Name: three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch nationale Institute der Gesundheit Stipendien K08 NS061039-01A2, The Program für Neurologie Forschung &#38; Entdeckung und A. Alfred Taubman Medical Research Institute an der University of Michigan. Dabei verwendet die Morphologie und die Bild-Analyse-Kern des Michigan Diabetes Research Center, finanziert durch das National Institute of Health Grant 5P 90 DK-20572 vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen. Die Autoren möchte J. Robinson Singleton und A. Gordon Smith (University of Utah) danken, für ihre großzügige Spende von menschlichen Hautproben.

Haut Stanzbiopsien stammen aus Themen, die von einem großen Community-basierte Erstversorgung Netzwerk an der University of Utah Diabeteszentrum (Salt Lake City, UT) rekrutiert wurden. Diese Studie wurde von der University of Michigan Institutional Review Board genehmigt und erfüllt mit den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki. Schriftliche Einwilligung eingeholt wurde, aus jedem Fach vor dem Test.
 1. Fluoreszenz Immunohistochemistry <ol><li>Prepare Stanzbiopsien für Intraep...

Dieses Protokoll soll zu isolieren, zu quantifizieren und zu analysieren, die Größe und Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien innerhalb von IENFs in 3D aus Menschenhaut Biopsien. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Die frei schwebenden Fluoreszenz Immunohistochemistry soll beflecken und mehrere Signale in jeder Probe, die eine vielseitigere Methodik für explorative Forschung44,45analysieren. Dieses Verfahren ermöglicht für die Penetration...

Mitochondrien dienen wichtige Zellfunktionen, die Produktion von Zellenergie, Pufferung, Kalzium, und Regulierung der nekrotischen und Apoptotic Zelle Tod1,2,3enthalten. Das Nervensystem hat eine hohe metabolische Rate im Vergleich zu den Körper4 darauf hindeutet, dass Neuronen ein hohes Maß an zelluläre Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP erzeugen) durch mitochondriale Atmung. Eine Menge Beweise dokumentiert, dass neuronale Funktionen ATP5, vor allem bei den Synapsen6abhängig sind. Die Verteilung der Mitochondrien innerhalb von Neuronen sind deshalb wichtig.
In die letzten 10 Jahren, die eine Vielzahl von Informationen, dass gezeigt hat der Handel und das Andocken des neuronalen Mitochondrien, ist streng reglementiert. Motorproteine sind bei der Verteilung der Mitochondrien zu spezifischen zellulären Fächer in das Neuron beteiligt. Handel mit Mitochondrien ist besonders wichtig, weil Neuronen Axone und Dendriten fernab der Soma-Projekt. Motorproteine Kinesin direkt in erster Linie Anterograde (Weg von der Soma) Handel mit Mitochondrien entlang der Mikrotubuli während Dynien Motorproteinen direkte retrograde (in Richtung der Soma) Motilität7,8,9 , 10. Zelluläre Signale gibt es solch eine mitochondriale Membranpotential und Impuls-Leitung, die Einfluss auf das Vorhandensein und die Richtung der mitochondrialen Menschenhandel11,12,13.
Neben Mitochondrien zu transportieren, gibt es spezielle Proteine, Mitochondrien zu spezifischen zellulären Kompartimenten zu lokalisieren, die hohen Energiebedarf, wie Knoten von Ranvier und Synapsen8,14, 17. In der Tat, die meisten von Mitochondrien in Axonen sind nicht bewegliche9,13,18. Spezielle Proteine wie Syntaphilin Anker Mitochondrien Mikrotubuli entlang der Axone während andere Proteine Anker Mitochondrien an den Aktin-Zytoskelett19–21. Wachstumsfaktoren und Ionen wie Calcium wurden berichtet, um die Einstellung der Mitochondrien Bewegung sie Regionen lokalisieren wo sie benötigte21,22,23sind zu unterstützen.
Zusammengenommen, sind Menschenhandel und docking der Mitochondrien entscheidend für die richtige Funktion der Neuronen. Zur Unterstützung dieser wurde Unterbrechung des mitochondrialen Handel mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Zahn Krankheit, Huntington Krankheit, erbliche spastische Paraparese und Optikusatrophie15,24,25,26,27. Neuere Studien konzentrierten sich auf mitochondriale Dysfunktion und Pathologie als ein möglicher Mechanismus für diabetische Neuropathie, die sensorische Verlust im Zusammenhang mit Diabetes28,29,30,31 ,32,33. Die Hypothese ist, dass Diabetes die Verteilung der Mitochondrien innerhalb der sensorischen Projektionen der kutanen Nervenendigung verändert. Daher wurde eine Technik entwickelt, um zu visualisieren und zu quantifizieren Mitochondrien innerhalb der Intraepidermal Nervenfasern (IENFs), die distalen Spitzen der Dorsal Root Ganglion sensorischen Afferenzen. Die Technik kombiniert Fluoreszenz Immunohistochemistry spezifische mitochondriale und Nervenfaser Etiketten mit konfokalen Mikroskopie Z-Serie Erwerb von Signalen mit leistungsstarken 3D Bildanalyse-Software zur Messung der Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien von menschlichen kutanen Stanzbiopsien zur Erreichung dieses Ziels.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:267px;">2% Zamboni&#39;s Fixative</td>
			<td style="width:200px;">Newcomer Supply, Middleton, WI&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1459A</td>
			<td style="width:363px;">2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">BP399-4</td>
			<td style="width:363px;">To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:267px;">Image-iT FX Signal Enhancer</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">I36933</td>
			<td style="width:363px;">enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:267px;">Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td style="width:200px;">Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td>
			<td style="width:199px;">14730-1-AP</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:267px;">Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td>
			<td style="width:200px;">abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:199px;">ab110333</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PDH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11034</td>
			<td style="width:363px;">red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11032</td>
			<td style="width:363px;">green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:267px;">Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">A7906-100</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as BSA</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">Triton X- 100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">T9284</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as TX-100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:267px;">0.22 &#181;m Filter</td>
			<td style="width:200px;">EMD Millipore, Billerica 
			MA</td>
			<td style="width:199px;">MILLEX GP SLGP 033NS</td>
			<td style="width:363px;">0.22 &#181;m Millipore filter</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">13-374-10</td>
			<td style="width:363px;">Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Non-calibrated Loop</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">22-032092</td>
			<td style="width:363px;">inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">96-well Assay Plate</td>
			<td style="width:200px;">Corning Incorporated, Corning, NY</td>
			<td style="width:199px;">3603</td>
			<td style="width:363px;">96-well flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">P-36931</td>
			<td style="width:363px;">DAPI staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:267px;">Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-544E</td>
			<td style="width:363px;">Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-550-15</td>
			<td style="width:363px;">Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:267px;">Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td style="width:200px;">Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">SP5</td>
			<td style="width:363px;">Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Volocity x64 Software&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Perkin Elmer, Waltham , MA</td>
			<td style="width:199px;">version 4.4.0</td>
			<td style="width:363px;">Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td>
			<td style="width:200px;">Bitplane, Concord, MA</td>
			<td style="width:199px;">version 7.7.1</td>
			<td style="width:363px;">Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:267px;">Excel</td>
			<td style="width:200px;">Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td style="width:199px;">version Office 2013</td>
			<td style="width:363px;">Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">Optimum Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:200px;">Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td>
			<td style="width:199px;">4583</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as OCT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Leica Cryostat</td>
			<td style="width:200px;">Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">CM1850</td>
			<td style="width:363px;">Cryostat for cutting 50 &#181;m sections</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">C10600</td>
			<td style="width:363px;">Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

Das Ziel dieses Protokolls ist, Mitochondrien innerhalb Intraepidermal Nervenfasern zu studieren. Daher wurden 3D Bildgebung und Analysetechniken entwickelt, um Nerv-spezifische Mitochondrien zu isolieren und Krankheit verursachten Veränderungen der Mitochondrien in der distalen Spitze der sensorischen Nerven zu bewerten. Das Protokoll verbindet Fluoreszenz Immunohistochemistry, konfokale Mikroskopie und 3D-Bild Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Detaillierte Parameter sind im gesamten Verfahren definiert, um ein konkretes Beispiel, wie man diese Techniken verwenden, um Nerv-spezifische Mitochondrien isolieren zu bieten. Antikörper wurden verwendet, um Nerven zu beschriften und mitochondriale Signale in Gewebeschnitten der Haut Punsch Biopsien, die folgte indirekte Immunfluoreszenz, Nerven und Mitochondrien mit grünen und roten Fluoreszenzsignal bzw. zu visualisieren. Z-Serie-Bilder wurden mit der konfokalen Mikroskopie erworben und 3D Analyse-Software wurde zur Verarbeitung und Analyse der Signale. Es ist nicht notwendig, die genauen Parameter innerhalb beschrieben folgen, aber es ist wichtig, die konsistent mit denen, die in der Färbung, Erfassung und Analyse Schritten gewählt werden. Die Stärke dieses Protokolls ist, dass es auf eine Vielzahl von Umständen anwendbar ist, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um andere Signale zu isolieren, die sonst unmöglich, allein zu studieren.

Visualisierung und Quantifizierung der Mitochondrien innerhalb von menschlichen IENFs
Fluoreszenz Immunohistochemistry ermöglicht die gleichzeitige Kennzeichnung von mehreren Signalen innerhalb menschlicher Hautbiopsien, Nerven, Mitochondrien und Kerne zu visualisieren. Eine 96-Well-Platte ist eine komfortable Möglichkeit, die Schritte des Verfahrens Immunohistochemistry zu organisieren. A...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Dieses Protokoll verwendet dreidimensionale (3D) Bildgebung und Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Die Techniken sind anwendbar auf andere Situationen, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um eine Teilmenge der Daten aus einem anderen Fluoreszenzsignal zu isolieren.

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Forschung

Neurowissenschaften

Three Dimensional Vestibular Ocular Reflex Testing Using a Six Degrees of Freedom Motion Platform

Dreidimensional Vestibuläre Ocular Reflex-Test mit Six Degrees of Freedom Bewegung Platform

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selektive Tracing von Auditory Fibers im Avian Embryonale vestibulocochlearis

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Dreidimensionale konfokale Analyse der Mikroglia / Makrophagen-Marker der Polarisation in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Dreidimensionale Formmodellierung und Analyse von Gehirnstrukturen

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Kutane periphere Nervenfasern durch frei schwebenden Immunfluoreszenz-Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...