Name: measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

इस काम एसएसटी के लिए स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (31003A_135278) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। एमओपी एक्सा रिसर्च फंड से एक डॉक्टरेट अनुदान के लाभार्थी है। हम यह आंकड़ा 1 के डिजाइन के साथ मदद के लिए पेट्रीसिया Nigg धन्यवाद।

पहले शुरू नोट: उपयोग लामिना का प्रवाह हुड और उचित biocontainment जीवित वायरस के साथ काम कर रहे हैं। यहाँ, हम संस्कृति इन्फ्लूएंजा वायरस तनाव ए / डब्लूएसएन / 33 के लिए उपयुक्त विकास की स्थिति का वर्णन है। संक्रमण की ?...

<ol>
	<li>Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+influenza+A+virus:+host+factors+and+antiviral+targets.">Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets.</a> J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virolog. 2, (2007).</li><li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line.">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).</li><li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+can+enter+and+infect+cells+in+the+absence+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis.</a> J Virol. 76, 10455-10464 (2002).</li><li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry.">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway.">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans.">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li><li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+facilitates+sialic+acid-independent+attachment+and+entry+of+influenza+A+viruses+into+cells+expressing+DC-SIGN+or+L-SIGN.">N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN.</a> J Virol. 85, 2990-3000 (2011).</li><li>Wang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC-SIGN+mediates+avian+H5N1+influenza+virus+infection+in+cis+and+in+trans.">DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans.</a> Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).</li><li>Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolidase+is+required+for+early+trafficking+events+during+influenza+A+virus+entry.">Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry.</a> J Virol. 88, 11271-11283 (2014).</li><li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication.">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li><li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu:+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy.">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li><li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes.">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li><li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death.">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Macey, M. G., Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Principles and Applications. , (2007).</li><li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes.">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li></ol>

हमारी प्रोटोकॉल फ्लो द्वारा वायरस लगाव और internalization को मापने का एक आसान तरीका वर्णन करता है। यह वायरस की तरह कण (VLP) के उपयोग की तुलना में अधिक है जो बारीकी mimics के वायरस के संक्रमण के लेबल wildtype वायरस के उपयोग की अ...

इन्फ्लूएंजा ए वायरस (IAV) के प्रवेश के लक्ष्य कोशिकाओं 1 के प्लाज्मा झिल्ली पर रिसेप्टर्स करने के लिए वायरस का बंधन के साथ शुरू होता है कि एक बहु कदम प्रक्रिया है। IAV लिए रिसेप्टर ग्लाइकोप्रोटीन और glycolipids की एक बड़ी विविधता पर मौजूद है जो सियालिक एसिड है। वायरल लिफाफे में मौजूद है जो IAV की hemagglutinin (हेक्टेयर) प्रोटीन सियालिक एसिड को बांधता है और जिससे लक्ष्य कोशिकाओं 2 के प्लाज्मा झिल्ली को वायरल कणों की कुर्की मध्यस्थता करता है। वायरस 3-6 वर्णित किया गया है क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis के माध्यम से कोशिकाओं बल्कि ऐसी macropinocytosis के रूप में वैकल्पिक प्रवेश मार्ग है, में प्रवेश करती है। हा और सियालिक एसिड के बीच बातचीत, दोनों मध्यस्थता लगाव और वायरल कणों 7 के internalization ट्रिगर के लिए पर्याप्त होना प्रतीत होता है। फिर भी, वैकल्पिक प्रवेश रिसेप्टर्स प्रस्तावित किया गया है और IAV प्रविष्टि में उनकी भूमिकाओं वर्तमान में 1,8,9 की जांच की जा रही है। चालूrently, प्रयासों की तत्काल जरूरत उपन्यास एंटीवायरल उपचारों 10-12 विकसित करने के उद्देश्य के साथ वायरल जीवन चक्र में शामिल कर रहे हैं कि मेजबान कारकों की पहचान करने के लिए बना रहे हैं। वायरस प्रवेश जल्द से जल्द अपने बिंदु पर वायरल संक्रमण को ब्लॉक करने के क्रम में IAV विकास लक्षित करने के लिए एक अनुकूल कदम होगा। वायरस की आमतौर पर बड़ी मात्रा में भेजे गए वायरस का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं के रूप में IAV प्रविष्टि के विभिन्न चरणों को मापने प्रयोगात्मक चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, वायरस प्रविष्टि में परिवर्तन के लिए सीमा का पता लगाने के कारण वायरल प्रतिकृति की कमी के कारण केवल रैखिक है। इस उच्च संवेदनशीलता के साथ assays के लिए की जरूरत को रेखांकित करता है। यहाँ प्रस्तुत परख सेल जुड़े वायरस की कुल राशि के संबंध में कोशिका की सतह पर संलग्न वायरस का पता लगाने के साथ ही भाँति वायरस का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। biotinylated wildtype वायरस का उपयोग फ्लो द्वारा एसटीवी-Cy3 साथ धुंधला और readout के माध्यम से सुविधाजनक माप सक्षम बनाता है। Biotinylated वायरस सेल करने के लिए ठंडे-बाउंड हैएस लगाव की अनुमति लेकिन वायरल कणों के internalization रोकने के लिए। सेल, तय permeabilized और संलग्न वायरस को मापने के लिए एसटीवी-Cy3 के साथ दाग जा सकता है। एक अवरुद्ध कदम कोशिकाओं गैर लेबल streptavidin (एसटीवी) के साथ incubated रहे हैं, जिसमें निर्धारण से पहले लागू किया जाता है, तो बाह्य, संलग्न virions से संकेत निराकृत किया जा सकता है। एक अगले चरण में, biotinylated IAV की कुर्की के बाद, तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित कर दिया जाता है और वायरल कणों के internalization जगह लेने के लिए अनुमति दी है। भाँति कणों जिससे अतिरिक्त और intracellular वायरस के बीच भेदभाव की इजाजत दी एसटीवी के बंधन से सुरक्षित हैं। प्रयोगात्मक शर्त के अनुसार, चार नमूने की आवश्यकता है: &#39;0 मिनट&#39;: पहला नमूना, लेबल &#39;0 मिनट&#39;, कोशिका की सतह पर ठंड बाध्य वायरस को मापने के लिए है। &#39;0 मिनट + एसटीवी&#39;: दूसरा नमूना, &#39;0 मिनट + एसटीवी&#39; लेबल, प्रयोग के आधारभूत संकेत तीव्रता देता है। संलग्न वायरस बुद्धि अवरुद्ध हैज एसटीवी और एसटीवी-Cy3 के साथ संकेत के बाद धुंधला &#39;0 मिनट&#39; नमूने की तुलना में काफी कम किया जाना चाहिए। &#39;30 मिनट &#39;: तीसरे नमूना, &#39;30 मिनट&#39; की वजह से 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान पारी से जुड़ी है और वायरस भाँति होता है। &#39;30 मिनट + एसटीवी &#39;: चौथा नमूना, &#39;30 मिनट + एसटीवी&#39; उपायों वायरस के intracellular अंश। एसटीवी अवरुद्ध कदम 30 मिनट ऊष्मायन अवधि के बाद लागू किया जाता है। नतीजतन, कोशिका की सतह पर वायरल कणों एसटीवी-Cy3 साथ धुंधला करने के लिए केवल भाँति वायरस उपलब्ध छोड़ने एसटीवी से बंधे हुए हैं। भाँति वायरस के रिश्तेदार राशि &#39;(नमूना &#39;30 मिनट से वर्णित) वायरस की कुल राशि से विभाजित (नमूना &#39;30 मिनट + एसटीवी में मापा)&#39; भाँति वायरस के अनुपात के रूप में गणना की जा सकती है। नियंत्रण के रूप में हम नकली संक्रमित कोशिकाओं को शामिल करने का सुझाव देते हैं। नकली संक्रमित कोशिकाओं के एसटीवी-Cy3 धुंधला निम्नलिखित संकेत पृष्ठभूमि देता हैधुंधला प्रोटोकॉल से उत्पन्न। IAV लगाव के लिए एक नियंत्रण बैक्टीरियल neuraminidase (एनए) के साथ कोशिकाओं के पूर्व उपचार है। सेलुलर ग्लाइकोप्रोटीन से सियालिक एसिड बंद एनए cleaves, जिससे कोशिका की सतह से लगाव रिसेप्टर्स को हटाने। सोडियम azide (एसए) एक शक्तिशाली चयापचय अवरोध करनेवाला है और इस तरह ब्लॉकों 13 endocytosis। सोडियम azide के साथ इलाज किया कोशिकाओं internalization के लिए बाध्यकारी वायरस के लिए सकारात्मक है लेकिन नकारात्मक होना चाहिए।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR Calbiochem</td>
			<td>126579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>20092391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Rad Protein Bio Assay</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td>
			<td>Milian</td>
			<td>82 00 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>&#160;Lucerna chem&#160; Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Hemotec HmbH</td>
			<td>253070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV-Cy3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial neuraminidase/sialidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6514-1UN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

चार अलग-अलग प्रयोगात्मक शर्तों का वर्णन एक कार्टून चित्र 1 में दिखाया गया है एक प्रतिनिधि प्रयोग के परिणाम आंकड़े 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं -। 5। &quot;0 मिनट&quot; नमूने में, biotinylated वायरस ठंड बाध...

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Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

फ्लो द्वारा A549 कोशिकाओं में लगाव और Internalization इन्फ्लूएंजा के एक वायरस को मापने

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

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