Name: rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem
Uploaded: 2015-12-21T14:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem at JoVE.c

This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

The authors have nothing to disclose or any conflicts of interest.

وقد تجلى إسكات الجينات في مسببات الأمراض الفطرية 27،43، ولكن النبات المضيف رني بوساطة، لا توجد المنشورات التي تبين جدوى تحكم رني بوساطة من تراكم السموم الفطرية في النباتات. وكان أحد العوامل المحددة لهذه الدراسات في الفول السوداني لعدم وجود طريقة لتقييم تراكم النمط الظاهري عدم الأفلاتوكسين في النباتات الفردية، كما تظهر أوراق أي أعراض على العدوى الفطرية القرون تحت الأرض. وبالإضافة إلى ذلك، وتراكم توزيع يست عادة من السموم الفطرية، والحاجة للحصول على عينات كبيرة للتحليل الكيميائي 15،16 أعاقت القياس الكمي لتأثير رني المحتمل على محطة واحدة. الطريقة المعروضة هنا يتكون من 72 ساعة التجارب باستخدام خمسة بذور لأداء ثلاث عينات 24 ساعة بعد الفترة في ثلاث نسخ (الجدول 1، الشكل 7). مقارنة لتحليل الأفلاتوكسين النموذجية التي تتطلب ما لا يقل عن 100 غرام من البذور، وأسلوبنا هو مناسبة خاصة لindividuaأحداث ل المعدلة وراثيا من النباتات الفول السوداني التي تنتج في البداية لا يزيد عن اثنين أو ثلاثة قرون. وقد تجلى إسكات بوساطة الحمض النووي الريبي التوليف الأفلاتوكسين عن طريق تحويل وراثيا فلافس وA. الطفيلي. منذ aflR غير منظم الرئيسي لإنتاج الأفلاتوكسين في A. فلافس وA. الطفيلي 44،45، فإنه يصبح هدفا للاهتمام لإسكات بوساطة الحمض النووي الريبي في النباتات. ومع ذلك، فقد ثبت الاختلافات الجينية في aflR بين الرشاشيات الأنواع 46، وتلك المتغيرات الجينية يمكن الهروب إسكات إذا لم يكن هناك تسلسل الكمال مطابقة مع الإشارة رني المنتجة في البلد المضيف النبات. وهكذا، كان aflR واحدا من الأهداف لإسكات في ناقلات p5XCAPD، ولكنه لم يكن الوحيد. يكرر مقلوب من الجين aflR أدخلت A. فلافس وA. أدى الطفيلي عن طريق التحول في إسكات والحد الأدنى أو أي منتجأيون من الأفلاتوكسين 47 (ماكدونالد وآخرون، 2005b). أيضا، منع إسكات الجينات aflD إنتاج الأفلاتوكسين بنسبة تصل إلى 98٪ في A. فلافس وA. الطفيلي في التحول المباشر 48. لزيادة احتمال النجاح في نظامنا، تحولت الفول السوداني مع تكرار شظايا مقلوب خمس جينات لها دور في إنتاج الأفلاتوكسين في A. فلافس. هنا يتبين أن استخدام p5XCAPD الذي يستهدف لإسكات جينات عديدة في مسار تخليق الأفلاتوكسين، و 90٪ انخفاض مستويات -100٪ من الأفلاتوكسين ب 1 و ب 2 تحققت في خط 288-72، وانخفاض مستويات 60-100٪ تراكمت في خط 288-74 مقارنة بالمجموعة الضابطة، عندما تم تلقيح النبتات نصف مع A. فلافس، أرقام 4 و 7. والأهم من ذلك، الكشف عن هذه الطريقة فروق ذات دلالة إحصائية في تراكم الأفلاتوكسين من خطوط 288-72، 288-74 مقابل السيطرة في كافة مراحل التجربة من خلال تطبيق statis حدوديالتشنجات اللاإرادية، الشكل (7). ونظرا لصغر حجم العينة، من المهم تسليط الضوء على الحاجة إلى استخدام وسيلة قوية للكشف عن السموم الفطرية، وقد تم تحليل هذه التجارب من قبل UPLC التي لديها ارتفاع القرار، وخمسة أضعاف الأداء العالي وحساسية أعلى ثلاث مرات من HPLC 49. التعبير عن رني إدراج في 288-74 تم الكشف فقط في الفلقات غير الناضجة (الأصفر) في 24 ساعة الحضانة. لم يتم الكشف عن إدراج رني بواسطة RT-PCR على النبتات ناضجة من 288-74 في 24 ساعة، أو على أي مجموعة النضج في 48 ساعة، الشكل (6). وقد لوحظ هذه الظاهرة نفسها في رني خطوط الفول السوداني المعدلة وراثيا أخرى (أرياس، RS، 2015 غير منشورة)، حيث تم الكشف عن عادة النصوص رني فقط على النبتات غير ناضجة في 24 ساعة. وعولج عينات الحمض النووي الريبي مع الدناز قبل التوليف [كدنا، كانت البيانات تطبيع إلى مستوى الأكتين التعبير وأي دليل على تلوث DNA لوحظ. كان ينبغي أن يكون DNA الموجودة في العينات، ينبغي عليهتم الكشف في العينات ساعة 48 أيضا، ولكن باستمرار أن الأمر لم يكن كذلك. التعبير تحت سيطرة 35S-المروج ليست دائما موحدة. يمكن أن تتأثر الظروف البيئية 50، ونوع الأنسجة والمرحلة التنموية 51،52. وفي الوقت نفسه، في مسار التدخل RNA، فإن معدل تسوس مرنا ومعدل تسوس سيرنا يمكن أن تختلف بشكل كبير 53. فمن الممكن أن التدهور السريع للمرنا من خلال آلية التدخل RNA يمكن أن يمنع الكشف عن مرنا في 48 ساعة الحضانة. إذا كان غياب التعبير في 48 ساعة نظرا لانخفاض 35S-المروج مدفوعة النسخ، أو إلى تدهور سريع من الرنا المزدوج الجديلة التي المقامر ينتظر الجواب. وبالتالي، فإن الكشف عن الرنا الصغيرة عالية الإنتاجية تسلسل تعطي فكرة أفضل عن العمليات التي تجري من خلال رني 54 في هذه التجارب. ومع ذلك، منذ RNA إسكات ينتشر بشكل منتظم، وذلك أساسا من خلال اللحاء من photosyntأكره المصادر إلى السكروز المصارف (في هذه الحالة بذور الفول السوداني) 55، يمكن أن يحدث إسكات الأفلاتوكسين التوليف في البذور دون التعبير المحلي للرني إدراج. لا يزال الكثير من الأبحاث إلى أن يتم تحديد مستوى الحد الأدنى من الرنا التدخل الصغيرة (الرناوات siRNAs) اللازمة لمنع تراكم الأفلاتوكسين في البذور. ومن المهم أن نؤكد على حقيقة أن كلا من والتعبير مرنا للرني بناء (الشكل 6)، وأظهر تراكم السموم الفطرية B 1 و B 2 (الشكل 7) نتائج مختلفة عن غير ناضجة (الصفراء) مقابل. ناضجة (البني) النبتات. نباتات الفول السوداني لها النمو غير محدد، أي أنها تقدم عند الحصاد مجموعة من القرون النضج، الشكل 2. وبالإضافة إلى ذلك، والبذور من جماعات النضج المختلفة تختلف في تركيبتها الكيميائية، على سبيل المثال، 2،4٪ سكروز في البذور غير الناضجة، و 1.9٪ في البذور الناضجة تحت نفس الظروف الميدانية 56،57. وهكذا، لفهم الكفاءه الفعليةذ السيطرة بوساطة RNA تراكم الأفلاتوكسين، فمن المهم تحليل مجموعة النضج بشكل منفصل. A دفاع الطبيعي للبذور الفول السوداني هو إنتاج phytoalexins، والتي تختلف في تنوع المركبات المنتجة وكمياتها النسبية تبعا لنضج البذور والظروف البيئية 58-61، وكان أعلى بشكل خاص في الأجنة مقارنة النبتات 62. يكون الأجنة أيضا على تركيزات أعلى بكثير من الأحماض النووية، سواء DNA و RNA من النبتات (أرياس RS، غير منشورة). كما بذور الفول السوداني تنضج، والتغيرات في علم وظائف الأعضاء، والتركيب الكيميائي تحدث 63. مضادات الأكسدة الفينولية في شكل تيستا الفول السوداني العفص مكثف مع نشاط كابح الفطريات 64؛ وهذا هو أيضا واضح في لون ميزوكارب التي تعكس مراحل النضج والأصفر إلى الأسود 35، ومحتواه من العفص والمركبات الفينولية يزيد مع استحقاق 65. وبالتالي، وجود رتهت أو الأجنة في التجربة، نظرا خصائصها المضادة للميكروبات، يمكن أن يقتصر نمو الفطريات، وبالتالي المبالغة في تقدير تأثير رني إسكات، وبالتالي، تم إزالتها. أيضا، إزالة تيستا والأجنة تساعد لحد من مصادر التباين في التحليل، ونصف فلقة الذي يحمل فإن الجنين يكون أكثر phytoalexins والمزيد من المحتوى RNA. بالإضافة إلى تحليل من قبل الجماعات النضج وإزالة تيستا والجنين في هذه التجارب، من المهم أن نشير إلى عدد قليل من أكثر الملاحظات: أ) على الرغم من ظهور نتائج لمدة تصل إلى 96 ساعة الحضانة، فمن المستحسن استخدام ما لا يزيد عن 72 ساعة للحصول على نتائج متسقة، والحصول على تدهور البذور بنسبة 96 ساعة. وب) في حين أن نصف النبتات من نفس البذور، وعلى الرغم من العينة عشوائيا، لا تشكل عينات مستقلة تماما، وأظهر RT-PCR وتراكم الأفلاتوكسين ضمن أحداث المعدلة وراثيا الحد الأدنى الاختلاف بين البذور. أيضا، الاعتماد على الجراثيم الفطرية دقيق، وحجم اللقاحالصورة من 2 ميكرولتر، وتطبيق جراثيم على السطح قطع من النبتات تجنب نازف على جانبي مهمة للتأكد من يتعرضون للجراثيم نبتت إلى الأنسجة النباتية. يجب أن يكون الماء / أجار على لوحات عند 1.5٪ (ث / ت)، ليونة أجار يسبب جريان المياه من الجراثيم كما هو مبين في الإطار الأخير من الشكل 4 (القاع). يجب توافر البذور المعدلة وراثيا عن حدث معين تكون محدودة، ويمكن أن يتم أخذ العينات في نسختين بدلا من ثلاث نسخ الحصول على نتائج مماثلة (أي الشكل 7). ومع ذلك، فإن عينات من ثلاث نسخ يساعد على التقليل من الخطأ المعياري. والقيد الوحيد من هذا الأسلوب هو أنه يتطلب نظام حساسة للغاية (UPLC) للكشف عن الأفلاتوكسين / الكمي، ولكن في نفس الوقت وهذا يقلل من احتمال المبالغة في تقدير تأثير رني أن الأفلاتوكسين لا يتم الكشف عن طريق وسائل أقل حساسية. في الختام، هذا الأسلوب يقدم لأول مرة نهج يمكن الاعتماد عليها لدراسةتأثير رني في السيطرة على السموم الفطرية. تقليل الوقت لتجربة من الموسم الزراعي بأكمله إلى أقل من أسبوع واحد، وهذه الطريقة سوف يتسارع بشكل كبير للبحث عن رني الفول السوداني / الرشاشيات pathosystem نحو التخفيف و / أو القضاء على السموم الفطرية.

ويتعرض ما يقرب من 4.5 مليار شخص مزمن لالأفلاتوكسين 1، والمواد المسببة للسرطان أقوى المعروفة في الطبيعة 2. هذه السموم الفطرية تلوث 25٪ من المحاصيل الغذائية في العالم 3، بما في ذلك الذرة والمنيهوت والأرز والمكسرات والحبوب والتوابل. 4. الأفلاتوكسين سبب التقزم لدى الأطفال 5، يضعف الجهاز المناعي 6، موجودة في 58٪ من الكبد، سرطان في الخزعات الإنسان 7،8، وقتل مئات الاشخاص خلال تفشي الدورية للتسمم أفلاتوكسيني 9،10. الأفلاتوكسين هي السموم الفطرية المستمدة متعدد الكيتيد تنتج عادة عن طريق فلافس وA. الطفيلي. ويتم إنتاج السموم الفطرية B 1 و B 2 بواسطة A. فلافس، في حين A. الطفيلي كما تنتج G 1 و 2 G. ويبين التركيب الكيميائي لهذه المركبات واللوني يظهر انفصالهما قبل UPLC في الشكل 1. </strأونج&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> الشكل 1. الأفلاتوكسين ورني إدراج الأعلى: التركيب الكيميائي (يسار) ومثال اللوني (يمين) من السموم الفطرية المستمدة متعدد الكيتيد الأكثر شيوعا أربعة: B 1، B 2، G 1 و 2 G، التي تنتجها الرشاشيات الطفيلي، A وينتج فلافس B 1 و B 2 القاع: رسم تخطيطي من شظايا الجينات في رني بناء p5XCAPD المستخدمة للتحول الفول السوداني، وأرقام تحت السهام أرقام الانضمام الجينات جزء في فلافس الجينوم الرشاشيات؛ PIV2: إنترون البطاطا. أزواج الأساس؛: BP RT_5X_1 وRT_5X_2: في الوقت الحقيقي مواقع PCR التمهيدي <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الخسائر الاقتصادية في الصادرات بسبب السموم الفطرية في الفول السوداني وحده تتجاوز 450 مليون $ دولار أمريكي اذا حسبت على أساس 4 نانوغرام. ز -1 الحد من الأفلاتوكسين يسمح للاستهلاك البشري في الاتحاد الأوروبي 11. من المعروف أن السموم الفطرية لمدة 60 عاما 12؛ ومع ذلك، على الرغم من وضعت العديد من الممارسات الزراعية للحد من تأثيرها، بما في ذلك تطبيق السلالات الفطرية الأخرى 13،14، لا توجد طريقة ثابت من السيطرة موجودا، والأصناف النباتية المقاومة غير متوفرة. اختبار الأصول الوراثية النباتية لمقاومة السموم الفطرية أمر صعب للغاية، لأنه حتى في ظل ظروف مواتية لغزو الممرض، وتراكم السموم الفطرية لا يمكن التنبؤ بها ولا تتبع التوزيع الطبيعي. وبالتالي، تتطلب عادة التجارب المساحات المنزرعة كبيرة، ومئات من البذور وعينات متعددة من 100-1،700 ز للحد من تقلب من 15،16 البيانات. كان التدخل RNAاكتشف في عام 1998 17؛ وفوائد &quot;إسكات&quot; يجري حاليا بحث في عدد من التطبيقات الجديدة، على سبيل المثال، في العلاجات الإنسان ضد سرطان الثدي النقيلي 18، سرطان الكبد 19، سرطان الدم النخاعي 20، وحماية النباتات من الحشرات والديدان الخيطية 22 21. في النباتات، يمكن أن إشارات تدخل RNA السفر خلية إلى أخرى، مع RNA الصغيرة التدخل (سيرنا) وارتفاع الجزيئي RNA الوزن هي المسؤولة عن الجين posttranscriptional النظامية إسكات 23،24، حتى داخل مسببات الأمراض الفطرية التي هي على اتصال وثيق مع مضيفه مصنع 25. وقد وصفت فعالية رني على إسكات بوساطة مصنع للجينات للفطريات الممرض في عدد قليل من pathosystems النبات، لهذه، والفحص البصري للأعراض في الأجزاء الهوائية للنباتات (يترك) يسمح الكمي المرض، أي oomycete Bremia في الخس 26 ، بوسينيا في القمح <suP&gt; 27 والفيوزاريوم في الموز 28. أصعب بكثير هو تقييم فعالية رني للسيطرة على السموم الفطرية في النباتات، وعلى الأخص السموم الفطرية في الفول السوداني كما تظهر لا يترك أي أعراض للعدوى، وأجهزة غزت (بذور) تحت عدة بوصات من التربة، وحدوث عدوى لا يمكن التنبؤ بها، والكيميائي فقط تحليل يمكن تحديد وجود الأفلاتوكسين. بالإضافة إلى ذلك، كل حدث المعدلة وراثيا في الفول السوداني ينتج عادة عدد قليل من البذور (4-6 في النبات)؛ وبالتالي، الاختبار التقليدي لتراكم سمة عدم الأفلاتوكسين في مؤامرات ميدانية كبيرة ودائم المواسم الزراعية بأكملها، واستخدام المئات من البذور غير ممكن. ووصف طريقة هنا لتحليل في أقل من أسبوع واحد، وبذور الفول السوداني رني لحضور التحوير ولعدم تراكم الأفلاتوكسين سمة، وذلك باستخدام عدد قليل فقط البذور.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:256px;">Primers, oligonucleotides</td>
			<td style="width:127px;">DNA Technologies, Coralville, IA, USA</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Dneasy Plant Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">69106</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:256px;">Czapek Dox agar medium</td>
			<td style="width:127px;">Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">CM0095</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Agar</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">BP 1423</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Freezer -80&#176;C</td>
			<td style="width:127px;">n/a</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Aluminum Oxide, Al2O3</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A941</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">SPE Reservoirs 1.5 mL</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">210011</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Frits for 1.5 mL SPE reservoir</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">211401</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;">186005221</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="150">
			<td height="150" style="height:150px;width:256px;">Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:256px;">Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">A6636; A9887; A0138; A0263</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Systat Software 12.2</td>
			<td style="width:127px;">SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">15596-018</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11752-050</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:256px;">ABI 7500 Real-Time PCR</td>
			<td style="width:127px;">Lifetechnologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:123px;">4406984</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Luria Broth-Miller</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">R453642</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">pENTR1A</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">A10462</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11791-020</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB Biolabs</td>
			<td style="width:123px;">M0202L</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Gelrite</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">G1919</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">D134406</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:256px;">QIAcube robot workstation</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">9001292</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:256px;">Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Goldbio, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11304-029</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem

وتشير تقديرات منظمة الأغذية والزراعة التابعة للأمم المتحدة أن 25٪ من المحاصيل الغذائية في العالم ملوثة الأفلاتوكسين. الذي يمثل 100 مليون طن من المواد الغذائية التي يجري تدميرها أو تحويلها إلى الاستهلاك غير البشرية كل عام. الأفلاتوكسين المسرطنة قوية المتراكمة عادة من قبل الفطريات فلافس وA. الطفيلي في الحبوب والمكسرات والمحاصيل الجذرية وغيرها من المنتجات الزراعية. تم استخدام إسكات خمس جينات الأفلاتوكسين التوليف التي تدخل الحمض النووي الريبي (رني) في النباتات الفول السوداني للسيطرة على تراكم الأفلاتوكسين بعد التلقيح مع A. فلافس. في السابق، لم يكن هناك أي طريقة لتحليل فعالية رني في الفول السوداني الفردي الأحداث المعدلة وراثيا، وهذه عادة ما تنتج البذور قليلة، والأساليب التقليدية للتجارب ميدانية كبيرة في ظل ظروف مواتية الأفلاتوكسين وليس خيارا. في هذا المجال، واحتمال العثور على بذور ملوثة بشكل طبيعي في كثير من الأحيان 1/100 إلى 1/1،000. وبالإضافة إلى ذلك، لا يتم توزيع تلوث الافلاتوكسين بشكل موحد. يستخدم أسلوب لدينا عدد قليل من البذور المعدلة وراثيا في الحدث، مع قطع صغيرة معالجتها في الوقت الحقيقي PCR (RT-PCR) أو تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة، وتحليل تراكم الأفلاتوكسين بواسطة فائقة الأداء اللوني السائل (UPLC). خطوط الفول السوداني، معربا عن رني 288-72 و288-74، وأظهر ما يصل إلى الحد 100٪ (p≤0.01) في الأفلاتوكسين ب 1 و ب 2 مقارنة بالمجموعة الضابطة التي تراكمت حتى 14000 نانوغرام. ز -1 الأفلاتوكسين ب 1 عندما تلقيح مع aflatoxigenic A. فلافس. كمرجع، فإن مجموع الحد الأقصى المسموح به من السموم الفطرية للاستهلاك البشري في الولايات المتحدة هو 20 نانوغرام. ز -1. يصف هذا البروتوكول تطبيق مراقبة بوساطة رني من السموم الفطرية في بذور الفول السوداني المعدلة وراثيا وطرق تقييمها. ونحن نعتقد أن تطبيقه في تربية الفول السوداني وغيرها من المحاصيل سوف يجلب التقدم السريع في هذا المجال الهام من العلوموالطب والتغذية البشرية، وسوف تسهم إسهاما كبيرا في الجهود الدولية للسيطرة على السموم الفطرية، والسموم الفطرية المحتملة الأخرى في المحاصيل الغذائية الرئيسية.

وقدم البلازميد p5XCAPD كما مشتق من pCAPD 29، واستخدامه لتحويل نباتات الفول السوداني. هذا ناقلات يحمل يكرر مقلوب من خمسة أجزاء صغيرة، 70-80 سنة مضت كل من الجينات الأفلاتوكسين-توليف A. فلافس مفصولة إنترون (الشكل 1). واستخدمت أجزاء من AFL2G_07224 (aflR)، AFL2G_07223 (aflS أو aflJ)، AFL2G_05027 (الأفلاتوكسين مضخة هروب رأس المال، aflep)، AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1)، وAFL2G_07731 (pes1) للبناء، والأرقام على الشكل 1 تتوافق مع . فلافس الجينوم الشرح في معهد برود، كامبردج، MA، والأدب 42. تم توليده ما مجموعه 99 خطوط الفول السوداني بعد أن يمر في عملية التحول، 50 كانت PCR إيجابية لNPTII الكشف عنها بواسطة STN-PCR، وكانت 33 خطوط PCR بذور الإيجابية والمنتجة. سبعة خطوط إيجابية PCR فقط تم نشر متطابق بسلالة واختبارها من قبل حاضراطريقة ر لتراكم الأفلاتوكسين، وأظهر كل سبعة بين 60٪ و 100٪ تراكم الأفلاتوكسين أقل من السيطرة. نحن هنا تظهر نتائج اثنين من تلك الخطوط سبعة. كأحداث المعدلة وراثيا الفردية عادة ما تنتج البذور قليلة، تم تطوير طريقة لاستخدام الحد الأدنى لعدد البذور في حين لا تزال قادرة على القيام التحليل الإحصائي حدودي. ويرد مخطط لإعداد العينات والإعداد التجريبية في الشكل 5 والجدول 1. على الرغم من أن الجيل الأول من البذور المعدلة وراثيا هو عادة فرداني الزيجوت، فمن المتوقع أن الخلية الى خلية والحركة النظامية من الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا) التي تم إنشاؤها من خلال التدخل RNA يجب منح الأفلاتوكسين التوليف إسكات جميع أنحاء المصنع. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> الرقم 5. مخطط توضيحي لطريقة لتحليل فعالية رني في إسكات </sترونج&gt; الرشاشيات الجينات الأفلاتوكسين التوليف في بذور الفول السوداني. التمثيل البياني للتدفق العمل عند معالجة عينات الفول السوداني للتعبير الجين أو تحليل الأفلاتوكسين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> رني خطوط الفول السوداني 288-72 و288-74 أظهرت وجود صانع اختيار NPTII عند اختبارها من قبل STN-PCR، يتم عرض المقاطع جل في الشكل 6 (أعلى)، تتوفر من المؤلفين بناء على طلب الصور الأصلية. لم يستخدم البلازميد pCAPD كعنصر تحكم التحول لأنه يشفر يكرر مقلوب من اثنين من الجينات الكاميرون (مقاومة الكلورامفينيكول) وCcdB (توكسين) من تأثير غير معروف على النباتات. استخدمت PCR سلبي خط الفول السوداني 288-9 وغيرها التي مرت عملية تجديد وكانت تزرع في نفس الظروف كخطوط رني، كما يخدع سلبيالمحول المتعدد العادي. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> . الشكل 6. الكشف عن الجينات والوقت الحقيقي التعبير عن رني إدراج الأعلى: أحادية الأنبوب، كشف متداخلة PCR خطوط الفول السوداني المعدلة وراثيا رني 288-72 و288-74 رني والنباتات إيجابية. الضوابط: W (الماء)، PP (مصنع إيجابي)، MM (مزيج الرئيسي)، ص (البلازميد p5XCAPD)؛ الكسور 02/01 04/01 08/01 16/01 تمثل التخفيفات 2-أضعاف من الحمض النووي القاع: في الوقت الحقيقي PCR الكشف عن التعبير عن رني إدراج (مجموعات التمهيدي: RT_5X_1، RT_5X_2، كما في الشكل 1، على غير ناضجة ( الأصفر) وناضجة (البني) النبتات من خطوط المعدلة وراثيا في 24 و 48hr الحضانة؛ خط رمادي: تمثيل C T = 1. المدرج الإحصائي الوسائل وأشرطة الخطأ القياسية (T) من ثلاث عينات بيولوجيةمع ثلاثة مكررات التقنية. كان الكمي النسبي للرني إدراج تطبيع فيما يتعلق الجينات التدبير المنزلي أكتين بمثابة الرقابة الداخلية والمقارن التعبير حظيرة التحوير تحسب كما هو موضح في 5.2.2 و 5.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> لاختبار فعالية النبات المضيف رني بوساطة السيطرة المحتملة لتراكم الأفلاتوكسين، طبقت غبيرات المقطوع حديثا من فلافس NRRL 3357 على سطح قطع من النبتات نصف من الذي قد أزيلت الأجنة وتيستا (الأرقام 3، 4). ألف فلافس NRRL 3357، التي تم التسلسل الجينوم، وكان أساسا لتصميم p5XCAPD، يعود الفضل للدكتور القرن في USDA-ARS-NPRL. الغزو الفطرية الناتجة من نصف فلقة بعد 24 و 48 و 72 ساعة على 30 ° C هو المعرض<html> ن في الشكل (4). وقد تم جمع عينات من النبتات نصف الملقحة في 24، 48، 72، 96 ساعة من الحضانة، وتحليلها لأربعة الأفلاتوكسين الرئيسي للB 1، B 2، G 1 و G 2 باستخدام UPLC وأكد LC-MS ؛ يتم عرض النتائج في الشكل (6). تم تحديد تركيزات الأفلاتوكسين باستخدام أسلوب نشرت مع بعض التعديلات 36. في 96 ساعة الحضانة، النبتات تبدأ في التفكك بسبب عدوى فطرية. خط رني 288-72 أظهرت مستويات أقل بكثير من الأفلاتوكسين من السيطرة على جميع مواعيد أخذ العينات في الفلقات غير الناضجة وعلى معظم مواعيد أخذ العينات في الاقتصادات الناضجة. أظهر خط رني 288-74 مستويات أقل بكثير من الأفلاتوكسين في معظم مواعيد أخذ العينات. يشار إلى مستويات من أهمية اختبار توكي مع العلامات النجمية في الرسم في الشكل 7. <html> g7.jpg &quot;/&gt; . الرقم 7. الأفلاتوكسين ب 1 و ب 2 في النبتات الفول السوداني نصف بعد الحضانة (24، 48، 72 و 96 ساعة) مع فلافس التحكم: بذور 288-9 سطر غير المعدلة وراثيا. رني: البذور من رني 288-72 ورني 288-74، المعدلة وراثيا لرني p5XCAPD لإسكات خمس جينات الأفلاتوكسين التوليف. (A) الأفلاتوكسين ب 1 في البذور الناضجة (البني)؛ (B) الأفلاتوكسين ب 2 البذور الناضجة. (C) الأفلاتوكسين ب 1 في بذور غير ناضجة (الأصفر) و (D) الأفلاتوكسين ب 2 في البذور غير الناضجة. يتم تمثيل القيم المتوسطة مع ما يوازيها من أشرطة الخطأ القياسية (T) من العينات البيولوجية مكررة. فروق ذات دلالة إحصائية في اختبار توكي *: ص ≤ 0.05 **: P ≤ 0.01، ***: P ≤ 0.001.الصورة: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. أظهر رني 288-72 عموما في كافة مراحل التجربة (24-96 ساعة الحضانة)، و 94٪ انخفاضا -100٪ في الأفلاتوكسين ب 2، و 90٪ انخفاضا -100٪ في الأفلاتوكسين ب 1 مقارنة بالمجموعة الضابطة. أظهر رني 288-74 63٪ تخفيض -100٪ في الأفلاتوكسين ب 2 و 60٪ -100٪ تخفيض في الأفلاتوكسين ب 1، الشكل 7. وترد الاشعال تستخدم لفي الوقت الحقيقي الكشف PCR للتعبير عن إدراج رني في الشكل 1. وقد تم تحليل النبتات الفول السوداني البذور دون الأجنة، لإزالة دفاعاتهم الطبيعية، وتكون قادرة على الكشف عن التأثير المحتمل لرني على المنطقة الأكثر تعرضا لل غزو ​​الفطرية، النبتات. التعبير عن رني الكشف عن إدراج في الفلقات غير الناضجة (الأصفر) من خط 288-74 قبل التمهيدي تعيين RT_5X_1 كان أربعة أضعاف على مدى C T </sوكانت يو بي&gt; = 1 عتبة السيطرة السلبية، والتمهيدي تعيين RT_5X_2 19 أضعاف فوق عتبة، في كل 24 ساعة الحضانة. لا يقل عن ثلاثة من أصل خمسة أجزاء متتالية الجينات المستخدمة في التحول الفول السوداني، 5027، 7223 و 7228 (aflep، aflS / aflJ، وaflC / pksA، على التوالي) تم الكشف عنها بواسطة RT-PCR (الشكل 1، 6). لم يتم الكشف عن التعبير عن رني إدراج في النبتات ناضجة في 24 ساعة، أو على النبتات ناضجة أو غير ناضجة في 48 حضانة ساعة، الشكل 6 (القاع). <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> الفول السوداني الخط </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> وقت أخذ العينات </td><td colspan="3" style="width:192px;"> عينات لRT-PCR </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> عينات للتحليل الأفلاتوكسين (تلقيح) </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Nبني مصفر من البذور </td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> (غير الملقحة) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> مندوب 1 </td><td style="width:64px;"> مندوب 2 </td><td style="width:64px;"> مندوب 3 </td><td style="width:64px;"> مندوب 1 </td><td style="width:64px;"> مندوب 2 </td><td style="width:64px;"> مندوب 3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> رني (أصفر) </td><td style="width:64px;"> 24 ساعة </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48 ساعة </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdعلى غرار = &quot;العرض: 64px؛&quot;&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72 ساعة </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> التحكم </td><td style="width:64px;"> 24 ساعة </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> (أصفر) </td><td style="width:64px;"> 48 ساعة </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72 ساعة </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. مثال على الإعداد عينة صغيرة لتحليل التعبير الجيني وتراكم الأفلاتوكسين في بذور الفول السوداني رني. تحليل كامل التعبير والسموم الفطرية لمجموعة النضج واحد (أي.، الأصفر)، مع ثلاثة أوقات لأخذ العينات (24 و 48 و 72 ساعة) ، في ثلاث نسخ، يتطلب 4،5 البذور، كل رقم واحد في الجدول يمثل نصف فلقة.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem at JoVE.c

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

ونحن لشرح طريقة لتحليل السموم الفطرية والتعبير التحوير في بذور الفول السوداني التي تحتوي على إشارات RNA للتدخل لإسكات الجينات الأفلاتوكسين التوليف في الفطر فلافس. لم يتم الإبلاغ عن السيطرة بوساطة رني من السموم الفطرية في النباتات سابقا.

تحكم بوساطة رني من الأفلاتوكسين في الفول السوداني: طريقة لتحليل الإنتاج السموم الفطرية والتعبير التحوير في الفول السوداني /<em&gt; الرشاشيات</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Research

JoVE Journal

Environment

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

تحسين إعدادات غاز المداخن في تعزيز نمو الطحالب في Photobioreactors عبر المحاكاة الحاسوبية

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

عابر التعبير الجيني في التبغ باستخدام الجمعية جيبسون وجين غون

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

استخراج وتحليل الميكروبية الفوسفوليبيدية الأحماض الدهنية في التربة

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

والجدول Gusseted Thermogradient لتنظيم درجة الحرارة التربة لتقييم نمو النبات ومراقبة العمليات التربة

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

قياس الجسيمات العضوية في قاعة جامعة هارفارد البيئية والإنتاج

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

الإجراءات المختبرية التبخير للسيطرة على الآفات مع غاز أكسيد النيتريك

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

اختبار الإصابة بالنبات: الرش والجرح بوساطة التلقيح بمسببات الأمراض النباتية رمادية ماجنابورثي

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

تقييم قدرات إزالة الجسيمات من شجرة يترك

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Visualizing Efficacy of Pesticides Against Disease Vector Mosquitoes in the Field

تصور فعالية المبيدات ضد البعوض ناقل المرض في الحقل

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

تكوين وتحليل التوزيع من بيوايروسولس تحت ظروف بيئية مختلفة

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...