Name: rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem
Uploaded: 2015-12-21T14:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem at JoVE.c

This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

The authors have nothing to disclose or any conflicts of interest.

בתיווך RNAi צמח-מארח השתקה של גנים בפטריית פתוגנים הודגמה 27,43, לעומת זאת, אין פרסומים המציגים את ההיתכנות של שליטה בתיווך RNAi של הצטברות mycotoxin בצמחים. גורם מגביל אחת עבור מחקרים אלה בבוטנים היה חוסר שיטה להעריך פנוטיפ הצטברות לא-אפלטוקסין בצמחים בודדים, כעלים לא מראים סימפטומים על זיהום פטרייתי של תרמילי מחתרת. בנוסף, ההצטברות לא-מתפלגת נורמלי של aflatoxins, ואת הצורך בדגימות גדולות לניתוח כימי 15,16 מנעו כימות של השפעה פוטנציאלית על RNAi צמח בודד. השיטה המוצגת כאן מורכבת של 72 ניסויי שעות באמצעות חמישה זרעים לבצע שלוש דגימות 24 שעות מרווח בשלושה עותקים (טבלת 1, איור 7). בהשוואה לניתוח אפלטוקסין הטיפוסי שדורש לא פחות מ -100 גרם של זרעים, השיטה שלנו היא מתאימה במיוחד לindividuaאירועים מהונדסים l של צמחי בוטנים שתחילה לייצר לא יותר משניים או שלושה תרמילים. השתקה בתיווך RNA של סינתזת אפלטוקסין הודגמה על ידי הפיכה גנטית flavus אספרגילוס וא parasiticus. מאז aflR הוא רגולטור ראשי של ייצור אפלטוקסין בא flavus וא parasiticus 44,45, הוא הופך להיות יעד מעניין להשתקה בתיווך RNA בצמחים. עם זאת, וריאציות גנטיות בaflR הוכחו בין מיני אספרגילוס 46, וריאנטים גנטיים אלה יכולים לברוח השתקה אם אין רצף מושלם התאמה עם אות RNAi מיוצרת במפעל המארח. לפיכך, aflR היה אחד מהיעדים להשתקה בp5XCAPD וקטור, אבל לא היה יחיד. חוזר הפוך של גן aflR הציג לא flavus וא parasiticus ידי שינוי הביא להשתקה ומינימלית או ללא מוצרהיון של aflatoxins 47 (מקדונלד et al., 2005b). כמו כן, גן aflD השתקה מנע ייצור אפלטוקסין בשיעור של עד 98% בא flavus וא parasiticus בשינוי ישיר 48. כדי להגדיל את ההסתברות להצלחה במערכת שלנו, בוטנים הפכו עם שברים חוזרים הפוכים של חמישה גנים המעורבים בייצור אפלטוקסין בא flavus. כאן הוא הראה כי שימוש בp5XCAPD שמכוון להשתקת מספר גנים במסלול סינתזת אפלטוקסין, 90% -100% רמות נמוכות יותר של אפלטוקסין B 1 ו- B 2 הושגו בקו 288-72, ורמות 60-100% נמוכים שנצברו ב קו 288-74 בהשוואה לשליטה, כאשר מחצית פסיגים היו מחוסן עם א &#39; flavus, איורים 4 7,. והכי חשוב, שיטה זו זוהתה הבדלים מובהקים סטטיסטי בהצטברות אפלטוקסין בקווים 288-72, 288-74 לעומת השליטה לאורך כל הניסוי על ידי יישום statis פרמטריתטיקים, איור 7. בהתחשב בגודל המדגם הקטן, חשוב להדגיש את הצורך בשימוש בשיטה רבת עוצמה לזיהוי aflatoxins, ניסויים אלה נותחו על ידי UPLC שבעל רזולוציה גבוהה, פי חמישה ביצועים גבוהים יותר ורגישות גבוהה פי שלושה מ HPLC 49. ביטוי של RNAi להוסיף ב288-74 התגלה רק בפסיגים בוגרים (צהובים) בשעה 24 דגירה. הכנס RNAi לא זוהה על ידי RT-PCR על פסיגים בוגרים של 288-74 ב 24 שעות, או על כל קבוצה בגרות ב 48 שעות, איור 6. אותו תופעה זו נצפתה בקווי בוטנים אחרים RNAi מהונדסים (אריאס, RS 2015 לא פורסם), שבו בדרך כלל תמלילי RNAi התגלו רק בפסיגים בוגרים ב 24 שעות. טופלו דגימות RNA עם DNAse לפני סינתזת cDNA, הנתונים היו מנורמלים לרמה של ביטוי אקטין ואין עדות לזיהום הדנ&quot;א נצפה. צריך DNA היה נוכח בדגימות, שהוא צריךזוהה בדגימות שעה 48 גם כן, אבל באופן עקבי כי לא היה המקרה. ביטוי תחת השליטה של ​​35S-האמרגן הוא לא תמיד אחיד; יכול להיות מושפע על ידי תנאים סביבתיים זה 50, סוג של רקמה ושלב ההתפתחותי 51,52. במקביל, במסלול של התערבות RNA, השיעור של mRNA ריקבון וקצב דעיכת siRNA יכולים להשתנות באופן משמעותי 53. ייתכן שהשפלה המהירה של mRNA על ידי המנגנון של התערבות RNA יכולה הייתה למנוע זיהוי mRNA ב 48 שעות דגירה. אם היעדרות של ביטוי בשעה 48 הייתה עקב שעתוק הנמוך 35S-אמרגן מונע, או להשפלה מהירה של dsRNA ידי דייסר נותר ענה. כך, זיהוי של RNA קטן על ידי רצף תפוקה גבוה היה נותן תובנה טובה יותר על התהליכים המתרחשים באמצעות RNAi 54 בניסויים אלה. עם זאת, מאז השתקת RNA מתפשטת מערכתית, בעיקר דרך השיפה מphotosyntשונא את המקורות לסוכרוז כיורים (במקרה זרעי בוטנים זה) 55, ההשתקה של אפלטוקסין-סינתזה יכולה להתרחש בזרעים ללא ביטוי מקומי של RNAi להוסיף. מחקרים רבים נותר לעשות כדי לקבוע את רמת הסף של RNA הקטן מפריע (siRNAs) הנחוץ כדי למנוע הצטברות אפלטוקסין בזרעים. חשוב להדגיש את העובדה ששניהם ביטוי mRNA, של RNAi לבנות (איור 6), והצטברות של aflatoxins B 1 ו- B 2 (איור 7) הראתה תוצאות שונות עבור בוגר (צהוב) לעומת. בוגרת פסיגים (חום). יש צמחי בוטנים צמיחה בלתי מוגדרת, כלומר, הם מציגים בקציר מגוון של תרמילים בגרות, איור 2. בנוסף, זרעים מקבוצות בגרות שונות נבדלים בהרכב הכימי שלהם, למשל., סוכרוז 2.4% בזרעים לא בשלה, ושל 1.9% ב זרעים בוגרים באותם 56,57 תנאי שדה. לכן, כדי להבין את efficienc בפועלy שליטה בתיווך RNA של הצטברות אפלטוקסין, חשוב לנתח קבוצות בגרות בנפרד. הגנה טבעית של זרעי בוטנים היא הייצור של phytoalexins, אשר משתנה במגוון של תרכובות המיוצרות והכמויות היחסית שלהם בהתאם לפדיון של הזרעים ותנאים סביבתיים 58-61, והוא גבוה במיוחד בהשוואה לעוברי פסיגים 62. עוברים יש גם ריכוזים גבוהים יותר באופן משמעותי של חומצות גרעין, שני DNA ו- RNA מהפסיגים (RS אריאס, לא פורסמו). כזרעי בוטנים בוגרים, שינויים בפיסיולוגיה שלהם והרכב כימי להתרחש 63. נוגדי חמצון פנול בטאנינים מרוכזים צורת testa בוטנים עם פעילות fungistatic 64; זה ניכר גם בצבע mesocarp המשקף שלבים בגרות, צהובים לשחור 35, כתוכנו של טאנינים ותרכובות פנוליות עולה עם בגרות 65. לפיכך, נוכחותם של לאesta או עוברים בניסוי, נתנו מאפייני מיקרוביאלית שלהם, יכול היה מוגבלים פטרייתי צמיחה ולכן בהערכת ההשפעה של השתקת RNAi, לכן, הם הוסרו. כמו כן, הסרת טסטה והעוברים מסייעת להגביל את המקורות שונים בניתוח, כמחצית טבורית שנושאת את העובר יהיה יותר ויותר תוכן phytoalexins RNA. בנוסף לניתוח על ידי קבוצות בגרות וההסרה של טסטה ועובר בניסויים אלה, חשוב להצביע על עוד כמה תצפיות: א) אם כי תוצאות מוצגות לעד 96 שעות דגירה, מומלץ שלא להשתמש יותר מ 72 שעות כדי להשיג תוצאות עקביות, כמו זרעים לקבל מושפלות על ידי 96 שעות; ב) ואילו מחצית פסיגים מאותו הזרע, אם כי דגמו באופן אקראי, אינם מהווים מדגמים בלתי תלויים לחלוטין, RT-PCR והצטברות אפלטוקסין באירועים מהונדסים הראו וריאציה מינימאלית בין זרעים. גם נבגי פטרייתי מדויקים, לספור, הבידוד נפחים של 2 μl, ויישום של נבגים על פני השטח החתך של הפסיגים הימנעות מטפטף על הצדדים חשובים לוודא הנבגים המונבטים נחשפים לרקמות הצמח. המים / אגר על הצלחות צריכים להיות בשיעור של 1.5% (w / v), אגר רך גורם נגר של נבגים כפי שמוצג במסגרת האחרונה של איור 4 (תחתון). צריך זרע זמינות מאירוע מהונדס מסוים להיות מוגבל, דגימה יכולה להיעשות בשני עותקים במקום תוצאות דומות בשלושה עותקים קבלת (כלומר, איור 7); עם זאת, בשלושה עותקים דגימות יסייעו להפחית את השגיאה סטנדרטית. המגבלה היחידה של שיטה זו היא שהיא דורשת מערכת רגישה מאוד (UPLC) לגילוי אפלטוקסין / כימות, אבל באותו הזמן זה מקטין את ההסתברות של הערכת יתר של השפעת RNAi צריך aflatoxins לא להיות מזוהה על ידי שיטות פחות רגישות. לסיכום, שיטה זו מציעה בפעם הראשונה בגישה אמינה ללמודהשפעה של RNAi בשליטה של ​​aflatoxins. צמצום הזמן לניסוי מעונת גידול כולו לפחות משבוע, בשיטה זו תהיה מאוד להאיץ את המחקר על RNAi-בוטנים / pathosystem Aspergillus להפחתה ו / או החיסול של aflatoxins.

כ -4.5 מליארד בני אדם חשופים באופן קבוע aflatoxins 1, החומרים המסרטנים החזקים ביותר הידועים בטבע 2. mycotoxins אלה לזהם 25% מיבולי המזון בעולם 3, כולל תירס, קסבה, אורז, אגוזים, דגנים ותבלינים. 4. Aflatoxins סיבת להטוטים בילדים 5, לפגוע במערכת החיסונית 6, נמצא ב58% מhepatocellular-קרצינומה בביופסיות אנושיות 7,8, ולהרוג מאות אנשים במהלך התפרצויות תקופתיות של aflatoxicosis 9,10. Aflatoxins הוא mycotoxins נגזר polyketide בדרך כלל מיוצרת על ידי flavus אספרגילוס וא parasiticus; aflatoxins B 1 ו- B 2 מיוצרים על ידי א &#39; flavus, ואילו א parasiticus גם מייצר G 1 וG 2. המבנה הכימי של תרכובות אלה וchromatogram מראה ההפרדה שלהם על ידי UPLC מוצג באיור 1. </strאונג&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> איור 1. aflatoxins וRNAi להכניס לראש:. מבנה כימי (משמאל) ודוגמא של chromatogram (מימין) של ארבעה aflatoxins נגזר polyketide הנפוץ ביותר: B 1, B 2, G 1 וG 2, המיוצר על ידי parasiticus אספרגילוס, . Flavus מייצר B 1 ו- B 2 תחתון: סכמטי של שברי גן בRNAi לבנות p5XCAPD משמש לשינוי בוטנים, מספרים תחת חצים מספרי הצטרפות גן-בר בגנום flavus אספרגילוס;. PIV2: אינטרון תפוחי אדמה; זוגות בסיסים;: BP RT_5X_1 וRT_5X_2:. אתרי פריימר PCR בזמן אמת <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> הפסדים כלכליים ביצוא בשל aflatoxins בבוטנים לבד יעלו 450,000,000 $ דולר ארה&quot;ב אם מחושב על בסיס 4 ng. ז -1 מגבלה של אפלטוקסין מותר למאכל אדם באיחוד האירופי 11. Aflatoxins כבר ידוע במשך 60 שנים 12; עם זאת, למרות שרבים שיטות חקלאיות שפותחו כדי להקל את השפעתן, כולל יישום של זני פטריות אחרים 13,14, אין שיטה של שליטה עקבית קיימת, וזני צמחים עמידים אינם זמינים. germplasm מפעל בדיקות להתנגדות לaflatoxins הוא קשה במיוחד, משום שגם בתנאים תורמים לפלישת פתוגן, הצטברות mycotoxin היא בלתי צפויה ולא פעלה התפלגות נורמלית. כך, ניסויים דורשים בדרך כלל אזורי נטיעה גדולים, מאות זרעים ודוגמאות רבות של 100-1,700 גרם להפחתת שונות של 15,16 נתונים. התערבות RNA הייתהגילה בשנת 1998 17; ואת היתרונות של &quot;השתקה&quot; כרגע נבדקות במספר היישומים החדשים, לדוגמא., בטיפולים אנושיים נגד סרטן השד גרורתי 18, סרטן כבד 19, לוקמיה מיאלואידית 20, ובהגנת צומח נגד חרקים 21 ונמטודות 22. בצמחים, אותות התערבות RNA יכולים לנסוע תא לתא, עם RNA הקטן מפריע (siRNA) ו- RNA משקל המולקולרי הגבוה להיות אחראי לגן posttranscriptional המערכתי השתקת 23,24, אפילו בתוך פתוגנים פטרייתי שנמצאים בקשר הדוק עם מארח צמח 25. היעילות של RNAi בהשתקה בתיווך מפעל של גנים פטרייתי לפתוגן תוארה בכמה pathosystems צמח, לאלה, בדיקה חזותית של תסמינים בחלקי האוויר של צמחים (עלים) אפשרה כימות מחלה, כלומר, Bremia oomycete בחסה 26 , Puccinia בחיטה <sup&gt; 27 וFusarium בבננה 28. הרבה יותר קשה הוא להעריך את יעילות RNAi לשלוט mycotoxins בצמחים, במיוחד בaflatoxins בוטנים כעלים לא מראים סימפטומים של זיהום, האיברים פלשו (זרעים) נמצאים תחת כמה אינץ &#39;של אדמה, את המופע של זיהום הוא בלתי צפוי, ורק כימי ניתוח יכול לקבוע את הנוכחות של aflatoxins. בנוסף, כל אירוע מהונדס בבוטנים בדרך כלל מייצר כמה זרעים (4-6 לכל צמח); לכן, בדיקה מסורתית לתכונה לא-אפלטוקסין הצטברות בחלקות שדה גדולים, שנמשך עונות חיתוך כל, ובאמצעות מאות זרעים היא לא ריאלי. שיטה מתוארת כאן כדי לנתח בפחות משבוע, זרעי RNAi בוטנים לנוכחות של transgene ועבור תכונת הצטברות לא-אפלטוקסין, באמצעות כמה רק זרעים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:256px;">Primers, oligonucleotides</td>
			<td style="width:127px;">DNA Technologies, Coralville, IA, USA</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Dneasy Plant Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">69106</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:256px;">Czapek Dox agar medium</td>
			<td style="width:127px;">Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">CM0095</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Agar</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">BP 1423</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Freezer -80&#176;C</td>
			<td style="width:127px;">n/a</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Aluminum Oxide, Al2O3</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A941</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">SPE Reservoirs 1.5 mL</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">210011</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Frits for 1.5 mL SPE reservoir</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">211401</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;">186005221</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="150">
			<td height="150" style="height:150px;width:256px;">Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:256px;">Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">A6636; A9887; A0138; A0263</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Systat Software 12.2</td>
			<td style="width:127px;">SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">15596-018</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11752-050</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:256px;">ABI 7500 Real-Time PCR</td>
			<td style="width:127px;">Lifetechnologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:123px;">4406984</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Luria Broth-Miller</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">R453642</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">pENTR1A</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">A10462</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11791-020</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB Biolabs</td>
			<td style="width:123px;">M0202L</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Gelrite</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">G1919</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">D134406</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:256px;">QIAcube robot workstation</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">9001292</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:256px;">Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Goldbio, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11304-029</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem

ארגון המזון והחקלאות של האו&quot;ם מעריך כי 25% מיבולי המזון בעולם מזוהמים בaflatoxins. המייצג את מזון 100 מ&#39;טונות נהרסות או מופנות לצריכה שאינה בני אדם בכל שנה. Aflatoxins הם חומרים מסרטנים חזקים בדרך כלל שנצברו על ידי flavus פטריות אספרגילוס וparasiticus א בדגנים, אגוזים, גידולי שורש ומוצרים חקלאיים אחרים. השתקה של חמישה גני אפלטוקסין-סינתזה על ידי התערבות RNA (RNAi) בצמחי בוטנים הייתה משמשת לשליטה הצטברות אפלטוקסין הבאה חיסון עם א &#39; flavus. בעבר, לא הייתה קיימת שיטה לנתח את האפקטיביות של RNAi באירועים מהונדסים בוטנים בודדים, כמו אלה בדרך כלל לייצר כמה זרעים, ושיטות מסורתיות של ניסויי שדה גדולים בתנאי אפלטוקסין-תורם לא אופציה. בתחום, את ההסתברות למציאת זרעים מזוהמים באופן טבעי היא לעתים קרובות 1/100 ל1/1,000. בנוסף, זיהום אפלטוקסין לא מפוזר באופן אחיד. השיטה שלנו משתמשת בכמה זרעים מהונדס לאירוע, עם חתיכות קטנות מעובד בזמן אמת PCR (RT-PCR) או רצף RNA קטן, וניתוח של הצטברות אפלטוקסין ידי כרומטוגרפיה אולטרה ביצועים נוזלית (UPLC). קווי להביע RNAi בוטנים 288-72 ו288-74, הראו הפחתה של עד 100% (p≤0.01) באפלטוקסין B 1 ו- B 2 בהשוואה לשליטה שנצברה עד 14,000 ng. ז -1 של אפלטוקסין B 1 כאשר מחוסן עם א aflatoxigenic flavus. כהתייחסות, סך המרבי של aflatoxins המותר לצריכת אדם בארצות הברית הוא 20 ng g -1.. פרוטוקול זה מתאר את היישום של שליטה בתיווך RNAi של aflatoxins בזרעים מהונדסים בוטנים ושיטות להערכתה. אנו מאמינים כי יישומה בגידול של בוטנים וגידולים אחרים יביא התקדמות מהירה בתחום חשוב זה של מדע, רפואה ותזונת אדם, ויתרמו באופן משמעותי למאמץ הבינלאומי כדי לשלוט aflatoxins, וmycotoxins פוטנציאלית אחרת ביבולי מזון עיקריים.

פלסמיד p5XCAPD נעשה כנגזרת של pCAPD 29, והשתמש בו כדי להפוך את צמחי בוטנים; וקטור זה נושא חוזר הפוכה של חמישה שברים קטנים, 70-80 נ&quot;ב כל, של גני אפלטוקסין-סינתזה של א &#39; flavus מופרד על ידי אינטרון (איור 1). ברי AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07223 (aflS או aflJ), AFL2G_05027 (משאבת זרימת אפלטוקסין, aflep), AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1), וAFL2G_07731 (pes1) שמשו למבנה, מספרים בלהתכתב איור 1 ל . ביאור הגנום flavus לאור מכון, Cambridge, MA, וספרות 42. סך של 99 קווי בוטנים היו מחדש לאחר שעובר את תהליך השינוי, 50 היו PCR חיובי לNPTII זוהה על ידי STN-PCR, ו -33 קווים היו זרעים חיוביים ומיוצרים PCR. רק שבעה קווים חיוביים PCR היו מופצים clonally ונבדקו על ידי presenשיטה לא להצטברות אפלטוקסין, כל שבע הראתה בין 60% ל- 100% פחות הצטברות אפלטוקסין מהשליטה. כאן אנו מראים תוצאות של שניים משבעת קווים אלה. אירועים מהונדסים בודדים בדרך כלל לייצר כמה זרעים, שיטה פותחה לשימוש במספר מינימאלי של זרעים ועדיין להיות מסוגל לעשות את הניתוח סטטיסטי פרמטרית. תרשים זרימה של הכנת המדגם והגדרת ניסוי מוצגת באיור 5 ולוח 1. למרות שהדור הראשון של זרעים מהונדסים הוא בדרך כלל hemizygous, צפוי כי (siRNA) נוצר תא אל תא ותנועה מערכתית של RNA התערבות הקטן באמצעות התערבות RNA צריך להעניק השתקת אפלטוקסין-סינתזה ברחבי המפעל. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> איור 5. תרשים זרימה סכמטי של השיטה לנתח את האפקטיביות של RNAi בהשתקה </sטרונג&gt; גני אפלטוקסין-סינתזת אספרגילוס בזרעי בוטנים. ייצוג גרפי של זרימת העבודה בעת עיבוד דגימות בוטנים לביטוי גנים או ניתוח אפלטוקסין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> קווי RNAi בוטנים 288-72 ו288-74 הראו נוכחות של יצרנית בחירת NPTII כאשר נבדקו על ידי STN-PCR, סעיפי ג &#39;מוצגים באיור 6 (למעלה), תמונות מקוריות זמינות מהמחברים על פי דרישה. פלסמיד pCAPD לא היה בשימוש כשליטה של שינוי שכן הוא מקודד חוזר הפוך של שני גנים CMR (התנגדות chloramphenicol) וCcdB (רעלן) של השפעה ידועה על צמחים. PCR קו שלילי בוטנים 288-9 ואחרים שעברו את תהליך ההתחדשות וגדל באותם תנאים כמו קווי RNAi, שימש כקון השליליTrol. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> . איור 6. איתור של transgenics וביטוי בזמן אמת של RNAi להוסיף למעלה: Single-צינור, זיהוי מקונן PCR של קווים מהונדסים בוטנים RNAi-288-72 וRNAi-288-74, צמחים חיוביים. בקרה: W (מים), PP (צמח חיובי), MM (תערובת אמן), עמ &#39;(פלסמיד p5XCAPD); שברים 1/2 1/4 1/8 1/16 מייצגים דילולים פי 2 של ה- DNA תחתון:. Real-Time PCR לגילוי ביטוי של RNAi להכניס (סטי פריימר: RT_5X_1, RT_5X_2, כמו באיור 1, על בוגר ( קו אפור; צהוב) ובוגר (פסיגים חום) של קווים מהונדסים ב 24 ודגירת 48hr: C T היסטוגרמות = 1. מייצגות את האמצעים וברים שגיאה סטנדרטיים (T) של שלוש דגימות ביולוגיותעם שלושה משכפל טכני. הכימות היחסי של הוספת RNAi היה מנורמל ביחס לגן המשק אקטין כבקרה פנימית וביטוי של פי השוואתי של transgene מחושב כפי שמתואר ב5.2.2 ו -5.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כדי לבחון את האפקטיביות של בקרה פוטנציאלית בתיווך RNAi צמח-מארח של הצטברות אפלטוקסין, נבגים טריים שנקטפו של אספרגילוס flavus NRRL 3357 יושמו על פני השטח החתך של מחצית פסיגים ממנו את העוברים וtesta הוסרו (איורים 3, 4). NRRL א flavus 3357, שהגנום כבר רצף והיה הבסיס לעיצוב p5XCAPD, נמסר באדיבות על ידי ד&quot;ר הורן בUSDA-ARS-NPRL. פלישת כתוצאה פטרייתי של מחצית טבורית לאחר 24, 48 ו -72 שעות על 30 מעלות צלזיוס היא מופע<html> n באיור 4. דוגמאות של מחצית פסיגים מחוסנים נאספו ב 24, 48, 72, 96 שעות של דגירה, ונותחו במשך ארבעה aflatoxins B העיקרי 1, B 2, G 1 וG 2 באמצעות UPLC ואושרו על ידי LC-MS ; תוצאות מוצגות באיור 6. ריכוזי אפלטוקסין נקבעו באמצעות שיטה שפורסמה עם שינויים 36. בשעה 96 דגירה, פסיגים מתחילים להתפורר בשל הזיהום פטרייתי. קו RNAi 288-72 הציג רמות נמוכות יותר באופן משמעותי של aflatoxins מאשר השליטה בכל תאריכי הדגימה בפסיגים לא בוגרים ולכל היותר תאריכי דגימה בבוגרים אלה. קו RNAi 288-74 הראה רמות נמוכות יותר באופן משמעותי של aflatoxins ברוב תאריכי דגימה. רמות של משמעות של הבדיקה של Tukey מסומנות בכוכבית בגרפיקה של איור 7. <html> g7.jpg &quot;/&gt; . איור 7. aflatoxins B 1 ו- B 2 בפסיגי בוטנים חצי לאחר דגירה (24, 48, 72 ו -96 שעות) עם flavus אספרגילוס בקרה: זרעים של 288-9 קו שאינו מהונדס; RNAi: זרעים מRNAi-288-72 וRNAi-288-74, מהונדס לRNAi p5XCAPD להשתיק חמישה גני אפלטוקסין-סינתזה. אפלטוקסין B 1 בזרעים בשלים (חום) (א); אפלטוקסין B 2 זרעים בשלים (ב); אפלטוקסין (ג) ב 1 בזרעים בשלים (צהוב) ואפלטוקסין (ד &#39;) ב&#39; 2 בזרעים לא בשלה. ערכים ממוצעים עם הברים המקבילים סטנדרטי שגיאה (T) של דגימות ביולוגיות כפולות מיוצגים. הבדלים מובהקים סטטיסטי הבדיקה * של Tukey: p ≤ 0.05, **: p ≤ 0.01, ***: p ≤ 0.001.S: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. בסך הכל, RNAi-288-72 הראה לאורך כל הניסוי (24-96 שעות דגירה), 94% הפחתה -100% באפלטוקסין B 2, והפחתה של 90% -100% באפלטוקסין B 1 בהשוואה לשליטה. RNAi-288-74 הראה 63% -100% הפחתה באפלטוקסין B 2 ו -60% -100% הפחתה באפלטוקסין B 1, איור 7. פריימרים המשמשים לזיהוי PCR בזמן אמת של ביטוי של להכניס את RNAi מוצגים באיור 1. פסיגים בוטנים-זרע נותחו ללא עוברים, כדי להסיר את ההגנות טבעיות שלהם ולהיות מסוגל לזהות את ההשפעה הפוטנציאלית של RNAi באזור החשוף ביותר ל פטריית פלישה, הפסיגים. ביטוי של RNAi מזוהה להוסיף בפסיגים בוגרים (צהוב) של קו 288-74 על ידי פריימר להגדיר RT_5X_1 היה פי ארבעה על T C </sUB&gt; = 1 סף של הביקורת השלילית, ועל ידי פריימר להגדיר RT_5X_2 היה 19 לקפל מעל הסף, בבת 24 שעות דגירה. לפחות שלוש מתוך חמישה שברי גן ברציפות בשימוש בשינוי הבוטנים, 5027, 7223 ו7228 (aflep, aflS / aflJ, וaflC / pksA, בהתאמה) אותרו על ידי RT-PCR (איור 1, 6). ביטוי של הכנס RNAi לא זוהה בפסיגים בוגרים ב 24 שעות, או בפסיגים בוגרים או לא בוגרים ב 48 שעות דגירה, איור 6 (למטה). <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> בוטנים קו </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> זמן של דגימה </td><td colspan="3" style="width:192px;"> דוגמאות לRT-PCR </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> דוגמאות לניתוח אפלטוקסין (מחוסן) </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Nחום-אדמדם של זרעים </td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> (לא מחוסן) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> נציג 1 </td><td style="width:64px;"> נציג 2 </td><td style="width:64px;"> נציג 3 </td><td style="width:64px;"> נציג 1 </td><td style="width:64px;"> נציג 2 </td><td style="width:64px;"> נציג 3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> RNAi (צהוב) </td><td style="width:64px;"> 24 שעות </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48 שעות </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdסגנון &quot;רוחב: 64px;&quot; =&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72 שעות </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> לִשְׁלוֹט </td><td style="width:64px;"> 24 שעות </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> (צָהוֹב) </td><td style="width:64px;"> 48 שעות </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72 שעות </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. דוגמא להתקנה קטן מדגם לנתח ביטוי גנים והצטברות אפלטוקסין בזרעי בוטנים RNAi. ניתוח מלא של ביטוי וaflatoxins לקבוצה בגרות אחת (כלומר., צהובה), עם שלוש פעמים דגימה (24, 48 ו -72 שעות) , בשלושה עותקים, ידרוש 4.5 זרעים, כל מספר אחד בטבלה מייצג מחצית טבורית.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem at JoVE.c

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

אנו מדגימים שיטה לניתוח aflatoxins וביטוי transgene בזרעי בוטנים המכילים אותות RNA-התערבות להשתקת גני אפלטוקסין-סינתזה בflavus אספרגילוס הפטרייה. השליטה בתיווך RNAi של mycotoxins בצמחים לא דווחה בעבר.

בקרה בתיווך RNAi של aflatoxins בבוטנים: שיטה לניתוח ייצור mycotoxin וביטוי transgene בבוטנים /<em&gt; אספרגילוס</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Research

JoVE Journal

Environment

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

לייעל ארובות הגדרות גז לקידום Microalgae צמיחה בphotobioreactors באמצעות הדמיות מחשב

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

לוח א gusseted Thermogradient לשלוט טמפרטורות קרקע להערכת גדילת צמחי ניטור תהליכי אדמה

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

ייצור, מדידה של חלקיקים אורגניים בבית הבליעה סביבתיים הרווארד

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

תהליכי מעבדה ההדברה להדברה בגז תחמוצת החנקן

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

הבדיקה זיהום צמח: ריסוס, בתיווך הפצע חיסון עם הפתוגן של צמח Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

הערכת היכולות הסרת חלקיקים של העץ עלים

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Visualizing Efficacy of Pesticides Against Disease Vector Mosquitoes in the Field

להמחיש את היעילות של חומרי הדברה נגד יתושים וקטור מחלת בשטח

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

הלחנה וניתוח הפצה Bioaerosols בתנאים סביבתיים שונים

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...