Name: rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem
Uploaded: 2015-12-21T14:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem at JoVE.c

This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

The authors have nothing to disclose or any conflicts of interest.

Завод-хост RNAi-обеспечиваемого молчания генов в патогенных грибов было продемонстрировано 27,43, однако, нет публикаций, показывающие возможность RNAi-опосредованной контроля микотоксинов накопления в растениях. Один ограничивающим фактором для этих исследований в арахиса было отсутствие метода оценки не-афлатоксина накопления фенотип в отдельных растений, а листья не показывают симптомов при грибковой инфекции подземных контейнеров. Кроме того, не-нормально распределена накопления афлатоксинов, и потребность в больших выборках для химического анализа 15,16 препятствовали количественно потенциального эффекта РНК-интерференции на одном заводе. Метод, представленный здесь, состоит из 72 ч экспериментов с использованием пяти семена, чтобы выполнить три 24 ч интервал выборки в трех экземплярах (таблица 1, рисунок 7). По сравнению с типичной анализа афлатоксина, который требует не менее 100 г семян, наш метод особенно подходит для индивидамил трансгенные события арахиса растений, которые изначально не производят не более двух или трех стручков. РНК-опосредованного молчание синтеза афлатоксина была продемонстрирована генетически трансформации Aspergillus Flavus и A. parasiticus. Так AFLR является основным регулятором производства афлатоксина в А. Flavus и А. parasiticus 44,45, он становится интересным объектом для РНК-опосредованного молчания в растениях. Тем не менее, генетические вариации в AFLR было показано среди Aspergillus видов 46, и эти генетические варианты могли избежать, если заглушить нет идеально совпадающей последовательности с сигналом RNAi, полученного в растения-хозяина. Таким образом, AFLR был одним из мишеней для глушителей в векторном p5XCAPD, но не был единственным. Инвертированных повторов гена AFLR, внесенные в А. Flavus и А. parasiticus путем преобразования привели к глушителей и минимальным или нет продуктионный афлатоксинов 47 (McDonald и др., 2005b). Кроме того, глушителей AFLD ген предотвратить производство афлатоксина до 98% в А. Flavus и А. parasiticus в прямом преобразовании 48. Для повышения вероятности успеха в нашей системе, арахисовое трансформировали инвертированный повтор фрагментов пяти генов, участвующих в производстве афлатоксина в А. Flavus. Здесь показано, что использование p5XCAPD, что цели для глушителей несколько генов в синтез афлатоксина пути, 90% -100% более низкие уровни афлатоксина B 1 и B 2 были достигнуты в соответствии 288-72 и 60-100% более низкие уровни, накопленный в Линия 288-74 по сравнению с контролем, когда половина семядоли были засеянной А. Flavus, цифры 4, 7. Самое главное, этот метод обнаружено статистически значимых различий в накоплении афлатоксина от линий 288-72 288-74, против контроля на протяжении всего эксперимента с применением параметрического STATISтики, Рисунок 7. Учитывая небольшой размер выборки, важно подчеркнуть необходимость использования мощного метода для обнаружения афлатоксины, эти эксперименты были проанализированы с помощью UPLC который имеет высокое разрешение, в пять раз более высокую производительность и в три раза более высокую чувствительность, чем ВЭЖХ 49. Экспрессия РНК-интерференции вставки в 288-74 был обнаружен только в незрелых семядолей (желтый) в 24 ч инкубации. Вставка РНК-интерференции не обнаруженные RT-PCR на зрелых семядолей 288-74 на 24 часов, или на любом погашения группы в 48 ч, на рисунке 6. Это же явление наблюдалось и в других РНК-интерференции трансгенных линий арахиса (Arias, RS, 2015 неопубликованные), где обычно RNAi стенограммы были обнаружены только на незрелых семядолей на 24 часов. Образцы РНК обрабатывали ДНКазой перед синтеза кДНК, данные были нормированы на уровень экспрессии актина и без признаков контаминации ДНК наблюдалось. Должен ДНК были присутствовать в образцах, он долженбыли обнаружены в образцах ч 48, а также, но последовательно, что было не так. Выражение под контролем 35S промотора не всегда равномерное; это может повлиять на условия окружающей среды 50, типа ткани и стадии развития 51,52. В то же время, в пути РНК-интерференции, скорость распада мРНК и скорость распада миРНК может значительно варьироваться в зависимости 53. Вполне возможно, что быстрое ухудшение мРНК по механизму РНК-интерференции могло бы предотвратить обнаружение мРНК на 48 ч инкубации. Будь отсутствие экспрессии на 48 часов было связано с низким 35S-промотора приводом транскрипции, или быстрой деградации дцРНК по Dicer остается без ответа. Таким образом, обнаружение малых РНК высокой пропускной последовательности даст лучшее представление о процессах, происходящих через РНК-интерференции 54 В этих экспериментах. Однако, поскольку РНК молчание распространяется системно, в основном, через флоэмы от photosyntненавижу источники сахарозу раковины (в этом случае арахиса семян) 55, замалчивание афлатоксина-синтеза может произойти в семенах без местного выражения RNAi вставки. Много исследований еще предстоит сделать, чтобы определить пороговый уровень малых интерферирующих РНК (миРНК), необходимых для предотвращения накопления афлатоксина в семенах. Важно подчеркнуть тот факт, что оба, экспрессия мРНК в РНК-интерференции построить (рисунок 6), и накопление афлатоксин B 1 и B 2 (рис 7) показали разные результаты для незрелых (желтый) против. зрелая (коричневый) семядоли. Арахис растения имеют неопределенный рост, то есть, они представляют во время сбора урожая в диапазоне от погашения стручки, рис 2. Кроме того, семена из разных групп зрелости отличаются по своему химическому составу., Например, 2,4% сахарозы в незрелых семян, а 1,9% в зрелые семена под одной полевых условиях. 56,57 Таким образом, чтобы понять фактическое efficiencу РНК-опосредованного контроля накопления афлатоксина, важно, чтобы проанализировать группы отдельно зрелости. Естественный защита семян арахиса является производство фитоалексинов, которая меняется в многообразии соединений, полученных и их относительных величин, в зависимости от зрелости семян и условий окружающей среды 58-61, и это особенно выше у эмбрионов по сравнению с семядолей 62. Эмбрионы также значительно более высокие концентрации нуклеиновых кислот, ДНК и РНК, чем семядолей (Arias RS, неопубликованных). Как семена арахиса созревают, изменения в их физиологии и химического состава происходит 63. Фенольные антиоксиданты в форме арахиса теста конденсированных дубильных веществ с фунгистатическим деятельности; 64 это очевидно в мезокарпий цвета, который отражает погашения этапы, желтые черный 35, а его содержание дубильных веществ и фенольных соединений увеличивается с зрелости 65. Таким образом, наличие тТелепрограм или эмбрионов в эксперименте, с учетом их антимикробные свойства, мог бы ограничен рост грибков и, следовательно, трудно переоценить эффект RNAi молчания, следовательно, они были удалены. Кроме того, удаление кожуры и эмбрионов помогает ограничить источники вариации в анализе, как половина семядолей, который несет зародыш будет больше и больше фитоалексинов содержание РНК. В дополнение к анализу зрелости групп и удаление семенной кожуры и зародыша в этих экспериментах, важно отметить, несколько наблюдений: а) если результаты приведены в течение 96 ч инкубации, рекомендуется использовать не более чем на 72 ч, чтобы получить достоверные результаты, так как семена получают разрушается 96 часов; и б), тогда как половина семядоли из того же семени, хотя пробы случайным образом, не являются идеально независимых выборок, ОТ-ПЦР и накопление афлатоксина в трансгенных событий показал минимальную вариацию между семенами. Кроме того, рассчитывать точное грибковые споры, объем посевнойс 2 мкл, и применение спор на поверхности среза семядолей избегая капает по бокам важны, чтобы убедиться, проросшие споры подвергаются ткани растений. Вода / агар на пластинах должны быть на уровне 1,5% (вес / объем), более мягкий агар вызывает сток спор, как показано на последнем кадре, показанном на фиг.4 (внизу). Если семена наличие от конкретного трансгенного случае ограничивается, выборка может быть сделано в двух экземплярах вместо тройных получения аналогичными результатами (например, рисунок 7); Однако три образца поможет уменьшить стандартную ошибку. Единственное ограничение этого метода является то, что он требует очень чувствительная система (UPLC) для обнаружения афлатоксин / количественного, но в то же время это уменьшает вероятность переоценить влияние РНК-интерференции должны афлатоксины не обнаружено менее чувствительных методов. В заключение, этот метод предлагает впервые надежный подход для изученияЭффект РНК-интерференции в контроле афлатоксинов. Сокращение времени для эксперимента из всей посевной сезон до менее чем за одну неделю, этот метод будет чрезвычайно ускорить исследования по РНК-интерференции арахиса / Aspergillus pathosystem к смягчению и / или устранению афлатоксинов.

Примерно 4,5 миллиарда человек хронически подвергаются афлатоксинов 1, наиболее мощных канцерогенов, известных в природе 2. Эти микотоксины загрязняют 25% продовольственных культур в мире, в том числе 3 кукурузы, маниоки, риса, орехов, злаков и специй. 4. Афлатоксины причина задержки роста у детей 5, ослабляют иммунную систему 6, присутствуют в 58% гепатоцеллюлярной карциномы в-человека биопсии 7,8, и убить сотни людей во время периодических вспышек Афлатоксикоз 9,10. Афлатоксины поликетида полученных микотоксинов обычно производимые Aspergillus Flavus и А. parasiticus; афлатоксины В 1 и В 2 получают путем А. Flavus, в то время как А. parasiticus также производит G 1 и G 2. Химическая структура этих соединений и хроматограмме, показывая их разделение по UPLC показаны на рисунке 1. </strОнг&gt; <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> Рисунок 1. Афлатоксины и РНК-интерференции вставить Топ:. Химическая структура (слева) и пример хроматограммы (справа) из четырех наиболее распространенных поликетида полученных афлатоксинов: В 1, В 2, С 1 и С 2, производится Aspergillus parasiticus, A . Flavus производит В 1 и В 2 Bottom: Схема генных фрагментов в РНК-интерференции построить p5XCAPD для арахиса трансформации, цифры под стрелы ген-фрагмент инвентарные номера в Flavus генома Aspergillus;. PIV2: картофель интрон; BP: пар оснований; RT_5X_1 и RT_5X_2:. Real-Time ПЦР праймеров сайты <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> Экономические потери в экспорте из-за афлатоксинов в арахисе в одиночку превышать $ 450 млн долларов США, если рассчитывается на основе 4 нг. Г -1 предел афлатоксина разрешено для потребления человеком в Европейском союзе 11. Афлатоксины были известны в течение 60 лет 12; Однако, хотя многие сельскохозяйственные практики были разработаны, чтобы смягчить их влияние, в том числе применения других грибковых штаммов 13,14, либо последовательный способ управления не существует, и устойчивые сорта растений не доступны. Тестирование зародышевой плазмы растений на устойчивость к афлатоксинов особенно трудно, потому что даже при благоприятных условиях для патогена вторжения, микотоксинов накопление непредсказуемо и не соответствует нормальному распределению. Таким образом, эксперименты, как правило, требуют больших площадей посадки, сотни семян и нескольких образцов 100-1,700 г, чтобы уменьшить изменчивость 15,16 данных. РНК-интерференция былаобнаружили в 1998 году 17; и преимущества &quot;глушителей&quot; В настоящее время изучаются в ряде новых приложений, например., в человеческих терапий против метастатическим раком молочной железы 18, рака печени 19, миелолейкоза 20, и в защите растений от насекомых и нематод 21 22. В растениях, сигналы помех РНК может путешествовать клетки к клетке, с малых интерферирующих РНК (миРНК) и высокой молекулярной массы РНК отвечать за системной посттранскрипционном гена глушителей 23,24, даже внутри грибковых патогенов, которые находятся в тесном контакте с растением-хозяином 25. Эффективность РНК-интерференции на завод-опосредованной молчания грибковых патогенов генов был описан в нескольких pathosystems растений, для них, визуальный осмотр симптомов в надземные части растения (листья) позволил количественного заболевания, т.е. оомицет Bremia в салат 26 , Puccinia в пшенице <suр&gt; 27 и Fusarium в банан 28. Гораздо сложнее оценить RNAi эффективность для контроля микотоксинов в растениях, в частности афлатоксины в арахисе, как листья не показывают никаких признаков инфекции, органы вторглись (семена) находятся под несколькими дюймами почвы, возникновение инфекции является непредсказуемым, и только химический Анализ может определить наличие афлатоксинов. Кроме того, каждый трансгенной событие арахиса обычно производит несколько семян (4-6 на растение); Поэтому традиционные испытания на нет-афлатоксина накопления признака в больших полевых участках, прочного весь обрезки сезонов, и, используя сотни семян не представляется возможным. Способ описан здесь анализировать менее одной недели, РНК-интерференции семена арахиса для присутствия трансгена и для не-афлатоксина накопления признака, используя только несколько семян.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:256px;">Primers, oligonucleotides</td>
			<td style="width:127px;">DNA Technologies, Coralville, IA, USA</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Dneasy Plant Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">69106</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:256px;">Czapek Dox agar medium</td>
			<td style="width:127px;">Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">CM0095</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Agar</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">BP 1423</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Freezer -80&#176;C</td>
			<td style="width:127px;">n/a</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Aluminum Oxide, Al2O3</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A941</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">SPE Reservoirs 1.5 mL</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">210011</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Frits for 1.5 mL SPE reservoir</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">211401</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;">186005221</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="150">
			<td height="150" style="height:150px;width:256px;">Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:256px;">Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">A6636; A9887; A0138; A0263</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Systat Software 12.2</td>
			<td style="width:127px;">SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">15596-018</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11752-050</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:256px;">ABI 7500 Real-Time PCR</td>
			<td style="width:127px;">Lifetechnologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:123px;">4406984</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Luria Broth-Miller</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">R453642</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">pENTR1A</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">A10462</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11791-020</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB Biolabs</td>
			<td style="width:123px;">M0202L</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Gelrite</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">G1919</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">D134406</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:256px;">QIAcube robot workstation</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">9001292</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:256px;">Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Goldbio, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11304-029</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem

Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций оценивает, что 25% из продовольственных культур в мире заражены афлатоксинов. Это представляет 100 миллионов тонн продовольствия разрушается или направляются на потребление нечеловеческого каждый год. Афлатоксины мощные канцерогены, как правило, накопленные грибов Aspergillus Flavus и А. parasiticus в крупах, орехах, корнеплодах и других сельскохозяйственных продуктов. Подавление пяти генов афлатоксин-синтеза РНК интерференции (РНК-интерференции) в арахиса растений используется для управления накопление афлатоксина после прививки с А. Flavus. Ранее ни один метод не существовал, чтобы проанализировать эффективность РНК-интерференции в отдельных арахиса трансгенных событий, так как они, как правило, производят несколько семян и традиционных методов крупных полевых экспериментов в рамках афлатоксина-благоприятные условия были не вариант. В поле, вероятность нахождения естественно загрязненных семян часто 1/100 до 1/1,000. Кроме того, содержание афлатоксинов не распределены равномерно. Наш способ использует несколько трансгенных семян на событии, с небольшими кусочками, обработанных для ПЦР в реальном времени (RT-PCR) или небольшой РНК последовательности, и для анализа накопления афлатоксина методом жидкостной хроматографии ультра-производительности (UPLC). RNAi-экспрессирующих арахиса линии 288-72 288-74 и, показали до 100% снижения (p≤0.01) в афлатоксина В 1 и В 2 по сравнению с контролем, что накопленный до 14000 нг. Г -1 афлатоксина В1, когда засевают aflatoxigenic А. Flavus. Для справки, общий максимальный объем афлатоксинов допустимых для потребления человеком в Соединенных Штатах составляет 20 нг. Г -1. Этот протокол описывает применение РНК-интерференции-опосредованного контроля афлатоксинов в трансгенных семян и методы ее оценки арахиса. Мы считаем, что его применение в разведении арахиса и других культур принесет быстрое продвижение в этой важной области науки, Медицина и питание человека, и внесет значительный вклад в международные усилия, чтобы контролировать афлатоксины и потенциально другие микотоксины в основных продовольственных культур.

Плазмиды p5XCAPD было сделано как производное pCAPD 29, и использовали его для преобразования арахиса растений; этот вектор несет инвертированные повторы пяти небольших фрагментов, каждый 70-80 б.п., генов афлатоксин-синтеза А. Flavus разделенные интрона (рисунок 1). Фрагменты AFL2G_07224 (AFLR), AFL2G_07223 (AFLS или aflJ), AFL2G_05027 (афлатоксина оттока насоса, aflep), AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1), и AFL2G_07731 (pes1) были использованы для конструкции, цифры на рисунке 1 соответствует , Flavus генома аннотации в Broad Institute, Кембридж, штат Массачусетс, и литературы 42. В общей сложности 99 линий арахиса регенерируют после прохождения процесса трансформации, 50 были ПЦР положительный для NPTII обнаруженного STN-ПЦР, и 33 линии были ПЦР положительные и производства семян. Только семь ПЦР положительные линии клонально размножают и проходят проверку на PresenСпособ т к накоплению афлатоксина, все семь показали между 60% и 100% меньше, чем накопления афлатоксина контролем. Здесь мы показываем результаты двух из этих семи линий. Как отдельные трансгенные события обычно производят несколько семян, был разработан метод, чтобы использовать минимальное количество семян в то же время быть в состоянии сделать параметрический статистический анализ. Блок-схема подготовки пробы и экспериментальной установки показана на рисунке 5 и в таблице 1. Хотя первое поколение трансгенных семян, как правило, гемизиготной, ожидается, что клетка-к-клетке и системной движения малых интерферирующих РНК (киРНК) генерируется через РНК-интерференции должны придать афлатоксин-синтез молчание по всему растению. <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> Рисунок 5. Схема блок-схема метода для анализа эффективности RNAi замолчать </sЧонг&gt; Aspergillus гены афлатоксин-синтеза в семенах арахиса. Графическое представление потока рабочей при обработке образцов арахиса для экспрессии генов или анализ афлатоксина. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> RNAi арахиса линии 288-72 288-74 и показал наличие селективного производителя NPTII, когда проходят проверку STN-ПЦР, гель разделы показаны на рис 6 (сверху), оригинальные фотографии доступны от авторов по запросу. Плазмиду pCAPD не использовали в качестве контроля трансформации, поскольку он кодирует инвертированных повторов двух генов CMR (устойчивости к хлорамфениколу) и БДКК (токсин) неизвестного воздействия на растения. ПЦР отрицательный арахисовое линии 288-9 и другие, которые прошли через процесс регенерации и выращивали в тех же условиях, что и РНК-интерференции линий, были использованы в качестве отрицательного конTrol. <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> . Рисунок 6. Обнаружение трансгенов и в режиме реального времени выражение РНК-интерференции вставка Топ: Однотрубная, обнаружение Вложенные ПЦР трансгенных линий арахиса РНК-интерференции 288-72 и 288-74 РНК-интерференции, положительных установок. Управление: W (вода), ПП (положительный завод), ММ (мастер микс), р (плазмиды p5XCAPD); фракции 1/2 1/4 1/8 1/16 представляют 2-кратного разведения ДНК Внизу:. ПЦР в реальном времени обнаружение экспрессии РНК-интерференции вставки (наборы праймеров: RT_5X_1, RT_5X_2, как показано на рисунке 1, на незрелых ( желтый) и пожилые (коричневый) семядоли трансгенных линий на 24 и 48hr инкубации; серая линия: C T = 1. Гистограммы представляют средства и стандартные бары ошибках (Т) трех биологических образцовс трех технических повторяет. Относительная количественная оценка РНК-интерференции вставкой нормализовалось по отношению к гену домашнего хозяйства актина в качестве внутреннего контроля и сравнительного выражения кратным трансгена, рассчитанной, как описано в 5.2.2 и 5.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> Чтобы проверить эффективность завода-хост РНК-интерференции-опосредованного потенциального контроля накопления афлатоксина, свежеубранных конидий Aspergillus Flavus NRRL 3357 были применены на поверхности среза половиной семядолей, из которых эмбрионы и теста были удалены (рис 3, 4). А. Flavus NRRL 3357, для которых геном был последовательности и стала основой для проектирования p5XCAPD, был любезно предоставлен доктором Рога в USDA-ARS-NPRL. Полученную грибковых вторжения половины семядолей после 24, 48 и 72 ч при 30 ° С в шоу<html> п на рисунке 4. Образцы инокулированных половиной семядолей были собраны в 24, 48, 72, 96 ч инкубации и анализировали на главной четыре афлатоксинов В 1, В 2, G 1 и G 2 с помощью UPLC и подтвердили методом ЖХ-МС ; Результаты показаны на рисунке 6. концентрации Афлатоксин были определены с использованием опубликованного метода с изменениями 36. В 96 ч инкубации, семядоли начинают разрушаться из-за грибковой инфекции. РНК-интерференция линии 288-72 показали значительно более низкие уровни афлатоксинов, чем контроль на всех выборки дат в незрелых семядолей и в большинстве даты отбора проб в зрелых. РНК-интерференция линии 288-74 показали значительно более низкие уровни афлатоксинов в большинстве даты отбора проб. Уровни значимости теста Тьюки указаны звездочками в графике на рис 7. <html> g7.jpg &quot;/&gt; . Рисунок 7. Афлатоксины В 1 и В 2 в половине арахиса семядолей после инкубации (24, 48, 72 и 96 часов) с Aspergillus Flavus управления: семена 288-9 без трансгенной линии; РНК-интерференция: семена РНК-интерференции-288-72 и 288-74-РНК-интерференции, трансгенных для РНК-интерференции p5XCAPD, чтобы заставить замолчать афлатоксин пять генов-синтеза. (А) афлатоксин В1 в зрелых семян (коричневый); (B), афлатоксин B 2 зрелые семена; (С) афлатоксин В1 в незрелых семян (желтый) и (D), афлатоксин В 2 в незрелых семян. Представлены средние значения с соответствующими стандартными баров ошибках (Т) дубликатов биологических образцов. Статистически значимые различия Тьюки тест *: р ≤ 0,05, ** Р ≤ 0,01, ***: р ≤ 0,001.с: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg &quot;целевых =&quot; _blank &quot;&gt; Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. В целом, RNAi-288-72 показали в течение всего эксперимента (24 до 96 ч инкубации), 94% снижение афлатоксина В 2 в -100%, и 90% снижение на -100% в афлатоксина В1 по сравнению с контролем. РНК-интерференции 288-74 показали 63% снижение в -100% в афлатоксина B 2 и 60% -100% снижения в афлатоксина B 1, рисунке 7. Праймеры, используемые в режиме реального времени обнаружения ПЦР экспрессии вставки РНК-интерференции показаны на рисунке 1. Арахис-семян семядоли были проанализированы без эмбрионов, чтобы удалить их естественные защитные и быть в состоянии обнаружить потенциальный эффект РНК-интерференции на площади, наиболее подверженных грибковые вторжения, семядоли. Экспрессия РНК-интерференции вставка обнаружен в незрелых семядолей (желтый) линии 288-74 от набора праймеров RT_5X_1 был четыре раза за C T </sUB&gt; = 1 порог отрицательного контроля, и набор праймеров RT_5X_2 был 19 раз выше порога, все при 24 ч инкубации. По крайней мере, три из пяти последовательных генных фрагментов, используемых в преобразовании арахисовое, 5027, 7223 и 7228 (aflep, AFLS / aflJ и aflC / pksA, соответственно) были обнаружены методом ОТ-ПЦР (Рисунок 1, 6). Выражение РНК-интерференции вставкой не был обнаружен в зрелых семядолей на 24 часов, или на зрелых или незрелых семядолей на 48 ч инкубации, рис 6 (нижний). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> Арахис линия </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Время выборки </td><td colspan="3" style="width:192px;"> Образцы для ОТ-ПЦР </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> Образцы для анализа афлатоксина (прививку) </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Nхариус семян </td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> (не инокулированный) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Вес 1 </td><td style="width:64px;"> Вес 2 </td><td style="width:64px;"> Вес 3 </td><td style="width:64px;"> Вес 1 </td><td style="width:64px;"> Вес 2 </td><td style="width:64px;"> Вес 3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> РНК-интерференция (желтый) </td><td style="width:64px;"> 24 ч </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48 ч </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdстиль = &quot;ширина: 64px;&quot;&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72 ч </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Контроль </td><td style="width:64px;"> 24 ч </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> (желтый) </td><td style="width:64px;"> 48 ч </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72 ч </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> Таблица 2. Пример установки маленького образца для анализа экспрессии генов и накопление афлатоксина в RNAi семян арахиса. Полный анализ экспрессии и афлатоксины для одной группы зрелости (т.е.., Желтый), три раза выборки (24, 48 и 72 ч) в трех экземплярах, потребует 4,5 семена, каждый номер один в таблице представляет половину семядолей.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem at JoVE.c

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Мы демонстрируем метод для анализа афлатоксинов и экспрессии трансгена в семенах арахиса, которые содержат РНК-интерференции сигналов для глушителей генов афлатоксин-синтеза в гриба Aspergillus Flavus. RNAi-опосредованной контроль микотоксинов в растениях не сообщалось ранее.

РНК-интерференции-опосредованного управления афлатоксинов в арахисовом: метод анализа микотоксинов, производство и трансгенных выражение в Арахис /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Research

JoVE Journal

Environment

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Оптимизация дымовых Настройки Газовые поощрять микроводорослей рост в фотобиореакторы через компьютерных вычислений

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Переходные экспрессии генов в табак с помощью Gibson Ассамблею и генной пушки

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Добыча и анализ микробных фосфолипидов жирных кислот в почвах

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

A Таблица складками термоградиентный для управления температуры почвы для оценки роста растений и мониторинга почвенных процессов

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

Производство и измерение органических частиц в зале окружающей среды Гарвардского

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Процедуры лабораторных фумигации вредителями с газом окиси азота

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Завод инфекции тест: Спрей и Рана опосредованной прививка с завода возбудителя Magnaporthe мурены

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Оценке возможности удаления частиц дерева листья

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Visualizing Efficacy of Pesticides Against Disease Vector Mosquitoes in the Field

Визуализация эффективность пестицидов против болезнь векторного комаров в области

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Состав и распределение анализ биоаэрозоли в различных экологических условиях

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...