Name: porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells
Uploaded: 2015-12-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells at JoVE.com

We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

De volgende protocollen werkwijzen voor het kweken en bestuderen van de invasie door anaërobe species, blz beschrijven gingivalis; evenwel deze protocollen worden gebruikt voor een aantal anaerobe pathogenen. Hoewel HUVECs gebruikt, kan dit protocol worden gebruikt voor andere eukaryote cellen zowel immune als niet-immune. 1. Anaërobe Chamber gebruik en onderhoud Opmerking: P. gingivalis is een anaerobe gevoelig voor normale niveaus van...

Alle bovengenoemde werkwijzen kunnen worden gebruikt om specifieke assays voor de interactie van anaërobe bacteriën met eukaryotische cellen te beoordelen ontwerpen. Echter, er zijn verschillende overwegingen bij de experimenten te doen dalen. Ten eerste zijn de microbiële stammen worden gebruikt in een studie. Het is cruciaal bij de vergelijking van twee stammen zowel het overleven assay en microscopisch onderzoek dat ze op vergelijkbare groeifasen en bereiken soortgelijke celconcentrati...

Anaërobe bacteriën koloniseren vrijwel alle oppervlakken van het menselijk lichaam. Hoewel overwegend in de flora van de darm en urogenitalis waar zuurstof concentraties laag bestaan ​​ze ook bij hoge niveaus op de huid, mond, neus en keel 1. Anaërobe bacteriën zijn een veelvoorkomende oorzaak van endogene infecties en worden vaak geïsoleerd van zieke sites. Vanwege hun veeleisende aard, anaërobe moeilijk te isoleren en cultuur. Studies met anaërobe bacteriën moet gebeuren onder strikte voorwaarden. Moderne anaërobe kweektechnieken kunnen de onderzoekers om de anaërobe instellingen die nodig zijn om veel anaërobe laboratoriumstammen of klinische isolaten 2,3 studeren na te bootsen. Pathogene anaërobe bacteriën hebben een dynamische relatie en co-evolutie met de gastheer cellen waarin zij wonen ontwikkeld. De meeste anaëroben zijn gevoelig voor doding door de gastheer immuunreactie voordat infectilende niveaus. Echter, sommige pathogene bacteriën mechanismen ontsnappen of ontwrichting van de gastheer immuunreactie ontwikkeld. Zij doen dit doel via mechanismen zoals ontwijking van immuunherkenning, neutralisatie van immuunmediatoren, verandering van celgemedieerde immuniteit, invasie van gastheercellen en wijziging van immune signalering 4. Porphyromonas gingivalis, een Gram-negatieve anaerobe betrokken bij zowel orale als extraorale ziekten, is een voorbeeld van een zeer geschikt bacterieel pathogeen kunnen veroorzaken pathogene veranderingen in de ontvangende 5-7. Zakken van biofilm plaque ontstaan ​​uit diepe spleten gevormd tussen de tanden en tandvlees mucosale weefsel anaërobe bacteriën die worden beschermd tegen zuurstof 8 haven. Deze periodontale pockets dienen als niche voor diverse anaerobe pathogenen, zoals P. gingivalis 9. P. gingivalis is een hoeksteen pathogeen dat in staat verbouwening de mondelinge microbiële gemeenschap op manieren die de ontwikkeling en progressie van parodontale aandoeningen 10 te bevorderen. Het produceert een groot aantal virulentiefactoren die actief zijn tegen een breed spectrum van gastheer- en voorziet in mechanismen voor ontwijking van afweer 11. Het kan ook invasie epitheel, endotheel, fibroblasten, en periodontale ligament cellen in vitro en in vivo 14/12 15. Door het effectief invasie van gastheercellen, P. gingivalis kunnen gastheer immuniteit te ontsnappen. Effectieve invasie van gastheercellen mogelijk maakt niet alleen de bacterie afweer van de gastheer ontsnappen, maar ook dient als reservoir voor toekomstige herinfectie en verandert de gastheercel. Studies van de moleculaire mechanismen betrokken bij adhesie en internalisatie van de bacterie door gastheercellen nodig. Onderzoek in verschillende laboratoria is gericht op het begrijpen van de moleculaire geassocieerd met internalisatie P. gingivalis door de gastheercellenalsook de mechanismen te onderdrukken en kapen de immuunrespons en overleven de vijandige gastheer afweermechanismen. Er zijn vele assays kan identificeren en karakteriseren van pathogenen die in staat binnendringende gastheercellen. In vitro studies met anaerobe pathogenen vormen vele experimentele problemen voor de onderzoeker vooral omdat het moeilijk studies die afhankelijk volumineuze instrumenten in afwezigheid van zuurstof uitgevoerd. Dit wordt verergerd door het feit dat eukaryote cellen zuurstof nodig om te groeien en moet dus apart worden bereid in weefselkweek incubator. Een manier om dergelijke obstakels te vermijden is om het onderzoek te verrichten onder atmosferische zuurstof, maar dat de groei van anaerobe bacteriën onmogelijk maken. Een andere methode zou zijn om hitte gedode bacteriën gebruiken om te infecteren en studie gastheer-cel interacties. Echter, verschillen bestaan ​​tussen de warmte gedood en levensvatbare bacteriën die de relevantie van de gastheer-pathogeen interacti verminderenon 16. Het staat centraal in levende bacteriën met ongewijzigde expressie interactie met gastheercellen te bestuderen; derhalve werkwijzen voor het kweken van P. gingivalis in een anaërobe omgeving worden gegeven. Ook zijn twee eenvoudige rendabele protocollen aangetoond voor het beoordelen van het vermogen van P. gingivalis worden geïnternaliseerd door humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC). Het eerste protocol is gebaseerd op het populaire antibioticum bescherming assay. Hoewel de test eenvoudig worden overwegingen bij het gebruik van anaerobe microorganismen gegeven. Het tweede protocol vereist het gebruik van een fluorescerende scanning microscoop te visualiseren interactie en geïnternaliseerd P. gingivalis. Elke test heeft zijn beperkingen en voordelen die zullen worden besproken zijn de onderzoeker een schets voor het bestuderen van het invasieve karakter van anaërobe bacteriën. Hoewel de huidige manuscript bestudeert P. gingivalis en HUVECs, kunnen deze protocollen worden gebruikt voor vele andere anaërobe bacteriën enzoals voor andere typen gastheercellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber-Type B</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Model 2000 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td>221261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>FC-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypKit</td>
			<td>LifeLine</td>
			<td>LL-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>16109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCECF-AM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>B1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circular Coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72222-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells

Anaërobe bacteriën ver overtreffen aeroben in vele menselijke niches zoals de darm, mond en vagina. Bovendien, anaërobe infecties komen vaak voor en vaak van inheemse afkomst. Het vermogen van enkele anaerobe pathogenen humane cellen binnen te dringen geeft hen aanpassingsmaatregelen aangeboren immuniteit ontsnappen alsook gastheercel gedrag moduleren. Echter, zodat de anaërobe bacteriën staan ​​tijdens experimenteel onderzoek van de gebeurtenissen kan problemen opleveren. Porphyromonas gingivalis, een Gram-negatieve anaërobe, kan binnenvallen een verscheidenheid van eukaryote niet-fagocytische cellen. Dit artikel schetst hoe succesvol de cultuur en beoordelen van het vermogen van P. gingivalis aan humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) binnendringen. Twee protocollen werden ontwikkeld: een voor bacteriën die met succes kunnen binnendringen en overleven in de gastheer, en andere bacteriën interactie met gastheercellen visualiseren meten. Deze technieken vereisen het gebruik van een AnaeRobic kamer leveren P. gingivalis met een anaërobe omgeving voor optimale groei. Het eerste protocol is gebaseerd op het antibioticum bescherming assay, die grotendeels gebruikt om de invasie van gastheercellen door bacteriën te bestuderen. Echter, het antibioticum bescherming assay beperkt; alleen intracellulaire bacteriën die gekweekt zijn na behandeling met antibiotica en gastheer cellysis worden gemeten. Om alle bacteriën interactie met gastheercellen, zowel levende en dode beoordelen, ontwikkelden we een protocol dat fluorescentie microscopie gebruikt om gastheer-pathogeen interactie te onderzoeken. Bacteriën worden fluorescent gelabeld met 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -carboxyfluorescein acetoxymethylester (BCECF-AM) en gebruikt om eukaryotische cellen te infecteren onder anaërobe omstandigheden. Na bevestiging met paraformaldehyde en permeabilisatie met 0,2% Triton X-100, worden gastheercellen gelabeld met TRITC phalloidin en DAPI naar de cel cytoskelet en de kern respectievelijk labelen. Meerdere images genomen op verschillende brandpunten (Z-stack) worden verkregen voor tijdelijke ruimtelijke visualisatie van bacteriën. Methoden in deze studie kan worden toegepast op elke landbouwgrond anaerobe en eukaryotische celtype.

Protocollen hierboven beschreven werden toegepast in de studie van gastheer-pathogeen interactie tussen P. gingivalis en endotheelcellen. P. gingivalis W83 en P. gingivalis V3150 die een deletie van PG0228 werden gebruikt in de studie. De PG0228 is voorspeld een eiwit dat de niveaus van RNA en eiwitten kunnen veranderen, die uiteindelijk kunnen beïnvloeden interactie van P. coderen gingivalis met gastheercellen. Om het effect van PG0228 op P. onderzoeken gingiva...

Watch this Scientific Journal Video about Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells at JoVE.com

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis als modelorganisme voor het beoordelen van Interactie van anaërobe bacteriën met gastheercellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Gebruik van de EpiAirway Model voor het karakteriseren van op lange termijn gastheer-pathogeen interacties

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Gebruik van Afbeelding Cytometry voor kwantificering van pathogene schimmels in associatie met gastheercellen

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Gebruik<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als modelorganisme om te studeren<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infectie

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; Candida albicans</em&gt; En<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In het Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Biomimetische materialen Bacteria-gastheer interacties karakteriseren

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

Experimentele infectie met<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als een model voor de studie Host Interferon-γ Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Een muizenmodel van groep B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginale Kolonisatie

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...