Name: three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse tilskudd K08 NS061039-01A2, The Program for nevrologi forskning &#38; funn, og A. Alfred Taubman Medical Research Institute ved University of Michigan. Dette arbeidet brukte morfologi og Image Analysis kjernen i Michigan Diabetes Research Center, finansiert av nasjonale institutter for helse gi 5P 90 DK-20572 fra National Institute Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer. Forfatterne ønsker å takke J. Robinson Singleton og A. Gordon Smith (University of Utah) for deres generøse donasjonen av menneskelig hud prøver.

hud punch biopsies Hentet fra temaer som ble rekruttert fra en stor fellesskapet-baserte primærhelsetjenesten nettverket ved University of Utah Diabetes Center (Salt Lake City, UT). Denne studien ble godkjent av University of Michigan institusjonelle Review Board og overholdt grunnsetningene i deklarasjonen i Helsinki. Skriftlig samtykke ble innhentet fra hvert emne før testing.
 1. fluorescens Immunohistochemistry <ol><li>forberede punch biopsier for intraepidermal nerve fiber im...

Denne protokollen er utformet for å isolere, kvantifisere og analysere størrelse og distribusjon av nerve-spesifikke mitokondrier i IENFs i 3D fra menneskelig hud biopsies. Det er flere viktige skritt i protokollen. Frittflytende fluorescens immunohistochemistry er beregnet på flekken og analysere flere signaler i hver prøve, gir en mer allsidig metode for utforskende forskning44,45. Denne prosedyren gir gjennomtrengning av antistoffer til vev for å maksimer...

Mitokondrier tjene vitale cellulære funksjoner som inkluderer produserer celle energi, bufring kalsium, og regulerer necrotic og apoptotisk celle død1,2,3. Nervesystemet er en høy metabolske rate i forhold til kroppen4 antyder at nervecellene generere en høy grad av cellular energi i form av adenosin trifosfat (ATP) gjennom mitokondrie åndedrett. Mye bevis dokumenter at neuronal funksjoner er avhengige av ATP5, spesielt på synapser6. Fordelingen av mitokondrier i neurons er derfor viktig.
De siste 10 årene mye informasjon har vist at handel med og dokking av neuronal mitokondrier regulerte sterkt. Motoren proteiner er involvert i å distribuere mitokondrier til bestemte mobilnettet rom gjennom Nevron. Smugling av mitokondrier er spesielt viktig fordi neurons prosjekt axons og dendrites langt unna soma. Kinesin motoren proteiner direkte primært anterograd (fra soma) smugling av mitokondrier langs piskehale som henger mens dynein motoren proteiner direkte retrograd (mot soma) motilitet7,8,9 , 10. det er mobilnettet signaler slik mitokondrie membran potensial og impuls ledning som påvirker tilstedeværelse og retning mitokondrie menneskehandel11,12,13.
I tillegg transport mitokondrier, finnes det spesialiserte proteiner å lokalisere mitokondrier til bestemte mobilnettet rom som har høy energi krav, som noder i Ranvier og synapser8,14, 17. flertallet av mitokondrier i axons er faktisk ikke-motile9,13,18. Spesialiserte proteiner som syntaphilin anker mitokondrier til piskehale som henger sammen axons mens andre proteiner anker mitokondrier begrepsordbok cytoskjelett19-21. Vekstfaktorer og ioner som kalsium er rapportert å støtte opphør av mitokondrier bevegelsen å lokalisere dem til områder der de er nødvendige21,22,23.
Samlet er menneskehandel og docking av mitokondrier avgjørende for riktig funksjon av nevroner. Dette har avbrudd i mitokondrie menneskehandel blitt assosiert med flere nevrologiske lidelser inkludert Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sykdom, Huntingtons sykdom, arvelig spastisk paraparesis og optisk atrofi,15,,24,,25,,26,,27. Nyere studier har fokusert på mitokondrie dysfunksjon og patologi som en potensiell mekanisme for diabetisk nevropati, sensoriske tap forbundet med diabetes28,29,30,31 ,32,33. Hypotesen er at diabetes endrer fordelingen av mitokondrier i Sensorisk anslagene av cutaneous nerve slutt. Derfor utviklet en teknikk for å visualisere og kvantifisere mitokondrier i intraepidermal nervefibrene (IENFs), den distale tips dorsal root ganglion sensoriske afferente. Teknikken kombinerer fluorescens immunhistokjemi av spesifikke mitokondrie og nerve fiber etiketter med AC confocal mikroskopi z-serien oppkjøpet av signaler med kraftig 3D image analyseprogramvare å måle fordelingen av nerve-spesifikke mitokondrier fra menneskelige kutan punch biopsies å oppnå dette målet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:267px;">2% Zamboni&#39;s Fixative</td>
			<td style="width:200px;">Newcomer Supply, Middleton, WI&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1459A</td>
			<td style="width:363px;">2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">BP399-4</td>
			<td style="width:363px;">To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:267px;">Image-iT FX Signal Enhancer</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">I36933</td>
			<td style="width:363px;">enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:267px;">Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td style="width:200px;">Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td>
			<td style="width:199px;">14730-1-AP</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:267px;">Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td>
			<td style="width:200px;">abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:199px;">ab110333</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PDH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11034</td>
			<td style="width:363px;">red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11032</td>
			<td style="width:363px;">green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:267px;">Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">A7906-100</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as BSA</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">Triton X- 100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">T9284</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as TX-100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:267px;">0.22 &#181;m Filter</td>
			<td style="width:200px;">EMD Millipore, Billerica 
			MA</td>
			<td style="width:199px;">MILLEX GP SLGP 033NS</td>
			<td style="width:363px;">0.22 &#181;m Millipore filter</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">13-374-10</td>
			<td style="width:363px;">Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Non-calibrated Loop</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">22-032092</td>
			<td style="width:363px;">inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">96-well Assay Plate</td>
			<td style="width:200px;">Corning Incorporated, Corning, NY</td>
			<td style="width:199px;">3603</td>
			<td style="width:363px;">96-well flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">P-36931</td>
			<td style="width:363px;">DAPI staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:267px;">Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-544E</td>
			<td style="width:363px;">Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-550-15</td>
			<td style="width:363px;">Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:267px;">Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td style="width:200px;">Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">SP5</td>
			<td style="width:363px;">Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Volocity x64 Software&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Perkin Elmer, Waltham , MA</td>
			<td style="width:199px;">version 4.4.0</td>
			<td style="width:363px;">Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td>
			<td style="width:200px;">Bitplane, Concord, MA</td>
			<td style="width:199px;">version 7.7.1</td>
			<td style="width:363px;">Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:267px;">Excel</td>
			<td style="width:200px;">Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td style="width:199px;">version Office 2013</td>
			<td style="width:363px;">Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">Optimum Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:200px;">Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td>
			<td style="width:199px;">4583</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as OCT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Leica Cryostat</td>
			<td style="width:200px;">Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">CM1850</td>
			<td style="width:363px;">Cryostat for cutting 50 &#181;m sections</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">C10600</td>
			<td style="width:363px;">Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

Målet med denne protokollen er å studere mitokondrier i intraepidermal nerve fibre. Derfor ble 3D bildebehandling og analyse teknikker utviklet for å isolere nerve-spesifikke mitokondrier og evaluere sykdom-induserte endringer av mitokondrier i den distale tuppen på sensoriske nerver. Protokollen kombinerer fluorescens immunohistochemistry, AC confocal mikroskopi og 3D image analyseteknikker å visualisere og kvantifisere nerve produktspesifikk mitochondria. Detaljerte parametere er definert gjennom fremgangsmåten for å gi en konkret eksempel på hvordan du bruker disse teknikkene til å isolere nerve produktspesifikk mitochondria. Antistoffer ble brukt til å merke nerve og mitokondrie signaler i vev deler av huden punch biopsier, som ble etterfulgt av indirekte immunofluorescence å visualisere nerver og mitokondrier med en grønn og rød fluorescerende signal henholdsvis. Z-serien bildene ble anskaffet med AC confocal mikroskopi og 3D analyseprogramvare ble brukt til å behandle og analysere signaler. Det er ikke nødvendig å følge nøyaktig parameterne som beskrives i, men det er viktig å være i samsvar med de valgt gjennom farging, oppkjøp og analyse. Styrken i denne protokollen er at det er gjelder for en rekke tilfeller der en fluorescerende signal brukes til å isolere andre signaler som ellers ville være umulig å studere i fred.

Visualisering og kvantifisering av mitokondrier i menneskelig IENFs
Fluorescens immunohistochemistry tillater samtidig merkingen av flere signaler i menneskelig hud biopsies å visualisere nerver og mitokondrier kjerner. En 96-brønns plate er en praktisk måte å organisere trinnene i prosedyren immunohistochemistry. Figur 1 viser at dette konfigurasjon står for opp til 8 deler be...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Denne protokollen bruker tredimensjonale (3D) bildebehandling og analyse teknikker å visualisere og kvantifisere nerve produktspesifikk mitochondria. Teknikkene gjelder for andre situasjoner der en fluorescerende signal brukes til å isolere et delsett med data fra en annen fluorescerende signal.

Tredimensjonale Imaging og analyse av mitokondrier i menneskelig Intraepidermal Nerve Fibre

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Preparering og farging av Mouse Sensoriske nervefibre Innervating Hud og Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Three Dimensional Vestibular Ocular Reflex Testing Using a Six Degrees of Freedom Motion Platform

Tredimensjonal Vestibular Ocular Reflex Testing hjelp av en Six Degrees of Freedom Motion Platform

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selektiv Tracing av auditiv Fibers i Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll for Tredimensjonal Confocal Morfometrisk Analyse av Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Store tredimensjonale Imaging mobilnettet organisasjon i musen Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Tredimensjonal form modellering og analyse av hjernens strukturer

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Målretting Alpha Synuclein aggregater i hud perifere nerve fibre av fri-flytende Immunofluorescence analysen

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D kinematisk analyse for funksjonell evaluering i rottemodellen av siattisk nerveknuseskade

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Avbildning og analyse av neurofilamenttransport i ekskisert mus tibial nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...