recherche

Neurosciences

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