Name: three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa bidrag K08 NS061039-01A2, programmet för neurologi forskning &#38; upptäckt, och A. Alfred Taubman Medical Research Institute vid University of Michigan. Detta arbete använde morfologi och bild analys Core för Michigan Diabetes Research Center, finansieras av nationella institut för hälsa Grant 5P 90 DK-20572 från nationella institutet för Diabetes och mag- och njursjukdomar. Författarna vill tacka J. Robinson Singleton och A. Gordon Smith (University of Utah) för deras generösa donation av mänsklig hud prover.

hud punch biopsier erhölls från ämnen som rekryterades från ett stort community-baserade primärvården nätverk vid University of Utah Diabetes Center (Salt Lake City, UT). Denna studie godkändes av University of Michigan institutionella granskning styrelsen och följt grundsatserna i Helsingforsdeklarationen. Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje ämne före provning.
 1. fluorescens immunohistokemi <ol><li>förbereda punch biopsier för intraepidermal nerv fibe...

Detta protokoll är utformad för att isolera, kvantifiera och analysera storleken och fördelningen av nerv-specifika mitokondrier inom IENFs i 3D från mänsklig hud biopsier. Det finns flera kritiska steg i protokollet. Fritt flytande fluorescens immunohistokemi är utformade för att fläcken flera signaler i varje prov, som ger en mer mångsidig metod för explorativ forskning44,45. Detta förfarande möjliggör penetrering av antikroppar i vävnaden för at...

Mitokondrier tjänar vitala cellulära funktioner som inkluderar producera cell energi, buffrande kalcium, och reglerar nekrotisk och apoptotiska cell death1,2,3. Nervsystemet har en hög ämnesomsättning jämfört med kroppen4 tyder på att nervceller genererar en hög grad av cellulär energi i form av adenosintrifosfat (ATP) genom mitokondriell respiration. En hel del bevis dokument att neuronala funktioner är beroende av ATP5, särskilt på de synapser6. Fördelningen av mitokondrier inom nervceller är därför viktigt.
Under de senaste 10 åren en hel del information har visat att människohandel och dockning av neuronala mitokondrier är hårt reglerad. Motorproteiner är involverade i Distribuera mitokondrier till specifika cellulära fack i hela neuron. Handel med mitokondrier är särskilt viktigt eftersom nervceller project axoner och dendriter långt borta från soma. Kinesin motorproteiner direkt främst anterograd (bort från soma) människohandel mitokondrier längs mikrotubuli medan dynein motorproteiner direkt retrograd (mot soma) motilitet7,8,9 , 10. finns det cellulära signaler sådan mitokondriella membranpotential och impuls överledning som påverkar närvaro och riktning av mitokondriell människohandel11,12,13.
Förutom transport av mitokondrier, finns det specialiserade proteiner att lokalisera mitokondrier till specifika cellulära fack som har hög energi krav, såsom noder av Ranvier och synapser8,14, 17. I själva verket flesta av mitokondrier inom axoner är icke-rörliga9,13,18. Specialiserade proteiner som syntaphilin ankare mitokondrier till mikrotubuli längs axoner medan andra proteiner förankra mitokondrier till aktin cytoskelettet19–21. Tillväxtfaktorer och joner såsom kalcium har rapporterats att stödja upphörandet av mitokondrier rörelse att lokalisera dem till regioner där de är nödvändiga21,22,23.
Sammantaget är den människohandel och för av mitokondrier avgörande för korrekt funktion av nervceller. Till stöd för detta, har störningar i mitokondriell människohandel förknippats med flera neurologiska sjukdomar inklusive ALS, Huntingtons sjukdom, Charcot-Marie-Tooth sjukdom, Alzheimers sjukdom, hereditär spastisk parapares och Optikusatrofi15,24,25,26,27. Nyligen genomförda studier har fokuserat på mitokondriell dysfunktion och patologi som potentiella mekanism för diabetisk neuropati, det sensoriskt bortfall som förknippas med diabetes28,29,30,31 ,32,33. Hypotesen är att diabetes förändrar fördelningen av mitokondrier inom sensoriska projektionerna av kutan nervänden. Därför utvecklades en teknik för att visualisera och kvantifiera mitokondrier inom intraepidermal nervfibrerna (IENFs), distala spetsarna av dorsalrotsganglier ganglion sensoriska afferenter. Tekniken kombinerar fluorescens immunohistokemi av specifika mitokondrie och nerv fiber etiketter med konfokalmikroskopi z-serie förvärv av signaler med kraftfulla 3D-bild analys programvara att mäta fördelningen av nerv-specifika mitokondrier från mänskliga kutan punch biopsier att uppnå detta mål.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:267px;">2% Zamboni&#39;s Fixative</td>
			<td style="width:200px;">Newcomer Supply, Middleton, WI&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1459A</td>
			<td style="width:363px;">2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">BP399-4</td>
			<td style="width:363px;">To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:267px;">Image-iT FX Signal Enhancer</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">I36933</td>
			<td style="width:363px;">enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:267px;">Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td style="width:200px;">Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td>
			<td style="width:199px;">14730-1-AP</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:267px;">Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td>
			<td style="width:200px;">abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:199px;">ab110333</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PDH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11034</td>
			<td style="width:363px;">red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11032</td>
			<td style="width:363px;">green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:267px;">Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">A7906-100</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as BSA</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">Triton X- 100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">T9284</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as TX-100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:267px;">0.22 &#181;m Filter</td>
			<td style="width:200px;">EMD Millipore, Billerica 
			MA</td>
			<td style="width:199px;">MILLEX GP SLGP 033NS</td>
			<td style="width:363px;">0.22 &#181;m Millipore filter</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">13-374-10</td>
			<td style="width:363px;">Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Non-calibrated Loop</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">22-032092</td>
			<td style="width:363px;">inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">96-well Assay Plate</td>
			<td style="width:200px;">Corning Incorporated, Corning, NY</td>
			<td style="width:199px;">3603</td>
			<td style="width:363px;">96-well flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">P-36931</td>
			<td style="width:363px;">DAPI staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:267px;">Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-544E</td>
			<td style="width:363px;">Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-550-15</td>
			<td style="width:363px;">Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:267px;">Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td style="width:200px;">Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">SP5</td>
			<td style="width:363px;">Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Volocity x64 Software&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Perkin Elmer, Waltham , MA</td>
			<td style="width:199px;">version 4.4.0</td>
			<td style="width:363px;">Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td>
			<td style="width:200px;">Bitplane, Concord, MA</td>
			<td style="width:199px;">version 7.7.1</td>
			<td style="width:363px;">Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:267px;">Excel</td>
			<td style="width:200px;">Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td style="width:199px;">version Office 2013</td>
			<td style="width:363px;">Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">Optimum Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:200px;">Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td>
			<td style="width:199px;">4583</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as OCT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Leica Cryostat</td>
			<td style="width:200px;">Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">CM1850</td>
			<td style="width:363px;">Cryostat for cutting 50 &#181;m sections</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">C10600</td>
			<td style="width:363px;">Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

Målet med detta protokoll är att studera mitokondrierna inom intraepidermal nervfibrer. Därför utvecklades 3D imaging och analystekniker för att isolera nerv-specifika mitokondrier och utvärdera sjukdom-inducerad förändringar av mitokondrier i den distala spetsen på sensoriska nerver. Protokollet kombinerar fluorescens immunohistokemi, konfokalmikroskopi och 3D-bild analystekniker för att visualisera och kvantifiera nerv-specifika mitokondrier. Detaljerade parametrar definieras i hela förfarandena för att ge ett konkret exempel på hur du använder dessa tekniker för att isolera nerv-specifika mitokondrier. Antikroppar användes att märka nerv och mitokondrie signaler inom vävnadssnitt hud punch biopsier, som följdes av indirekt immunofluorescens att visualisera nerver och mitokondrier med gröna och röda fluorescerande signal respektive. Z-serie bilder förvärvades med konfokalmikroskopi och 3D analysprogramvara användes för att bearbeta och analysera signalerna. Det är inte nödvändigt att följa de exakta parametrar beskrivs inom, men det är viktigt att vara konsekvent med de valt under färgningen, förvärv och analys steg. Styrkan i detta protokoll är att den är tillämplig på en mängd olika omständigheter där en fluorescerande signalen används för att isolera andra signaler som annars skulle vara omöjligt att studera ensam.

Visualisering och kvantifiering av mitokondrier inom mänskliga IENFs
Fluorescens immunohistokemi möjliggör samtidiga märkning av flera signaler inom mänsklig hud biopsier att visualisera nerver, mitokondrier och kärnor. En plattan med 96 brunnar är ett bekvämt sätt att organisera stegen i förfarandet för immunohistokemi. Figur 1 visar att denna konfiguration står för up...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Detta protokoll använder tredimensionella (3D) imaging och analystekniker för att visualisera och kvantifiera nerv-specifika mitokondrier. Teknikerna som är tillämpliga på andra situationer där en fluorescerande signalen används för att isolera en delmängd av data från en annan fluorescerande signal.

Tredimensionell avbildning och analys av mitokondrier inom mänskliga Intraepidermal nervfibrer

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Upprättande och immunfärgning av Mouse känselnervtrådar Innervating Hud och Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Three Dimensional Vestibular Ocular Reflex Testing Using a Six Degrees of Freedom Motion Platform

Tredimensionell Vestibulära okulära reflexen tester med en sex frihetsgrader Motion Platform

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selektiv spåra Auditiva fibrer i Avian embryonala Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll för Tredimensionell Confocal Morfometrisk Analys av Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Storskaliga tredimensionell avbildning av cellulära organisation i mus hjärnbarken

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Tredimensionell form modellering och analys av hjärnstrukturer

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Inriktning alpha Synuclein aggregat i kutan perifer nerv fibrer av fritt flytande immunofluorescens assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analys för funktionell utvärdering i Rat Modell av Sciatic Nerve Crush Skada

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Bildbehandling och analys av neurofilament transport i struket Mus Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...