Name: rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem
Uploaded: 2015-12-21T14:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem at JoVE.c

This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

1. Molekylär Construct och Peanut Transformation <ol><li> Kombinera DNA-fragment av fem A. flavus gener, AFL2G_07223 (AFLs eller aflJ), AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07228 (AFLC / pksA / pksL1), AFL2G_07731 (pES1) och AFL2G_05027 (aflatoxin effluxpump, aflep). För detta kan du använda följande primers och ultramers: DIR-1, Short-kat1-R, DIR-2-inverterad, Short-DIR2-R, DirAll-Nco-Rv och DirAll-BamEco-Fw, tabell 1. <ol><li> Gör DIR-en dubbelsträng med 5 PCR-cykler (25 pl reaktion, 95 ° C 2 min, följt av 5 cykler av 94 ° C 45 sek, 55 ° C 30 sek, 68 ° C 15 sek) med användning av DNA-polymeras enligt tillverkarens instruktioner och primer Short-kat1-R för att lämna en 3 &#39;överhäng CCCGT. Upprepa dessa steg för att göra DIR-2-inverterad dubbelsträng med hjälp av primer Short-DIR2-R för att lämna en 3 &#39;överhäng ACGGG komplementär till DIR-1. </li><li> Ligera två 199 bp fragmeNTS med T4-DNA-ligas enligt tillverkarens instruktioner. PCR-amplifiera det resulterande 393 bp-fragmentet som anges i 1.1.1 med användning av primrar DirAll-CACC-Fw och DirAll-Nco-Rv (tabell 1), och klona den produkten med hjälp av standardtekniker in i pENTR1A att göra plasmid p2 + 4ENTR. </li><li> Rekombinera P2 + 4ENTR in pCAPD 29 (NCBI accessionsnummer: KC176455.1) med användning av LR CLONASE II enzymblandning i enlighet med tillverkarens instruktioner för att göra plasmiden p5XCAPD, och omvandla det till Escherichia coli DH5a med användning av standardtekniker, följt av partiell sekvensering. Anm: Den fullständiga RNAi insättningen visas i tabell 1. </li></ol></li><li> Omvandla Agrobacterium-stam C58C1 30 med plasmid p5XCAPD såsom tidigare rapporterats 30, och använda den resulterande bakterien för att transformera jordnötsplantor enligt följande: <ol><li> Odla vid 30 ° C Agrobacterium inhysande p5XCAPD, använda för detta, 50 ml LB--buljong kompletterad med 500pg ml -1 streptomycin, 25 mikrogram ml -1 gentamicin, 10 mikrogram ml -1 kanamycin och skaka kulturen vid 250 rpm tills den når en OD 260. </li><li> Skörda Agrobacterium cellerna genom centrifugering (6000 x g) under 10 minuter, återsuspendera i 50 ml AB minimalmedium 31 med 100 iM acetosyringon under 1 timme, och placera i bakteriesuspensionen explants från 10-14 dagar gamla plantor Exp27-1516, löpare -typ jordnötsförädlingslinje. Blot torka explants på 3MM läskpapper efter 30 minuter, och placera dem på shoot-induktionsmedium (SIM) [MS salt 32, 3% sackaros, 20 iM bensylaminopurin (BAP), 10 iM tidiazuron (TDZ), pH 5,8, 0,3 % gellangummi] utan antibiotika i mörker under tre dagar. </li><li> Gör val vävnad och förnyelse som redovisas före 33. Flytta vävnader till SIM (500 iM cefotaxim och 100 iM kanamycin) för skottbildning, med varannan vecka överföringar i 2 månader. Sedan platsexpanderande skott på shoot-förlängning medium (SEM) [5 iM BAP, 1 iM gibberellinsyra (GA 3)], varannan vecka i flera månader. </li><li> Placera individuella skott, 2 cm i storlek, i rot-induktionsmedium (RIM) [1/2 MS 1,5% sackaros, 5 pM α-naftalen-ättiksyra (NAA), 2,5 pM indol-smörsyra (IBA)], sedan vänja plantorna och överföra dem till växthuset. </li></ol></li></ol> 2. Identifiering av Peanut växter hyser RNAi till Silence Aflatoxin Syntes gener <ol><li> Använd plant mini kit i en robot arbetsstation med 200 ul eluering enligt tillverkarens instruktioner för att extrahera DNA från unga blad jordnötsplantor som var föremål för omvandlingsprocessen (som tidigare beskrivits) med RNAi konstruera p5XCAPD (Figur 1), som har som ryggrad plasmid pCAPD 29 för geners uttryck. </li><li> Sikta de DNA-prover från enkelrörs nested PCR (STN-PCR) såsom beskrivits PREVígare 34 för att detektera den selekterbara markören NPTII och RNAi-insättningen från p5XCAPD. Klonalt utbreda sig från nedskärningar (3-4 noder) PCR-positiva anläggningar för att producera tillräckligt med utsäde till testning denna första generation. <ol><li> Använd fyra 2-faldiga utspädningar av DNA (50-100 ng il -1 före utspädning) i alla STN-PCR-reaktioner. För NPTII, använder externa primrar PCAPD 5714F: 5&#39;-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3 &#39;och PCAPD 6446R: 5&#39;-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3&#39;, och interna primrar PCAPD 5730F: 5&#39;-ACTGGGCACAACAGACAATC-3 &#39;och PCAPD 6249R: 5&#39;-ATATTCGGCAAGCAGGCATC- 3 &#39;. </li><li> För detektion av RNAi infoga i STN-PCR-reaktioner använder externa primrar 35S-PDSFw: 5&#39;-CCTAACAGAACTCGCCGTAA-3 &#39;och DirAll-NcoI-Rv: 5&#39;-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3&#39;, och interna primrar Probe_5027_Fw: 5&#39;-gtatttgtgaccatgtttctg-3 &#39;och Probe_7228_Rv: 5&#39;-GGACGGATAGTAAACTGCGG-3&#39;. </li></ol></li><li> Harvest jordnöt skida från STN-PCR positiva växter och den con<html> trollplantor som odlas under samma betingelser. Avgörande steg: Se till att kontrollen växter odlas i samma villkor och samma säsong som de RNAi växter. Vatten blast skida med högtryckstvätt vid låg intensitet eller skrapa för hand för att avlägsna exocarp, bestämma färgen på mesocarp genom att placera skida på löptid styrelse och separata skida i grupper (gult, orange, brunt och svart) 35 (figur 2). </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig2.jpg" /> Figur 2. Beredning av jordnötter skida för analys. Till vänster: Olika jordnötter storlekar finns på skörden som jordnötter är en obestämd tillväxt växt; Center: placera jordnötter i metallkorg för vattentryck avlägsna exocarp, Höger: löptid grupper genom mesocarp färg på en jordnöt profilskivan (gul, orange, brunt och svart).98fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. 3. Experimentell Setup <ol><li> Ta bort skrov, process gula och bruna frön separat. Beräkna antalet frön för att använda i experimentet enligt tabell 2. Observera att minst tre utsäde bitar (1 frön bit = halv Cotyledon) per jordnöts linje och provtagningsdatum krävs för att utföra statistiska analyser och minska standardfelet. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="33"><td height="33" style="height:33px;width:147px;"> Namn </td><td colspan="3" style="width:421px;"> Sekvens </td></tr><tr height="124"><td height="124" style="height:124px;"> DIR-1 </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;- GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCGTATTTG TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC ATTCCCCAGATCACGGACGAATCCCCTGCATCTACGCGCACGCATC ACTTGGGGTACCCGT-3 &#39; </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> Short-kat1-R </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-Phos-TACCCCAAGTGATGCGTGCGCG-3 &#39; </td></tr><tr height="126"><td height="126" style="height:126px;"> DIR-2-inverterade </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;- GGTTATTGGGTGCAGAATGGTAAACCACCCAACAGTACGCGAAATG TCAATTCCAGAGTCCCAAACCTCCCTACCGTGGCCTGGACGGATAG TAAACTGCGGAGCTTGGGAACAAAATCCGCTGTCTGATCGCCGAAG AGAAAGAGTTGCCTTGATTGAGCCGCATCGAGGACAGGTTGTGTTG CTGTTGATAGACGGG-3 &#39; </td></tr><tr height="29"><td height="29" style="height:29px;"> Short-DIR2-R </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-Phos-CTATCAACAGCAACACAACC-3 &#39; </td></tr><tr height="30"><td height="30" style="height:30px;"> DirAll-CACC-Fw </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-CACCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 &#39; </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> DirAll-NcoI-Rv </td><td colspan="3"> 5&#39;-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3 &#39; </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> DirAll-BamEco-Fw </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-ATGGGATCCGAATTCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 &#39; </td></tr><tr height="197"><td height="197" style="height:197px;"> Komplett RNAi insatsen </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;- GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTC / GTATTTG TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC ATTCCCCAGATCACGGACGAAT / CCCCTGCATCTACGCGCACGCAT CACTTGGGGTACCCGTCTATCAACAGCAACACAACCTGTCCTCGAT GCG / GCTCAATCAAGGCAACTCTTTCTCTTCGGCGATCAGACAGCG GATTTTGTTCCCAAGCTCCGCAGTTTACTATCCGTCCA / GGCCACGG TAGGGAGGTTTGGGACTCTGGAATTGACATTTCGCGTACTGTTGGG TGGTTTACCATTCTGCACCCAATAACC-3 &#39; </td&gt; </tr></tbody></table> . Tabell 1. Oligonukleotider och ultramers används för att bygga RNAi konstruera p5XCAPD Phos: fosforylerades 5&#39;-änden; &quot;/&quot; Skiljer de fem genfragmenten användes; Komplett RNAi infoga: sekvens som 2 inverterade upprepningar för att bilda p5XCAPD. <ol start="2"><li> Placera hela jordnötter frön i ett enda skikt, så att de täcker botten av en steril bägare. Lägg 75% etanol / vatten (vol / vol) lösning för att täcka fröna och sedan lägga till en lika stor volym av samma lösning. Inkubera vid rumstemperatur under 30 sek och skölj sedan med sterilt avjoniserat vatten (SDW). </li><li> Tillsätt 2% hypoklorit till bägaren innehållande etanolbehandlade fröna enligt följande: tillsätt tillräckligt 2% hypokloritlösning att täcka fröna, lägg sedan till en lika stor volym av samma lösning och inkubera under 5 min. Avgörande steg: Skölj noggrant tre gånger med en volym av SDW motsvarande 5 gånger volymen av hypoklorit används (Figur 3). </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig3.jpg" /> Figur 3. Experimentuppställning. Överst: Surface sterilisering av jordnötter frön före och efter hypoklorit, avlägsnande av fröhöljen (TESTA), USA: avlägsnande av embryot och nära bild av embryo, skär sedan cotyledon i hälften, Botten: halv kotyledoner i sterilt destillerat vatten, läsk på steril absorberande papper, bucklor på vatten agar, och placering av halvhjärtbladen (skurna sidan uppåt) på agarytan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <ol start="4"><li> Låt ytan steriliserade frön att insupa nedsänkt i SDW under 2 timmar. Placera fröna på en steril petriskål, avlägsna fröskalen med pincett, separera kotyledonerna, och med en skalpell avlägsnandet av embryon. Notera:Embryon kan kasseras eller användas för att regenerera nya anläggningar. </li><li> Skär varje cotyledon i hälften med hjälp av en skalpell. För att undvika uttorkning, hålla skurna utsädes bitar i sterilt vatten tills alla frön bearbetas. </li><li> Har förberett Petri-skålar innehållande sterila vattenagar (1,5% agar / vatten; vikt / volym), en för varje tre utsädes bitar. Gör små bucklor i agar med pincett, kort blot överflödigt vatten av utsädes bitar på sterila pappershanddukar, och sedan placera utsädes bitar (snittytan uppåt) på vattnet / agarplattor. </li><li> Från en ny kultur av aflatoxigenic Aspergillus flavus NRRL 3357 i Czapeks agarmedium odlades vid 25 ° C under 10 dagar, förbereda en suspension av 50.000 sporer per il SDW, räknade med en hemocytometer. </li><li> Placera 2 pl av sporsuspensionen på snittytorna hos varje halv cotyledon bit undvika avrinning på sidorna, för att se till att sporerna blir exponerade för den frövävnad som hyser RNAi (Figur 4). </li&gt; </ol><img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig4.jpg" /> Figur 4. Ympning och inkubation för aflatoxinanalys. Top: Half grobladen ympning med sporsuspension, och Aspergillus flavus mycelietillväxt hälften cotyledon efter 24 timmars inkubation Nederst: vänster:. Inkubation av 48 h på 1,5% agar; centrum: inkubation under 72 timmar på 1,5% agar; höger:. Exempel på felaktig experimentuppställning, inkubation under 72 timmar på 0,5% agar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <ol start="9"><li> Inkubera petriskålar innehållande ympade och icke-ympade halv hjärtbladen vid 30 ° C i mörker tills provtagningen. </li></ol> 4. Provtagning för aflatoxinanalys och Gene Expression <ol><li> Samla provertredubbla vid 24, 48 och 72 h (valfritt 96 timme) av inkubation, både för RT-PCR och för aflatoxinanalys varje replikat är en bit (halv kotyledon). Plocka stickprov från olika plattor på varje provtagningsdatum. Med hjälp av en vävnad, mjukt avlägsna agar och överskott svampsporer innan du placerar utsäde bitar i flaskor eller provrör. </li><li> För aflatoxinanalys, placera varje kopia (ett stycke) i en 4 ml glasskruvlock flaska och förvara vid -80 ° C. Obs: Med tanke på den kemiska stabiliteten av aflatoxiner, kan proverna förvaras i detta tillstånd i flera månader (i de aktuella experimenten vanligtvis 1-2 månader). </li><li> För RT-PCR plats varje replikat (ett stycke) i redan förberett 2 ml slipning rör innehållande två kulor av rostfritt stål (2,5 mm diam) och tre zirkonium pärlor (2 mm diam). </li><li> Omedelbart frysa (företrädesvis i flytande kväve) alla prover och hålla dem vid -80 ° C tills bearbetningen. </li></ol> 5. Aflatoxin analys av enskilda Half Cotyledon Bitar <ol><li> Använd A. flavus ympade prover för denna analys. Bring prover till rumstemperatur under ca 30 min, add fyra volymer (vanligen 2-3 ml; vikt / vol) av metanol (föra register för senare beräkningar), stänga locken, och inkubera O / N (~ 16 h) i mörk utan omrörning. </li><li> Placera en fritta i en matchande 1,5 ml propen minikolonn, tillsätt 200 mg grundläggande Al 2 O 3 och råga med en annan fritta som beskrivits tidigare 36; sedan placera en Ultra-High Performance Liquid Chomatographer (UPLC) autosampler flaskan under kolumnen tillräckligt nära för att undvika eventuell avdunstning av eluatet. </li><li> I en engångs provrör av glas (använd inte plast), placera 0,5 ml av metanolextraktet erhållet i steg 4,1, tillsätt 0,5 ml acetonitril, blanda med pipett och applicera 0,5 ml av blandningen i kolonnen framställd i steg 4,2. Låt eluering i autosampler injektionsflaskan genom gravitation (gäller inte trycket). Eluering tar vanligtvis 2-4 minuter, nära the flaskan omedelbart med en UPLC kompatibel mössa med septa. Förvara flaskorna vid rumstemperatur och analysera dem samma dag på en UPLC. </li><li> För separation av aflatoxiner, plats autosampler flaskor som innehåller prov eluat och autosampler flaskor med aflatoxin standarder (B 1 och B 2 vid användning av A. flavus) i en UPLC instrument utrustat med en matchande UPLC Quaternary Solvent Manager UPLC Sample Manager UPLC Fluorescent Detector, och en C 18 2,1 mm x 50 mm, 1,7 | im-kolonn. <ol><li> Använd en isokratisk mobil fas bestående av vatten / MeOH / CH3CN (64:23:13, volym / volym / volym) blandning vid en flödeshastighet av 0,30 ml min -1. Få kromatogram som säkerställer ett stabiliserat baslinjeseparation för exakt beräkning av aflatoxin koncentration, enligt tillverkarens instruktioner 37. </li><li> Bekräfta identiteten hos aflatoxiner genom att få sina mass spektraldata och jämföra dem med publicerade data 38. Använd en ipå fälla masspektrometer utrustad med en ESI-gränssnitt och motsvarande programvara enligt tillverkarens anvisningar. </li></ol></li><li> Bestämma koncentrationer av aflatoxiner med hänvisning till kalibreringskurvor som erhållits genom att injicera olika mängder av motsvarande kommersiella normer för aflatoxiner B 1, B 2, G 1 och G 2 som föreslagits av UPLC tillverkaren och bestäms av programmet 37. </li><li> Placera utsäde bitar redan extraherades med metanol, i enskilda glasflaskor för O / N (~ 16 timmar) lyofilisering för att bestämma deras torrvikt. Sedan beräknar aflatoxin koncentrationen i ng. G -1 torrvikt av utsäde pjäs. </li><li> För analys av data, konvertera aflatoxin resultat log (ng. G -1 1), följt av Tukey test för medel jämförelser. </li></ol> 6. Gene Expression, RT-PCR Behandling av prov <ol><li> Ta 2 ml slip rör innehållering prover från -80 ° C frys, och omedelbart (utan upptining) mala dem i en pärlkvarn homogenisator vid 3100 rpm under 40 sekunder, sedan vidare till RNA extraktion med Trizol enligt tillverkarens anvisningar. </li><li> Framställa cDNA från varje prov med användning en xg RNA och lika stora mängder av oligo-dT och slumpmässiga hexamerer, gör en 1: 8 utspädning av cDNA och använda 2 | il per reaktion i RT-PCR (såsom beskrivits tidigare 39). <ol><li> För detektion av expression av RNAi insats användning primrar: RT_5X_1_105F: 5&#39;GGTGGCATTGGACCGTCTTG-3 &#39;, RT_5X_1_232R: 5&#39;-CGCATCGAGGACAGGTTGTG-3&#39;; och RT_5X_2_95F: 5&#39;-CCATGTTTCTGGTGGCATTG-3 &#39;, RT_5X_2_229R: 5&#39;-ATCGAGGACAGGTTGTGTTG-3&#39;. </li><li> För detektion av expression av den selekterbara markören NPTII, använda primrar: RT_NPTII_1_6871F: 5&#39;-CTCGCTCGATGCGATGTTTC-3 &#39;, RT_NPTII_1_7004R: 5&#39;-GCAGGATCTCCTGTCATCTC-3&#39;. Använd hushållning genen Actin för standardisering, och primers: Actin-Fw: CACATGCCATCCTTCGATTG; Aktin-Rv: CCAAGGCAACATATGCAAGCT 40. </li></ol></li><li> Analysera resultat av Delta-delta C T-metoden 41 standardiserad för aktin uttryck. Representerar resultaten som faldig ökning jämfört med kontrollen. </li></ol>

The authors have nothing to disclose or any conflicts of interest.

Växt-värd RNAi-medierad tysta gener i svamppatogener har demonstrerats 27,43, finns det dock inga publikationer som visar genomförbarheten av RNAi-medierad reglering av mykotoxiner ackumulering i växter. En begränsande faktor för dessa studier i jordnötter var avsaknaden av en metod för att utvärdera en no-aflatoxin ackumulering fenotyp i enskilda anläggningar, som löv visar inga symptom vid svampinfektion i underjordiska skida. Dessutom har inte-normalfördelad ackumulering av aflatoxiner, och behovet av stora prover för kemisk analys 15,16 hindrade kvantifiering av potentiella RNAi effekt på en enda anläggning. Den metod som presenteras här består av 72 timmar experiment med fem frön att utföra tre 24 hr-intervall provtagningar i tre exemplar (tabell 1, figur 7). Jämfört med den typiska aflatoxinanalys som kräver inte mindre än 100 g frön, är vår metod särskilt lämplig för individualiseradel transgena händelser jordnötsplantor som initialt producerar mer än två eller tre baljor. RNA-medierad tysta aflatoxin syntes har visats genom genetiskt omvandla Aspergillus flavus och A. parasiticus. Eftersom aflR är en viktig regulator av aflatoxin produktion A. flavus och A. parasiticus 44,45, blir det en intressant mål för RNA-medierad tysta i växter. Emellertid har genetiska variationer i aflR visats bland Aspergillus arter 46, och de genetiska varianter kunde undkomma tysta om det inte finns någon perfekt sekvens matchning med RNAi-signalen som produceras i växtvärden. Således, aflR var ett av målen för tysta i vektor p5XCAPD, men var inte den enda. Inverterade upprepningar av aflR gen införd i A. flavus och A. parasiticus genom ombildning resulterade i att tysta och minimal eller ingen produktion av aflatoxiner 47 (McDonald et al., 2005b). Också, tysta Afld gen förhindrade aflatoxinproduktionen med upp till 98% i A. flavus och A. parasiticus i direkt transformation 48. För att öka sannolikheten för framgång i vårt system, var jordnöt transformerad med inverterade upprepade fragment av fem gener som är involverade i aflatoxin produktion A. flavus. Här visas att användning av p5XCAPD som riktar sig till tysta flera gener i aflatoxin syntesväg, 90% -100% lägre nivåer av aflatoxin B 1 och B 2 uppnåddes i linje 288-72, och 60-100% lägre nivåer samlats i linjen 288-74 jämfört med kontrollen, när halva kotyledoner inokulerades med A. flavus, figurerna 4, 7. Viktigast denna metod upptäcktes statistiskt signifikanta skillnader i aflatoxin ackumulering av linjerna 288-72, 288-74 kontra kontroll hela experimentet genom att tillämpa parametrisk statistics, figur 7. Med tanke på små provmängder, är det viktigt att framhålla behovet av att använda en kraftfull metod för att upptäcka aflatoxiner, var dessa experiment analyserats UPLC som har en hög upplösning, fem gånger högre prestanda och tre gånger högre känslighet än HPLC 49. Expression av RNAi insatsen i 288-74 endast påvisas i omogna hjärtbladen (gul) vid 24 h inkubation. RNAi insatsen inte upptäcks av RT-PCR på mogna kotyledoner av 288-74 vid 24 timmar, eller på eventuell löptidsgrupp på 48 timmar, figur 6. Samma fenomen observerades i andra RNAi transgena jordnötter linjer (Arias, RS, 2015 opublicerad), där vanligtvis RNAi transkript endast detekterades på omogna hjärtbladen på 24 timmar. RNA-prov behandlades med DNAs före cDNA-syntes, data som normaliserades till den nivå av aktin-expression och inget bevis på DNA-förorening observerades. Skulle DNA har funnits i proven, bör dethar upptäckts i de 48 hr proverna också, men genomgående så var inte fallet. Expression under kontroll av 35S-promotorn är inte alltid enhetlig; Det kan påverkas av miljöförhållanden 50, typ av vävnad och utvecklingsstadiet 51,52. Samtidigt, i vägen för RNA-interferens kan hastigheten av mRNA förfall och hastigheten för siRNA förfall variera signifikant 53. Det är möjligt att den snabba nedbrytningen av mRNA genom mekanismen för RNA-interferens kunde ha förhindrat mRNA detektion vid 48 h inkubation. Huruvida avsaknad av uttryck vid 48 timmar var på grund av låga 35S-promotorn driven transkription, eller snabb nedbrytning av dsRNA av Dicer återstår att besvara. Således skulle detektering av små RNA från hög genomströmning sekvensering ger en bättre insikt om de processer som äger rum genom RNAi 54 i dessa experiment. Eftersom RNA tysta sprider system, främst genom floemet från photosynthatar källor till sackaros sänkor (i detta fall jordnötter frön) 55, den tysta aflatoxin-syntes kan förekomma i frön utan lokal uttryck av RNAi insatsen. Mycket forskning återstår att göra för att fastställa tröskelvärdet för små störande RNA (siRNA) är nödvändiga för att förhindra aflatoxin ackumulering i frön. Det är viktigt att understryka det faktum att båda mRNA uttryck av RNAi konstruktionen (Figur 6), och ackumulering av aflatoxiner B 1 och B 2 (Figur 7) visade olika resultat för omogna (gul) vs. mogna (brun) kotyledoner. Jordnötsplantor har obestämd tillväxt, det vill säga, presenterar de vid skörd en rad löptider skida, figur 2. Dessutom frön från olika löptid grupper skiljer sig åt i deras kemiska sammansättning, till exempel., 2,4% sackaros i omogna frön, och 1,9% i mogna frön under samma fältförhållanden 56,57. Således, för att förstå den verkliga effektiviteten såy av RNA-medierad kontroll av aflatoxin ackumulering, är det viktigt att analysera löptidsgrupper separat. En naturlig försvar av jordnötter frön är produktionen av fytoalexiner, som varierar i olika föreningar som produceras och deras relativa mängder beroende på löptid frön och miljöförhållanden 58-61, och det är särskilt hög i embryon jämfört med hjärtbladen 62. Embryon har också signifikant högre koncentrationer av nukleinsyror, både DNA och RNA än hjärtbladen (Arias RS, opublicerad). Som jordnötter frön mogna, förändringar i fysiologi och kemiska sammansättning förekommer 63. Fenolantioxidanter i jordnöts testa bildar kondenserade tanniner med fungistatisk aktivitet 64; Detta är också tydligt i mesocarp färg som speglar mognadsstadier, gult till svart 35, som dess innehåll av tanniner och fenolföreningar ökar med förfall 65. Sålunda närvaro av testa eller embryon i experimentet, med tanke på deras antimikrobiella egenskaper, kunde ha begränsat svamptillväxt och därför överskattat effekten av RNAi tysta, därför var de bort. Även avlägsnande av testa och embryon hjälper begränsa källorna till variation i analysen, eftersom den halva cotyledon som bär embryot kommer att ha fler fytoalexiner och mer RNA innehåll. Utöver analysen av löptidsgrupper och avlägsnande av testa och embryo i dessa experiment, är det viktigt att påpeka några fler observationer: a) om resultaten visas för upp till 96 timmars inkubation, rekommenderas att inte använda mer än 72 hr att få konsekventa resultat, eftersom frön får försämras med 96 h; och b) medan hälften kotyledoner från samma frö, men slumpmässiga prov, inte utgör helt oberoende prover, RT-PCR och aflatoxin ackumulering inom transgena händelser visade minsta variation mellan frön. Även en noggrann svampspor räkna, inokulat volyms 2 pl och tillämpning av sporer på snittytan av hjärtbladen undvika droppande på sidorna är viktigt att se till de grodda sporerna utsätts för växtvävnaden. Vatten / agar på plattorna bör vara 1,5% (w / v), orsakar mjukare agar avrinningen av sporer som visas på den sista bildrutan i fig 4 (botten). Bör utsäde tillgänglighet från en viss transgen händelse begränsas, kan provtagningen göras i två exemplar i stället för trippel få liknande resultat (dvs figur 7); kommer emellertid triplikatprover bidra till att minska medelfelet. Den enda begränsningen av denna metod är att den kräver ett mycket känsligt system (UPLC) för aflatoxin detektion / kvantifiering, men samtidigt det minskar sannolikheten för att överskatta effekten av RNAi bör aflatoxiner inte upptäckas av mindre känsliga metoder. Sammanfattningsvis erbjuder denna metod för första gången en tillförlitlig metod för att studeraeffekten av RNAi i kontrollen av aflatoxiner. Minska tiden för ett experiment från en hel odlingssäsong till mindre än en vecka, kommer denna metod oerhört påskynda forskningen om RNAi-jordnöt / Aspergillus pathosystem mot begränsning och / eller eliminering av aflatoxiner.

Ungefär 4,5 miljarder människor är kroniskt utsätts för aflatoxiner 1, den mest kraftfulla cancerframkallande kända i naturen 2. Dessa mykotoxiner förorena 25% av livsmedelsgrödor i världen 3, inklusive majs, kassava, ris, nötter, spannmål och kryddor. 4. Aflatoxiner orsaka dvärgväxt hos barn 5, försämra immunförsvaret 6, finns i 58% av hepatocellulära-karcinom i mänskliga biopsier 7,8, och döda hundratals människor under periodiska utbrotten av aflatoxicosis 9,10. Aflatoxiner är polyketid härledda mykotoxiner normalt produceras av Aspergillus flavus och A. parasiticus; aflatoxiner B 1 och B 2 produceras av A. flavus, medan A. parasiticus producerar också G 1 och G 2. Den kemiska strukturen hos dessa föreningar och ett kromatogram som visar deras separation genom UPLC visas i figur 1. </strong&gt; <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> Figur 1. Aflatoxiner och RNAi infoga Top. Kemiska struktur (till vänster) och exempel på kromatogrammet (höger) av de fyra vanligaste polyketid härrörande aflatoxiner: B 1, B 2, G 1 och G 2, som framställts av Aspergillus parasiticus, A . flavus producerar B 1 och B 2 Nederst: Schematisk bild av genfragment i RNAi konstruera p5XCAPD används för jordnöt transformation, siffror enligt pilar är gen-fragment anslutningsnummer i Aspergillus flavus genomet;. PIV2: potatis intron; bp: baspar; RT_5X_1 och RT_5X_2. Realtids-PCR primerställena <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Ekonomiska förluster i exporten på grund av aflatoxiner i jordnötter enbart överstiger $ 450 miljoner US-dollar om beräknas baserat på 4 ng. G -1 gränsen för aflatoxin tillåtas för livsmedel i EU 11. Aflatoxiner har varit känt i 60 år 12; Men, även om många jordbruksmetoder har utvecklats för att lindra deras effekt, inklusive tillämpning av andra svampstammar 13,14, finns ingen konsekvent metod för kontroll och resistenta växtsorter är inte tillgängliga. Testning växt arvsmassa för resistens mot aflatoxiner är särskilt svårt, eftersom även under gynnsamma förhållanden för patogen invasion, är oförutsägbar mykotoxiner ackumulering och inte följer en normalfördelning. Således, experiment kräver oftast stora planteringsområden, hundratals frön och flera prover av 100-1,700 g för att minska variationen i data 15,16. RNA-interferens varupptäcktes 1998 17; och fördelarna med &quot;tysta&quot; är för närvarande undersöks i ett antal nya applikationer, t ex. i mänskliga terapier mot metastaserande bröstcancer 18, levercancer 19, myeloid leukemi 20, och växtskydd mot insekter 21 och nematoder 22. I växter, kan RNA-interferens signaler cell till cell, med små störande RNA (siRNA) och hög molekylvikt RNA är ansvarig för system posttranskriptionell genen tysta 23,24, även inne svamp patogener som är i nära kontakt med växtvärd 25. Effekten av RNAi på växt-medierad tysta svamp-patogen gener har beskrivits i några växt pathosystems, för dessa, visuell undersökning av symptom i antenn delar av växter (blad) får sjukdomen kvantifiering, dvs Algsvampar Bremia i sallat 26 , Puccinia i vete <sup&gt; 27 och Fusarium i banan 28. Mycket svårare är att utvärdera RNAi effektivitet för att kontrollera mykotoxiner i växter, särskilt aflatoxiner i jordnötter som bladen visar några symtom på infektion, organ invaderade (frön) är under flera inches av jord, är oförutsägbar, och endast kemiska förekomsten av infektion analys kan fastställa förekomsten av aflatoxiner. Dessutom har varje transgen händelse i jordnöts producerar normalt några frön (4-6 per anläggning); därför inte är möjligt traditionell testning för en no-aflatoxin ackumulering drag i stora fält tomter, som varar hela odlingssäsonger, och med hjälp av hundratals frön. En metod beskrivs här för att analysera mindre än en vecka, RNAi jordnötter frön för förekomst av transgen och för en no-aflatoxin ackumulering drag, med enbart några frön.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:256px;">Primers, oligonucleotides</td>
			<td style="width:127px;">DNA Technologies, Coralville, IA, USA</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Dneasy Plant Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">69106</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:256px;">Czapek Dox agar medium</td>
			<td style="width:127px;">Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">CM0095</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Agar</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">BP 1423</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Freezer -80&#176;C</td>
			<td style="width:127px;">n/a</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Aluminum Oxide, Al2O3</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A941</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">SPE Reservoirs 1.5 mL</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">210011</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Frits for 1.5 mL SPE reservoir</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">211401</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;">186005221</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="150">
			<td height="150" style="height:150px;width:256px;">Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:256px;">Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">A6636; A9887; A0138; A0263</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Systat Software 12.2</td>
			<td style="width:127px;">SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">15596-018</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11752-050</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:256px;">ABI 7500 Real-Time PCR</td>
			<td style="width:127px;">Lifetechnologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:123px;">4406984</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Luria Broth-Miller</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">R453642</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">pENTR1A</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">A10462</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11791-020</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB Biolabs</td>
			<td style="width:123px;">M0202L</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Gelrite</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">G1919</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">D134406</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:256px;">QIAcube robot workstation</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">9001292</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:256px;">Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Goldbio, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11304-029</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem

Livsmedels- och jordbruksorganisation FN uppskattar att 25% av livsmedelsgrödor i världen är kontaminerade med aflatoxiner. Det motsvarar 100 miljoner ton livsmedel förstörs eller omdirigeras till icke-livsmedel varje år. Aflatoxiner är kraftfulla cancerframkallande normalt ackumulerade av svampen Aspergillus flavus och A. parasiticus för spannmål, nötter, rotfrukter och andra jordbruksprodukter. Tysta fem aflatoxin-syntes gener genom RNA-interferens (RNAi) i jordnötsplantor användes för att styra aflatoxin ackumulering efter ympning med A. flavus. Tidigare fanns ingen metod för att analysera effekten av RNAi i enskilda jordnötssmör transgena händelser, eftersom de vanligtvis producerar några frön och traditionella metoder för stora fältförsök i aflatoxin-främjar villkor inte ett alternativ. På fältet är sannolikheten att finna naturligt förorenade frön ofta 1/100 till 1/1,000. Dessutom är halten aflatoxiner inte jämnt fördelade. Vår metod använder några frön per transgen event, med små bitar som behandlats för realtids-PCR (RT-PCR) eller små RNA-sekvensering, och för analys av aflatoxin ackumulering av ultra-vätskekromatografi (UPLC). RNAi-uttryck jordnöt linjer 288-72 och 288-74, visade upp till 100% reduktion (p≤0.01) i aflatoxin B 1 och B 2 jämfört med kontrollen som samlats upp till 14.000 ng. G -1 av aflatoxin B 1 när inokulerades med aflatoxigenic A. flavus. Som referens, är den maximala summan av aflatoxiner tillåtna för mänsklig konsumtion i USA 20 ng. G -1. Detta protokoll beskriver tillämpningen av RNAi-medierad kontroll av aflatoxiner i transgena jordnötssmör frön och metoder för utvärdering. Vi anser att dess tillämpning i avel av jordnötter och andra grödor kommer att ge snabba framsteg inom detta viktiga område av vetenskap, Medicin och människoföda, och kommer att bidra avsevärt till de internationella insatserna för att kontrollera aflatoxiner, och eventuellt andra mykotoxiner i viktiga livsmedelsgrödor.

Plasmid p5XCAPD gjordes som ett derivat av pCAPD 29, och använde den för att transformera jordnötsplantor; denna vektor bär inverterade upprepningar av fem små fragment, 70-80 bp vardera, av aflatoxin-syntesgener A. flavus separerade av en intron (Figur 1). Fragment av AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07223 (AFLs eller aflJ), AFL2G_05027 (aflatoxin effluxpump, aflep), AFL2G_07228 (AFLC / pksA / pksL1), och AFL2G_07731 (pES1) användes för konstruktionen, nummer på figur 1 motsvara ett . flavus genom anteckning i Broad Institute, Cambridge, MA, och litteraturen 42. Totalt 99 jordnöt linjer regenererades efter att ha gått igenom omvandlingsprocessen, 50 var PCR-positiva för NPTII detekteras av STN-PCR, och 33 linjer var PCR positiva och producerat utsäde. Endast sju PCR positiva linjer klonalt förökade och testas av preT-metoden för aflatoxin ackumulering, alla sju visade mellan 60% och 100% mindre aflatoxin ackumulering än kontrollen. Här visar vi resultaten av två av dessa sju linjer. Som enskilda transgena händelser ger vanligen några frön, utvecklades en metod att använda ett minimum antal frön samtidigt ska kunna göra parametrisk statistisk analys. Ett flödesschema av provberedning och experimentuppställningen visas i fig 5 och tabell 1. Även om den första generationen av transgena frön är typiskt hemizygot, förväntas det att den cell-till-cell och systemisk rörelse av små störande RNA (siRNA) som alstras genom RNA-interferens bör ge aflatoxin-syntes tysta hela anläggningen. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> Figur 5. Schematisk flödesschema över metoden för att analysera effekten av RNAi i tysta </strong&gt; Aspergillus aflatoxin-syntes gener i jordnötter frön. Grafisk representation av arbetsflödet vid behandling av jordnötter prover för genuttryck eller aflatoxinanalys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> RNAi jordnötslinjer 288-72 och 288-74 visade närvaro av NPTII valbara aren när de testas med STN-PCR, är gel sektioner visas i figur 6 (överst), original bilder finns från författarna på begäran. Plasmid pCAPD användes inte som en kontroll av förvandling sedan den kodar inverterade upprepningar av två gener CMR (kloramfenikolresistens) och CCDB (toxin) av okänd påverkan på växter. PCR negativa jordnötslinjen 288-9 och andra som gick igenom regenereringsprocessen och odlas i samma villkor som RNAi linjer, användes som negativ conkontroll. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> . Figur 6. Upptäckt av transgena och Real Time uttryck av RNAi insats Top: Single-rör, kapslade PCR-detektion av transgena jordnöt linjer RNAi-288-72 och RNAi-288-74, positiva växter. Kontroller: W (vatten), PP (positiv växt), MM (master mix), p (plasmid p5XCAPD); fraktioner 1/2 04/01 08/01 16/01 representerar 2-faldiga utspädningar av DNA Nederst:. realtids-PCR detektion av uttryck av RNAi infoga (primeruppsättningar: RT_5X_1, RT_5X_2, som i figur 1, på omogna ( gul) och mogna (brun) kotyledoner av transgena linjer vid 24 och 48 h inkubation, grå linje: C T = 1. Histogram representerar medel och barer standard fel (T) av tre biologiska provermed tre tekniska replikat. Den relativa kvantifieringen av RNAi insats normaliserades med avseende på hushållning genen Actin som en intern kontroll och jämförande veck uttryck av transgenen beräknades såsom beskrivits i 5.2.2 och 5.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> För att testa effektiviteten av växtvärd RNAi-medierad potentiell kontroll av aflatoxin ackumulering ades nyskördade konidier av Aspergillus flavus NRRL 3357 tillämpas på snittytan av halv kotyledoner från vilka embryon och testa hade tagits bort (fig 3, 4). A. flavus NRRL 3357, där genomet har sekvenserats och låg till grund för att utforma p5XCAPD, tillhandahölls vänligen av Dr. Horn på USDA-ARS-NPRL. Den erhållna svamp invasion av halv kotyledon efter 24, 48 och 72 h vid 30 ° C är show<html> n i figur 4. Prover av ympade halv kotyledoner uppsamlades vid 24, 48, 72, 96 h av inkubation, och analyserades för huvud fyra aflatoxiner B 1, B 2, G 1 och G 2 med användning UPLC och bekräftades genom LC-MS ; Resultaten visas i figur 6. Aflatoxin Koncentrationer bestämdes med användning av en publicerad metod med modifieringar 36. Vid 96 h inkubering, hjärtbladen börjar att sönderdelas på grund av svampinfektionen. RNAi linjen 288-72 uppvisade betydligt lägre halter av aflatoxiner än kontrollen vid alla provtagnings datum på omogna hjärtbladen och på de flesta provtagningstillfällena får i de mogna dem. RNAi linjen 288-74 uppvisade signifikant lägre nivåer av aflatoxiner på de flesta provtagningsdatum. Nivåer av betydelsen av Tukey test indikeras med asterisker i den grafiska i figur 7. <html> g7.jpg &quot;/&gt; . Figur 7. Aflatoxin B 1 och B 2 i halv jordnöts kotyledoner efter inkubation (24, 48, 72 och 96 timmar) med Aspergillus flavus Kontroll: frön av 288-9 icke-transgen linje; RNAi: frön från RNAi-288-72 och RNAi-288-74, transgena för RNAi p5XCAPD att tysta fem aflatoxin-syntesgener. (A) Aflatoxin B 1 i mogna frön (brun); (B) Aflatoxin B 2 mogna frön; (C) Aflatoxin B 1 i omogna frön (gul) och (D) Aflatoxin B 2 i omogna frön. Medelvärden med de motsvarande standard felstaplar (T) av dubbla biologiska sampel representeras. Statistiskt signifikanta skillnader Tukeys test *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001.s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. Sammantaget RNAi-288-72 visade under hela experimentet (24 till 96 timmars inkubering), en 94% -100% minskning av aflatoxin B 2, och en 90% -100% minskning av aflatoxin B 1 jämfört med kontrollen. RNAi-288-74 visade en 63% -100% minskning av aflatoxin B 2 och 60% -100% minskning av aflatoxin B 1, figur 7. Primers som används för realtids-PCR detektion av uttryck av RNAi insatsen visas i figur 1. Peanut-utsäde hjärtbladen analyserades utan embryon, att ta bort deras naturliga försvar och kunna upptäcka potentiella effekten av RNAi på områdes mest utsatt för svamp invasion, hjärtbladen. Expression av RNAi insatsen påvisas i omogna hjärtbladen (gul) linje 288-74 genom primer set RT_5X_1 var fyra gånger över C T </sub&gt; = 1 tröskeln till den negativa kontrollen, och genom primeruppsättning RT_5X_2 var 19 gånger högre än tröskelvärdet, allt på 24 timmars inkubering. Minst tre av fem på varandra följande genfragment som används i jordnöts omvandling, 5027, 7223 och 7228 (aflep, AFLs / aflJ och AFLC / pksA, respektive) detekterades genom RT-PCR (Figur 1, 6). Uttryck av RNAi insats upptäcktes inte i mogna kotyledoner på 24 timmar, eller på mogna eller omogna hjärtblad vid 48 timmars inkubation, figur 6 (botten). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> Jordnöt Linje </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Tidpunkt för provtagning </td><td colspan="3" style="width:192px;"> Prover för RT-PCR </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> Prover för aflatoxinanalys (ympade) </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Numbra av frön </td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> (icke ympade) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td><td style="width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> RNAi (gul) </td><td style="width:64px;"> 24 tim </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4,5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdstyle = &quot;width: 64px;&quot;&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Kontrollera </td><td style="width:64px;"> 24 tim </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4,5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> (gul) </td><td style="width:64px;"> 48 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Exempel på små prov setup för att analysera genuttryck och aflatoxin ackumulering i RNAi jordnötter frön. Komplett analys av uttryck och aflatoxiner för en löptid gruppen (ie., Gul), med tre provtagningstider (24, 48 och 72 h) i tre exemplar, skulle kräva 4,5 frön, varje nummer ett i tabellen utgör hälften kotyledon.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem at JoVE.c

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Vi visar en metod för analys av aflatoxiner och transgenexpression i jordnötter frön som innehåller RNA-interferens signaler för att tysta aflatoxin-syntesgener i svampen Aspergillus flavus. RNAi-medierad kontroll av mykotoxiner i växter har inte tidigare rapporterats.

RNAi-medierad kontroll av aflatoxiner i Peanut: metod för att analysera mykotoxinbildning produktion och transgenexpression i jordnötter /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Research

JoVE Journal

Environment

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimera Rökgas inställningar för att främja Mikroalger Tillväxten i Photobioreactors via datorsimuleringar

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Transient genuttryck i Tobaks använder Gibson församling och Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Utvinning och analys av mikrobiell Phospholipid fettsyror i jordar

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

En invikta Thermogradient tabell att kontrollera Jord Temperaturer för att utvärdera Växternas tillväxt och övervakning mark

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

Produktion och mätning av organiska partiklar i Harvard miljömässiga kammaren

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Förfaranden av laboratoriet gasning för skadedjursbekämpning med kväveoxid Gas

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Den växt infektion testet: Spray och sår-medierad inympning med den växt patogen Magnaporthe länkar

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Bedömning av partiklar borttagning kapaciteterna av träd lämnar

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Visualizing Efficacy of Pesticides Against Disease Vector Mosquitoes in the Field

Visualisera effekten av bekämpningsmedel mot sjukdom vektor mygg i fältet

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Sammansättning och Distribution analys av bioaerosoler Under olika miljöförhållanden

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...