Name: three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грантов K08 NS061039-01A2, программа для неврологии исследований &#38; открытия и A. Альфред Таубман медицинский научно-исследовательский институт в университете штата Мичиган. Эта работа использовала морфологии и ядро анализа изображения Мичиган диабет исследовательского центра, финансируемые национальными институтами здравоохранения грант 5P 90 DK-20572 от национального института диабета и пищеварения и болезни почек. Авторы хотели бы поблагодарить Дж. Робинсон Синглтон и а. Гордон Смит (Университет штата Юта) за их щедрое пожертвование образцов кожи человека.

биопсия кожи удар были получены от предметов, которые были набраны из сети большой первичной помощи на базе общин в университете штата Юта диабет-центр (Солт-Лейк-Сити, UT). Это исследование было утверждено институциональных Наблюдательный Совет университета Мичигана и соблюдает принц?...

Этот протокол предназначен для изолировать, количественной оценки и анализа размера и распределения нерва конкретных митохондрий в IENFs в 3D от биопсии кожи человека. Есть несколько важных шагов в протоколе. Свободно плавающего флуоресценции иммуногистохимия предназначен для пятен и а?...

Митохондрии служат жизненно важные клеточные функции, которые включают производство энергии клеток, буферизация кальция и регулирование некротические и apoptotic клеток смерти1,2,3. Нервная система имеет высокую скорость метаболизма, по сравнению с тела4 , предполагая, что нейроны генерировать высокий уровень клеточной энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ) через митохондриальное дыхание. Много доказательств документы, что нейронные функции зависят от АТФ5, особенно на синапсы6. Таким образом распределение митохондрий в пределах нейронов имеет важное значение.
За последние 10 лет много информации показал, торговлей и стыковка нейрональных митохондрий жестко регламентируется. Моторные белки участвуют в распространении митохондрий конкретных сотовых отделений во всем нейроном. Торговля митохондрий особенно важна, потому что нейроны проекта аксонов и дендритов вдали от Сома. Кинезин моторов белков главным образом прямые, антероградная (от soma) торговля митохондрий вдоль микротрубочек во время Динеин моторов белков прямой ретроградным (в сторону сома) моторики7,8,9 , 10. Существует клеточных сигналов такой митохондриальной мембранного потенциала и проводимости импульса, которые влияют на наличие и направление митохондриальной людьми11,12,13.
Помимо транспортировки митохондрий, существуют специализированные белки для локализации митохондрий для конкретных клеточных отсеков, которые предъявляют требования высокой энергии, таких как узлы по Ranvier и синапсы8,14, 17. В самом деле, большинство из митохондрий в пределах аксоны являются не подвижные9,13,18. Специализированные белки, как syntaphilin якорь митохондрий в микротрубочки вдоль аксоны в то время как другие белки митохондрий якорь в Цитоскелет актина19–21. Факторы роста и ионов, таких как кальций были зарегистрированы в поддержку прекращения движения митохондрий локализовать их в районы, где они являются необходимой21,22,23.
Взятые вместе, торговли людьми и закрепления митохондрий жизненно важное значение для надлежащего функционирования нейронов. В поддержку этого нарушения в митохондриальной людьми была связана с нескольких неврологических условий включая болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб, болезнь Хантингтона, наследственные спастический парезами и атрофия зрительного нерва15,24,25,,2627. Недавние исследования были сосредоточены на митохондриальной дисфункции и патологии как потенциального механизма для диабетической невропатии, сенсорные потери, связанные с диабетом28,,2930,31 ,32,33. Гипотеза является, что диабет изменяет распределение митохондрий в пределах сенсорные прогнозы конца кожный нерв. Таким образом метод был разработан для визуализации и количественно митохондрий в пределах intraepidermal нервных волокон (IENFs), дистальная советы корень спинной ганглий сенсорные афферентов. Техника сочетает в себе флуоресценции иммуногистохимия конкретных митохондриальных и нервных волокон этикетки с приобретением confocal микроскопии z серии сигналов с мощным 3D изображений программное обеспечение для анализа для измерения распределения нерва конкретных Митохондрии от человека кожный пробивать биопсии для достижения этой цели.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:267px;">2% Zamboni&#39;s Fixative</td>
			<td style="width:200px;">Newcomer Supply, Middleton, WI&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1459A</td>
			<td style="width:363px;">2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">BP399-4</td>
			<td style="width:363px;">To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:267px;">Image-iT FX Signal Enhancer</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">I36933</td>
			<td style="width:363px;">enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:267px;">Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td style="width:200px;">Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td>
			<td style="width:199px;">14730-1-AP</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:267px;">Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td>
			<td style="width:200px;">abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:199px;">ab110333</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PDH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11034</td>
			<td style="width:363px;">red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11032</td>
			<td style="width:363px;">green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:267px;">Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">A7906-100</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as BSA</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">Triton X- 100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">T9284</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as TX-100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:267px;">0.22 &#181;m Filter</td>
			<td style="width:200px;">EMD Millipore, Billerica 
			MA</td>
			<td style="width:199px;">MILLEX GP SLGP 033NS</td>
			<td style="width:363px;">0.22 &#181;m Millipore filter</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">13-374-10</td>
			<td style="width:363px;">Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Non-calibrated Loop</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">22-032092</td>
			<td style="width:363px;">inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">96-well Assay Plate</td>
			<td style="width:200px;">Corning Incorporated, Corning, NY</td>
			<td style="width:199px;">3603</td>
			<td style="width:363px;">96-well flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">P-36931</td>
			<td style="width:363px;">DAPI staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:267px;">Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-544E</td>
			<td style="width:363px;">Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-550-15</td>
			<td style="width:363px;">Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:267px;">Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td style="width:200px;">Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">SP5</td>
			<td style="width:363px;">Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Volocity x64 Software&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Perkin Elmer, Waltham , MA</td>
			<td style="width:199px;">version 4.4.0</td>
			<td style="width:363px;">Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td>
			<td style="width:200px;">Bitplane, Concord, MA</td>
			<td style="width:199px;">version 7.7.1</td>
			<td style="width:363px;">Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:267px;">Excel</td>
			<td style="width:200px;">Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td style="width:199px;">version Office 2013</td>
			<td style="width:363px;">Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">Optimum Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:200px;">Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td>
			<td style="width:199px;">4583</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as OCT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Leica Cryostat</td>
			<td style="width:200px;">Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">CM1850</td>
			<td style="width:363px;">Cryostat for cutting 50 &#181;m sections</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">C10600</td>
			<td style="width:363px;">Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

Целью настоящего Протокола является изучение митохондрий в пределах intraepidermal нервных волокон. Таким образом 3D визуализации и анализа методов были разработаны для изолировать нерва конкретных митохондрии и оценивать болезнь индуцированные изменения митохондрий в дистального наконечника сензорных нервах. Протокол сочетает в себе флуоресценции иммуногистохимии, конфокальная микроскопия и методы анализа 3D изображение для визуализации и количественно нерва конкретных митохондрий. Подробные параметры определяются на протяжении процедуры для того, чтобы обеспечить конкретным примером того, как использовать эти методы для изоляции нервных специфичные митохондрий. Антитела были использованы для обозначения нерва и митохондриальной сигналов в рамках разделов ткани кожи пунш биопсий, который последовал непрямой иммунофлюоресценции для визуализации нервы и митохондрии с зеленым и красным флуоресцентного сигнала соответственно. Z-серии изображения были приобретены с помощью конфокальной микроскопии и программное обеспечение для 3D-анализа была использована для обработки и анализа сигналов. Это не обязательно следовать точные параметры, описанные в, но важно соответствовать те выбрали во всем окрашивание, сбора и анализа данных шаги. Сила настоящего Протокола является, что это применимо к самые разнообразные обстоятельства, где один флуоресцентные сигнал используется для того, чтобы изолировать других сигналов, которые в противном случае будет невозможно учиться самостоятельно.

Визуализация и количественная оценка митохондрий в человека IENFs
Флуоресценции иммуногистохимия позволяет одновременное маркировки множества сигналов для визуализации нервы, митохондрии и ядер в пределах биопсии кожи челов...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Этот протокол использует трехмерные (3D) методы визуализации и анализа для визуализации и количественно нерва конкретных митохондрий. Методы применяются в других ситуациях, где один флуоресцентные сигнал используется для того, чтобы изолировать подмножество данных из другой флуоресцентного сигнала.

Трехмерных изображений и анализ митохондрии внутри человека Intraepidermal нервных волокон

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Подготовка тканей и Иммуноокрашивание Мыши чувствительные нервные волокна, иннервирующие кожу и кости конечностей

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Three Dimensional Vestibular Ocular Reflex Testing Using a Six Degrees of Freedom Motion Platform

Трехмерные вестибулярного рефлекса Тестирование с помощью шестью степенями свободы движения платформы

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Селективный розыска слуховых волокон в Птичий Эмбриональные Vestibulocochlear нервов

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Протокол трехмерной конфокальной морфометрического анализа астроцитов

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Крупномасштабные трехмерных изображений клеточной организации коры головного мозга мыши

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Трехмерное моделирование формы и анализ структур мозга

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Ориентация Альфа Синуклеин Агрегаты в кожных периферных нервных волокон по свободно плавающей иммунофлуоресценции Анализ

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D кинематический анализ для функциональной оценки в Крыса Модель Сиатический нерв Давка травмы

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Изображение и анализ нейрофиламента транспорта в акцизных мышь Tibial нерва

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...