Name: rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem
Uploaded: 2015-12-21T14:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem at JoVE.c

This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

The authors have nothing to disclose or any conflicts of interest.

लगभग 4.5 अरब लोगों को लंबे समय से aflatoxins 1, प्रकृति 2 में जाना जाता है सबसे शक्तिशाली carcinogens को उजागर कर रहे हैं। ये mycotoxins मक्का, कसावा, चावल, नट, अनाज और मसाले सहित दुनिया 3, में खाद्य फसलों का 25% दूषित। 4। बच्चों को 5 में stunting कारण aflatoxins, प्रतिरक्षा प्रणाली को 6 ख़राब मानव बायोप्सी 7.8 में हेपैटोसेलुलर-कार्सिनोमा के 58% में मौजूद हैं, और aflatoxicosis 9,10 की आवधिक प्रकोप के दौरान सैकड़ों लोगों को मार डालते हैं। Aflatoxins सामान्य रूप से Aspergillus flavus और ए द्वारा उत्पादित polyketide व्युत्पन्न mycotoxins हैं parasiticus; aflatoxins बी 1 और बी 2 ए द्वारा उत्पादित कर रहे हैं flavus, ए, जबकि parasiticus भी जी 1 और जी 2 पैदा करता है। इन यौगिकों और UPLC से उनकी जुदाई दिखा एक वर्णलेख की रासायनिक संरचना चित्रा 1 में दिखाया जाता है। </strओंग&gt; <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> चित्रा 1. Aflatoxins और आरएनएआई डालने के शीर्ष पर:। चार सबसे आम polyketide व्युत्पन्न aflatoxins की रासायनिक संरचना (बाएं) और (दाएं) वर्णलेख का उदाहरण: बी 1, बी 2, जी 1 और जी 2, एसपरजिलस parasiticus, ए द्वारा उत्पादित ।। flavus बी 1 और बी 2 नीचे का उत्पादन: आरएनएआई में जीन टुकड़े के योजनाबद्ध तीरों के तहत संख्या Aspergillus flavus जीनोम में जीन-टुकड़ा परिग्रहण संख्या रहे हैं, p5XCAPD मूंगफली परिवर्तन के लिए प्रयोग किया जाता है का निर्माण; PIV2: आलू Intron; बीपी: आधार जोड़े; RT_5X_1 और RT_5X_2:। वास्तविक समय पीसीआर प्राइमर साइटों <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> गणना 4 पर आधारित है, तो कारण मूंगफली में aflatoxins को निर्यात में आर्थिक नुकसान अकेले $ 450,000,000 अमरीकी डॉलर से अधिक एनजी। जी -1 यूरोपीय संघ के 11 में मानव उपभोग के लिए अनुमति एफ्लाटॉक्सिन की सीमा। Aflatoxins 60 वर्ष 12 के लिए जाना जाता रहा है; कई कृषि पद्धतियों अन्य कवक उपभेदों 13,14 के आवेदन सहित उनके प्रभाव को कम करने के लिए विकसित किए गए हालांकि, हालांकि, नियंत्रण की कोई सुसंगत विधि मौजूद है, और प्रतिरोधी संयंत्र किस्मों उपलब्ध नहीं हैं। यहां तक ​​कि रोगज़नक़ आक्रमण के लिए अनुकूल परिस्थितियों में, mycotoxin संचय अप्रत्याशित है और एक सामान्य वितरण का पालन नहीं करता, क्योंकि aflatoxins के प्रतिरोध के लिए परीक्षण संयंत्र जर्मप्लाज्म, विशेष रूप से कठिन है। इस प्रकार, प्रयोगों आमतौर पर बीज और 100-1,700 जी के कई नमूने के सैकड़ों डेटा 15,16 की परिवर्तनशीलता को कम करने, बड़े रोपण क्षेत्रों की आवश्यकता होती है। शाही सेना के हस्तक्षेप था1998 17 में पता चला; और &quot;मुंह बंद&quot; का लाभ वर्तमान में नए आवेदनों की संख्या, उदा में पता लगाया जा रहा है।, मेटास्टैटिक स्तन कैंसर के 18, यकृत कैंसर के 19, माइलॉयड ल्यूकेमिया 20, और कीड़ों 21 और नेमाटोड 22 लोगों के खिलाफ पौध संरक्षण खिलाफ मानव चिकित्सा में। पौधों में, आरएनए हस्तक्षेप का संकेत भी संयंत्र मेजबान 25 के साथ निकट संपर्क में हैं कि कवक रोगजनकों के अंदर, 23,24 मुंह बंद प्रणालीगत posttranscriptional जीन के लिए जिम्मेदार होने के छोटे दखल शाही सेना (siRNA) और उच्च आणविक भार शाही सेना के साथ, सेल करने के लिए सेल यात्रा कर सकते हैं। फंगल रोगज़नक़ जीनों के संयंत्र की मध्यस्थता मुंह बंद करने पर आरएनएआई की प्रभावशीलता इन के लिए, कुछ संयंत्र pathosystems में वर्णित किया गया है, पौधों (पत्ते) के हवाई भागों में लक्षणों के दृश्य परीक्षा सलाद 26 में रोग मात्रा का ठहराव, यानी, oomycete Bremia अनुमति गेहूं में Puccinia <suकेला 28 में p&gt; 27 और फ्यूजेरियम। उससे भी ज्यादा मुश्किल पत्ते, (बीज) पर हमला किया अंगों मिट्टी के कई इंच के तहत कर रहे संक्रमण का कोई लक्षण दिखाने के रूप में मूंगफली में पौधों में mycotoxins, विशेष रूप से aflatoxins नियंत्रित करने के लिए आरएनएआई प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए है, संक्रमण की घटना अप्रत्याशित है, और केवल रासायनिक है विश्लेषण aflatoxins की उपस्थिति निर्धारित कर सकते हैं। इसके अलावा, मूंगफली में प्रत्येक ट्रांसजेनिक घटना सामान्य रूप से कुछ बीज (संयंत्र प्रति 4-6) पैदा करता है; इसलिए, बड़े क्षेत्र भूखंडों में एक नहीं, एफ्लाटॉक्सिन संचय विशेषता, पूरी फसल सीज़न चलने, और बीज के सैकड़ों प्रयोग करने के लिए परंपरागत परीक्षण संभव नहीं है। एक विधि कम से कम एक सप्ताह में विश्लेषण करने के लिए यहाँ वर्णन किया गया है, केवल कुछ बीज का उपयोग कर transgene की उपस्थिति के लिए और एक नहीं एफ्लाटॉक्सिन संचय विशेषता के लिए आरएनएआई मूंगफली बीज,।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:256px;">Primers, oligonucleotides</td>
			<td style="width:127px;">DNA Technologies, Coralville, IA, USA</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Dneasy Plant Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">69106</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:256px;">Czapek Dox agar medium</td>
			<td style="width:127px;">Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">CM0095</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Agar</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">BP 1423</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Freezer -80&#176;C</td>
			<td style="width:127px;">n/a</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Aluminum Oxide, Al2O3</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A941</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">SPE Reservoirs 1.5 mL</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">210011</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Frits for 1.5 mL SPE reservoir</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">211401</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;">186005221</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="150">
			<td height="150" style="height:150px;width:256px;">Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:256px;">Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">A6636; A9887; A0138; A0263</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Systat Software 12.2</td>
			<td style="width:127px;">SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">15596-018</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11752-050</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:256px;">ABI 7500 Real-Time PCR</td>
			<td style="width:127px;">Lifetechnologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:123px;">4406984</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Luria Broth-Miller</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">R453642</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">pENTR1A</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">A10462</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11791-020</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB Biolabs</td>
			<td style="width:123px;">M0202L</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Gelrite</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">G1919</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">D134406</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:256px;">QIAcube robot workstation</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">9001292</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:256px;">Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Goldbio, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11304-029</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem

संयुक्त राष्ट्र के खाद्य और कृषि संगठन दुनिया में खाद्य फसलों का 25% aflatoxins साथ दूषित कर रहे हैं कि अनुमान है। यही कारण है कि भोजन के 100 लाख टन से नष्ट कर दिया या प्रत्येक वर्ष गैर मानव उपभोग के लिए भेज दिया जा रहा है प्रतिनिधित्व करता है। Aflatoxins सामान्य रूप से अनाज, नट्स, रूट फसलों और अन्य कृषि उत्पादों में कवक Aspergillus flavus और ए parasiticus द्वारा संचित शक्तिशाली कार्सिनोजन हैं। मूंगफली पौधों में शाही सेना के हस्तक्षेप (आरएनएआई) द्वारा पांच एफ्लाटॉक्सिन-संश्लेषण जीन का मुंह बंद ए के साथ टीका निम्नलिखित एफ्लाटॉक्सिन संचय नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था flavus। ये आम तौर पर एफ्लाटॉक्सिन-अनुकूल परिस्थितियों के तहत कुछ बीज, और बड़े क्षेत्र प्रयोगों के पारंपरिक तरीकों का उत्पादन के रूप में पहले, कोई विधि, व्यक्ति मूंगफली ट्रांसजेनिक घटनाओं में आरएनएआई की प्रभावशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक विकल्प नहीं थे अस्तित्व में। क्षेत्र में, स्वाभाविक रूप से दूषित बीज पाने की संभावना, 1/1 करने के लिए अक्सर 1/100 हैइसके अलावा 000, एफ्लाटॉक्सिन संदूषण समान रूप से वितरित नहीं किया गया है। हमारे विधि वास्तविक समय पीसीआर (आरटी पीसीआर) के लिए कार्रवाई की छोटे टुकड़े या छोटे आरएनए अनुक्रमण के साथ, ट्रांसजेनिक घटना के अनुसार कुछ बीज का उपयोग करता है, और अल्ट्रा-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (UPLC) द्वारा एफ्लाटॉक्सिन संचय के विश्लेषण के लिए। आरएनएआई व्यक्त मूंगफली लाइनों 288-72 और 288-74, 14,000 एनजी तक जमा कि नियंत्रण की तुलना में एफ्लाटॉक्सिन बी 1 में 100% की कमी (p≤0.01) और बी 2 के लिए आए थे। जी -1 एफ्लाटॉक्सिन बी 1 जब की aflatoxigenic ए के साथ टीका flavus। संदर्भ के रूप में, संयुक्त राज्य अमेरिका में मानव उपभोग के लिए स्वीकार्य aflatoxins की अधिकतम कुल 20 एनजी है। जी -1। इस प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक मूंगफली बीज और उसके मूल्यांकन के लिए तरीकों में aflatoxins की आरएनएआई की मध्यस्थता नियंत्रण के आवेदन का वर्णन है। हम मूंगफली और अन्य फसलों के प्रजनन में अपने आवेदन विज्ञान के इस महत्वपूर्ण क्षेत्र में तेजी से उन्नति लाएगा का मानना ​​है कि, चिकित्सा और मानव पोषण, और काफी प्रमुख खाद्य फसलों में aflatoxins, और संभवतः अन्य mycotoxins नियंत्रित करने के लिए अंतरराष्ट्रीय प्रयास में योगदान करेगा।

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RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

हम कवक Aspergillus flavus में एफ्लाटॉक्सिन-संश्लेषण जीन मुंह बंद करने के लिए आरएनए हस्तक्षेप का संकेत होते हैं कि मूंगफली के बीज में aflatoxins और transgene अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए एक विधि का प्रदर्शन। पौधों में mycotoxins के आरएनएआई की मध्यस्थता नियंत्रण पहले से नहीं बताया गया है।

मूंगफली में aflatoxins की आरएनएआई की मध्यस्थता नियंत्रण: विधि मूंगफली में mycotoxin उत्पादन और ट्रांसजीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए /<em&gt; एसपरजिलस</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Research

JoVE Journal

Environment

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

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