Name: three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים K08 NS061039-01A2, תוכנית למחקר נוירולוגיה &#38; גילוי, א אלפרד טאובמן רפואי מכון המחקר של אוניברסיטת מישיגן. עבודה זו נעשה שימוש של מורפולוגיה הליבה ניתוח תמונה של מרכז מחקר סוכרת מישיגן, הממומן על ידי מוסדות לאומיים של בריאות גרנט 90 P 5 DK-20572 במכון הלאומי של סוכרת, העיכול, מחלות כליה. המחברים רוצה להודות ג'י רובינסון סינגלטון ו א גורדון סמית ' (אוניברסיטת יוטה) לתרומה הנדיבה שלהם של דגימות העור האנושי.

נושאים גויסו מרשת טיפול ראשוני בקהילה גדולה במרכז לסוכרת אוניברסיטת יוטה (סולט לייק סיטי, יוטה), ביופסיות ניקוב עור התקבלו. מחקר זה היה אושרו על ידי ועדת הבדיקה מוסדיים באוניברסיטת מישיגן, פעלו לפי עקרונות הצהרת הלסינקי. נכתב מדעת היה המתקבלים לכל נושא לפני בדיקות.
 1. קרינה פ?...

פרוטוקול זה תוכנן כדי לבודד, לכמת ולנתח את גודל ואת ההפצה של המיטוכונדריה עצבים ספציפיים בתוך IENFs תלת-ממד של ביופסיות העור האנושי. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. אימונוהיסטוכימיה פלורסצנטיות לתרשים נועד להכתים וניתוח אותות מרובים בכל מדגם, מתן מתודולוגיה תכליתיות עבור מחקר לקטעים<sup c...

המיטוכונדריה לשרת פונקציות הסלולר חיוניים הכוללים הפקת אנרגיה בתא, מאגרי סידן, ועל ויסות נמק ו מוות תא מוות1,2,3. למערכת העצבים יש שיעור חילוף החומרים גבוה לעומת גוף4 רומז כי נוירונים לייצר רמה גבוהה של האנרגיה התאית בצורה של אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך נשימה מיטוכונדריאלי. הרבה מסמכים ראיות כי פונקציות עצביים תלויות ב- ATP5, במיוחד בזמן הסינפסות6. לכן, ההתפלגות של המיטוכונדריה בתוך הנוירונים הוא חשוב.
במהלך 10 השנים האחרונות שהרבה מידע הראה ש של סחר בבני אדם, עגינה של המיטוכונדריה עצביים מאוד מווסתות. מנוע חלבונים מעורבים הפצת המיטוכונדריה כדי ספציפי תאים סלולריים לאורך הנוירון. סחר בבני אדם של המיטוכונדריה חשוב במיוחד כי נוירונים פרויקט אקסונים ו דנדריטים הרחק מן סומא. קינזין מנוע חלבונים בעיקר לכוון anterograde (הרחק סומה) סחר של המיטוכונדריה לאורך microtubules תוך דינאין חלבונים מנוע ישיר תנועתיות רטרוגרדי (לכיוון סומה)7,8,9 , 10. שם הן אותות תאיים כזה מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית הולכה דחף המשפיעים על נוכחות והכיוון של מיטוכונדריאלי סחר11,12,13.
בנוסף לשינוע המיטוכונדריה, ישנם חלבונים מיוחדים כדי להתאים לשפה המיטוכונדריה כדי תאים הסלולר ספציפיים שיש להם דרישות אנרגיה גבוהה, כגון Ranvier של צמתים, הסינפסות8,14, 17. למעשה, הרוב המכריע של המיטוכונדריה בתוך אקסונים הם שאינם תאי9,13,18. חלבונים מיוחדים כמו syntaphilin המיטוכונדריה עוגן כדי microtubules לאורך אקסונים בזמן לחלבונים אחרים עיגון המיטוכונדריה אקטין שלד התא19–21. גורמי גדילה, יונים כגון סידן דווחו לתמוך הפסקת תנועת המיטוכונדריה למקם אותם לאזורים איפה הם הצורך21,22,23.
יחדיו, סחר עגינה של המיטוכונדריה הם חיוניים לתפקוד תקין של נוירונים. כדי לתמוך בזה, הפרעה סחר מיטוכונדריאלי היה קשור עם מספר מחלות נוירולוגיות כולל מחלת אלצהיימר, נוירודגנרטיביות, שארקו-מארי-טות ', מחלת הנטינגטון, עוויתי תורשתי paraparesis, ניוון אופטיים15,24,25,26,27. המחקרים האחרונים התמקדו בתפקוד מיטוכונדריאלי, פתולוגיה כמנגנון פוטנציאליים עבור נוירופתיה סוכרתית, אובדן חושים הקשורים לסוכרת28,29,30,31 32, ,33. ההשערה היא כי סוכרת הפיצולים ההתפלגות של המיטוכונדריה בתוך ההשתקפויות חושית של ותאי העצב עורית. לכן, הטכניקה פותחה כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה בתוך סיבי העצב intraepidermal (IENFs), קצות דיסטלי שורש העזוב גנגליון afferents חושית. הטכניקה משלב פלורסצנטיות אימונוהיסטוכימיה של ספציפי מיטוכונדריאלי ותוויות סיבי עצב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית רכישת מסדרת z של אותות עם תוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית חזק כדי למדוד את ההתפלגות של עצבים ספציפיים המיטוכונדריה מן האדם עורית אגרוף ביופסיות להשגת מטרה זו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:267px;">2% Zamboni&#39;s Fixative</td>
			<td style="width:200px;">Newcomer Supply, Middleton, WI&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1459A</td>
			<td style="width:363px;">2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">BP399-4</td>
			<td style="width:363px;">To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:267px;">Image-iT FX Signal Enhancer</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">I36933</td>
			<td style="width:363px;">enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:267px;">Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td style="width:200px;">Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td>
			<td style="width:199px;">14730-1-AP</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:267px;">Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td>
			<td style="width:200px;">abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:199px;">ab110333</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PDH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11034</td>
			<td style="width:363px;">red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11032</td>
			<td style="width:363px;">green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:267px;">Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">A7906-100</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as BSA</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">Triton X- 100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">T9284</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as TX-100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:267px;">0.22 &#181;m Filter</td>
			<td style="width:200px;">EMD Millipore, Billerica 
			MA</td>
			<td style="width:199px;">MILLEX GP SLGP 033NS</td>
			<td style="width:363px;">0.22 &#181;m Millipore filter</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">13-374-10</td>
			<td style="width:363px;">Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Non-calibrated Loop</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">22-032092</td>
			<td style="width:363px;">inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">96-well Assay Plate</td>
			<td style="width:200px;">Corning Incorporated, Corning, NY</td>
			<td style="width:199px;">3603</td>
			<td style="width:363px;">96-well flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">P-36931</td>
			<td style="width:363px;">DAPI staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:267px;">Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-544E</td>
			<td style="width:363px;">Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-550-15</td>
			<td style="width:363px;">Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:267px;">Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td style="width:200px;">Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">SP5</td>
			<td style="width:363px;">Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Volocity x64 Software&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Perkin Elmer, Waltham , MA</td>
			<td style="width:199px;">version 4.4.0</td>
			<td style="width:363px;">Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td>
			<td style="width:200px;">Bitplane, Concord, MA</td>
			<td style="width:199px;">version 7.7.1</td>
			<td style="width:363px;">Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:267px;">Excel</td>
			<td style="width:200px;">Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td style="width:199px;">version Office 2013</td>
			<td style="width:363px;">Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">Optimum Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:200px;">Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td>
			<td style="width:199px;">4583</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as OCT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Leica Cryostat</td>
			<td style="width:200px;">Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">CM1850</td>
			<td style="width:363px;">Cryostat for cutting 50 &#181;m sections</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">C10600</td>
			<td style="width:363px;">Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

המטרה של פרוטוקול זה היא ללמוד המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב intraepidermal. לכן, פותחו טכניקות הדמיה וניתוח 3D לבודד עצב ספציפיים המיטוכונדריה ולהעריך הנוצרות על-ידי מחלת שינויים של המיטוכונדריה בקצה הדיסטלי של העצבים החישה. הפרוטוקול משלב אימונוהיסטוכימיה פלורסצנטיות, מיקרוסקופיה קונפוקלית וטכניקות ניתוח תמונה תלת-ממדית כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. פרמטרים מפורטים מוגדרים לכל אורך ההליכים על מנת לספק דוגמה מוחשית כיצד להשתמש הטכניקות הללו כדי לבודד עצב ספציפיים המיטוכונדריה. נוגדנים שימשו כדי לתייג עצב, אותות מיטוכונדריאלי בתוך מקטעי רקמת העור אגרוף ביופסיות, אשר בעקבות immunofluorescence עקיף כדי להמחיש את העצבים ואת המיטוכונדריה עם אות ניאון אדום וירוק בהתאמה. Z-סדרת תמונות נרכשו עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, נעשה שימוש בתוכנות ניתוח תלת-ממד כדי לעבד ולנתח את האותות. אין צורך לעקוב אחר הפרמטרים המדויק תיאר בתוך, אבל חשוב להיות עקביים עם אלה שנבחרו לאורך מכתים, צעדים analysis של רכישת. הכוח של פרוטוקול זה היא שזה ישים למגוון רחב של נסיבות שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד אחרים אותות שאחרת היה בלתי אפשרי ללמוד לבד.

ויזואליזציה, כימות של המיטוכונדריה בתוך IENFs אנושי
קרינה פלואורסצנטית אימונוהיסטוכימיה מאפשר תיוג סימולטני של אותות מרובים בתוך ביופסיות העור האנושי לדמיין העצבים המיטוכונדריה, גרעינים. צלחת 96-ובכן הוא דרך נוחה כדי לארגן את השל...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

פרוטוקול זה משתמש תלת מימדי (3D) טכניקות הדמיה וניתוח כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. הטכניקות ישימות למצבים אחרים שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד ערכת משנה של נתונים מ עוד אות ניאון.

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Three Dimensional Vestibular Ocular Reflex Testing Using a Six Degrees of Freedom Motion Platform

שלוש בדיקות שיווי משקל ממדית Ocular Reflex שימוש בשש דרגות חופש תנועה של פלטפורמה

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

איתור סלקטיבי של סיבי עצב שמיעה בVestibulocochlear העוברי העופות

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

מידול צורה תלת מימדי וניתוח מבני המוח

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

מיקוד אלפא Synuclein אגרגטים בתוך עורית היקפיים סיבים עצביים על ידי Free-צפה אימונוofלואונסנציה החופשית

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...