Name: three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Bu eser Ulusal kurumları sağlık hibe K08 NS061039-01A2, Nöroloji araştırma için Program tarafından desteklenen &#38; keşif ve A. Alfred Taubman Tıbbi Araştırma Enstitüsü Michigan Üniversitesi'nde. Bu eser morfoloji ve görüntü analiz çekirdek Michigan diyabet araştırma merkezinin Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 5 P 90 DK-20572 diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim ve böbrek hastalıkları tarafından finanse edilen kullanılır. Yazarlar insan deri örnekleri onların cömert bağış için J. Robinson Singleton ve A. Gordon Smith (Utah Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum.

(Salt Lake City, UT) Utah Üniversitesi diyabet Merkezi'nde büyük topluluk tabanlı birinci basamak sağlık ağdan işe konulardan elde edilen deri punch biyopsi. Bu çalışma Michigan Üniversitesi Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylanmış ve Helsinki Deklarasyonu ilkelerinin ile uyulması. Aydınlatılmış onam test önce her konudan elde edilen yazılı.
 1. Floresans immünhistokimya <ol><li>hazırla punch biyopsi intraepidermal Sinir lifi immünhistokimya i...

Bu iletişim kuralı izole etmek, ölçmek ve boyutu ve sinir özgü mitokondri içinde IENFs 3D insan cilt biyopsileri üzerinden dağıtımını çözümlemek için tasarlanmıştır. Protokolünde çeşitli kritik adımlar vardır. Serbest dalgalanma Floresans immünhistokimya leke ve her örneğinde, Araştırma araştırma44,45için daha çok yönlü bir metodoloji sağlayan Çoklu sinyaller çözümlemek için tasarlanmıştır. Bu yordamı confocal mikrosk...

Mitokondri hücre enerji, kalsiyum ve nekrotik düzenleyen ve apoptotik hücre ölüm1,2,3tampon üreten dahil önemli hücresel işlevler hizmet. Sinir sistemi nöronlar hücresel enerji yüksek derecede adenozin trifosfat (ATP) formunda oluşturmak düşündüren vücut4 mitokondrial solunum ile karşılaştırıldığında yüksek bir metabolizma hızı vardır. Bir sürü kanıt belgeleri nöronal işlevleri ATP5, özellikle de sinapslarda6bağlıdır. Bu nedenle, mitokondri nöronlar içinde dağılımı önemlidir.
Bir sürü bilgi bu trafiği ve nöronal mitokondri rıhtım göstermiştir son 10 yıl içinde son derece düzenlenmiştir. Motor proteinler mitokondri nöron boyunca belirli hücresel kompartmanlarda için dağıtma katılmaktadırlar. Nöronlar proje akson ve dendrites uzakta soma mitokondri kaçakçılığı özellikle önemlidir. Kinesin motor proteinler öncelikle anterograd (soma) uzak mitokondri mikrotübüller dinein motor proteinler doğrudan (soma doğru) retrograd hareketliliği7,8,9 süre boyunca, kaçakçılığı doğrudan , 10. böyle bir mitokondri zar potansiyeli ve varlığı ve mitokondrial kaçakçılığı11,12,13yönünü etkileyen impuls iletim hücresel sinyalleri vardır.
Mitokondri taşıma yanı sıra, mitokondri ve Ranvier düğümleri ve sinapslarda8,14, gibi yüksek enerji talepleri belirli hücresel kompartmanlarda için yerelleştirmek için özel proteinler vardır 17. aslında, mitokondri içinde aksonlar hareketli9,13,18çoğu. Özel proteinler gibi syntaphilin çapa mitokondri mikrotübüller diğer proteinler çapa mitokondri aktin sitoiskeleti19-21ise akson boyunca için. Büyüme faktörleri ve kalsiyum gibi iyonları mitokondri hareket onları gerekli21,22,23nerede olduklarını bölgelerine yerelleştirmek için kesilmesi desteklemek için rapor edilmiştir.
Birlikte ele alındığında, ticareti ve mitokondri yerleştirme nöronlar için düzgün bakımından çok önemlidir. Bu destek, Alzheimer hastalığı, amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı, Huntington hastalığı, herediter Spastik dahil olmak üzere çeşitli nörolojik koşullar ile ilişkili mitokondrial kaçakçılığı bozulma olmuştur paraparesis ve optik Atrofi15,24,25,26,27. Son yıllarda yapılan çalışmalarda diyabetik nöropati, diyabet28,29,30ile,31 ilişkili duyu kaybı için potansiyel bir mekanizma olarak mitokondrial disfonksiyon ve patoloji üzerinde odaklanmıştır ,32,33. Diyabet mitokondri Kutanöz sinir biten duyusal projeksiyonlar içinde dağıtım değiştirir hipotezdir. Bu nedenle, bir teknik görselleştirmek ve mitokondri içinde intraepidermal sinir lifleri (IENFs), dorsal kök gangliyon duyusal afferents distal ipuçları ölçmek için geliştirilmiştir. Teknik Floresans immünhistokimya özel mitokondrial ve sinir lifi etiket sinir özgü dağılımını ölçmek için sinyalleri güçlü 3D görüntü analiz yazılımı ile confocal mikroskobu z serisi satın alma ile birleştirir. Bu hedefe ulaşmak için insan Kutanöz punch biyopsi üzerinden mitokondri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:267px;">2% Zamboni&#39;s Fixative</td>
			<td style="width:200px;">Newcomer Supply, Middleton, WI&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1459A</td>
			<td style="width:363px;">2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">BP399-4</td>
			<td style="width:363px;">To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:267px;">Image-iT FX Signal Enhancer</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">I36933</td>
			<td style="width:363px;">enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:267px;">Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td style="width:200px;">Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td>
			<td style="width:199px;">14730-1-AP</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:267px;">Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td>
			<td style="width:200px;">abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:199px;">ab110333</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PDH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11034</td>
			<td style="width:363px;">red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11032</td>
			<td style="width:363px;">green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:267px;">Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">A7906-100</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as BSA</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">Triton X- 100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">T9284</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as TX-100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:267px;">0.22 &#181;m Filter</td>
			<td style="width:200px;">EMD Millipore, Billerica 
			MA</td>
			<td style="width:199px;">MILLEX GP SLGP 033NS</td>
			<td style="width:363px;">0.22 &#181;m Millipore filter</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">13-374-10</td>
			<td style="width:363px;">Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Non-calibrated Loop</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">22-032092</td>
			<td style="width:363px;">inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">96-well Assay Plate</td>
			<td style="width:200px;">Corning Incorporated, Corning, NY</td>
			<td style="width:199px;">3603</td>
			<td style="width:363px;">96-well flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">P-36931</td>
			<td style="width:363px;">DAPI staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:267px;">Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-544E</td>
			<td style="width:363px;">Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-550-15</td>
			<td style="width:363px;">Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:267px;">Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td style="width:200px;">Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">SP5</td>
			<td style="width:363px;">Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Volocity x64 Software&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Perkin Elmer, Waltham , MA</td>
			<td style="width:199px;">version 4.4.0</td>
			<td style="width:363px;">Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td>
			<td style="width:200px;">Bitplane, Concord, MA</td>
			<td style="width:199px;">version 7.7.1</td>
			<td style="width:363px;">Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:267px;">Excel</td>
			<td style="width:200px;">Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td style="width:199px;">version Office 2013</td>
			<td style="width:363px;">Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">Optimum Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:200px;">Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td>
			<td style="width:199px;">4583</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as OCT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Leica Cryostat</td>
			<td style="width:200px;">Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">CM1850</td>
			<td style="width:363px;">Cryostat for cutting 50 &#181;m sections</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">C10600</td>
			<td style="width:363px;">Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

Bu iletişim kuralının amacı mitokondri içinde intraepidermal sinir lifleri incelemektir. Bu nedenle, 3D görüntüleme ve analiz teknikleri sinir özgü mitokondri yalıtmak ve duyusal sinir distal ucu mitokondri hastalığı kaynaklı değişikliklere değerlendirmek için geliştirilmiştir. Protokol Floresans immünhistokimya, confocal mikroskobu ve görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için 3D görüntü analiz teknikleri birleştirir. Detaylı parametreleri yordamlarda sinir özgü mitokondri yalıtmak için bu teknikleri kullanmayı gösteren somut bir örnek vermek için tanımlanır. Hangi sinirler ve mitokondri yeşil ve kırmızı floresan sinyali ile sırasıyla görselleştirmek için dolaylı ayirt tarafından izledi biyopsi, deri doku bölümleri içinde mitokondrial sinyalleri yumruk ve antikorlar sinir etiketlemek için kullanıldı. Z-serisi görüntüleri confocal mikroskobu ile satın alınan ve 3D analiz yazılımı işlemek ve sinyalleri analiz etmek için kullanıldı. İçinde açıklanan tam parametreleri takip için gerekli değildir, ancak boyama boyunca, toplama ve analizi adımları seçilmiş olanlar ile tutarlı olması önemlidir. Bu iletişim kuralı bir floresan sinyal aksi Yalnız çalışmak imkansız diğer sinyalleri yalıtmak için kullanıldığı çok çeşitli koşullar uygulanabilir olduğunu gücüdür.

Görselleştirme ve mitokondri içinde insan IENFs miktar
Floresans immünhistokimya sinirler, mitokondri ve çekirdekleri görselleştirmek için Çoklu sinyaller insan cilt biyopsileri içinde eşzamanlı etiketleme için sağlar. 96-şey plaka immünhistokimya yordamdaki adımları düzenlemek için kullanışlı bir yol var. Şekil 1 bu kadar çözümler 12 aşamalarında işlen...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers at JoVE.com

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Bu iletişim kuralı görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için üç boyutlu (3D) görüntüleme ve çözümleme teknikleri kullanır. Teknikleri bir floresan sinyal başka bir floresan sinyalinden gelen verilerin bir alt kümesini yalıtmak için kullanıldığı diğer durumlar için geçerlidir.

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Three Dimensional Vestibular Ocular Reflex Testing Using a Six Degrees of Freedom Motion Platform

Özgürlük Hareket Platformu Six Degrees kullanarak Üç Boyutlu Vestibüler Oküler Refleks Testi

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Kuş Embriyonik vestibülokoklear sinir İşitsel Elyaf seçici Aydınger

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Beyin Yapılarının Üç Boyutlu Şekil Modellemesi ve Analizi

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Serbest yüzen Immünofluorescence tahlil ile kutanöz periferik sinir lifleri Alfa Synuclein toplamları hedefleme

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...