Name: ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Den præsenteres i denne artikel metode opstod fra arbejde finansieret af BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) og en MRC ph.d. studentship (MH).

Bemærk: Alle forsøg blev udført med henhold til Kings College London, UK og dyrs pleje retningslinjer det britiske indenrigsministerium. 1. Dissektion af E14 Cerebellum <ol><li> Inkuber brune befrugtede hønseæg ved 38 ° C til embryonale Dag 14. </li><li> Brug af æg saks halshugge chick embryo in ovo og fjern hovedet på en petriskål indeholdende iskold PBS (figur 1A). </li><li> Anvendelse af standard pincet, gør indsnit bag hvert øje hele vejen gennem v?...

Protokollen rapporteret her beskriver en metode til at dissekere, elektroporering og dyrkning skiver af embryonale Dag 14 lillehjernen fra chick. Denne protokol muliggør målretning af elektroporation til små fokale områder af EGL, herunder isolerede målretning af individuelle cerebellare lapper. Det gør det muligt genetisk analyse og billeddannelse med en høj opløsning og bekvemmelighed til en lav pris sammenlignet med etablerede teknikker i gnavere 43-47. Sådanne analyser er i øjeblikket ikke mulig...

Lillehjernen sidder ved den forreste ende af baghjerne og er ansvarlig for integration af sensoriske og motoriske forarbejdning i den modne hjerne samt regulering højere kognitive processer 1. Hos pattedyr og fugle, det er i besiddelse af en omfattende morfologi og er stærkt folieret, et produkt af omfattende transit opformering af stamceller under udviklingen, der producerer over halvdelen af ​​de neuroner i den voksne hjerne. Lillehjernen har været genstand for undersøgelse for neurobiologer i århundreder, og i den molekylære æra har ligeledes fået betydelig opmærksomhed. Dette vedrører ikke kun dens iboende interessant biologi, men også det faktum, at det er stærkt impliceret i human sygdom, herunder udviklingsmæssige genetiske sygdomme, såsom autisme spektrum forstyrrelser 2 og mest fremtrædende i cerebellar cancer, medulloblastom 3, som er den mest udbredte pædiatriske hjernen svulst. Vigtigt er det, det er en fremragende model system i WHich at studere skæbnen allokering og neurogenese under hjernens udvikling 4. I de senere år er det også blevet etableret som et modelsystem for sammenlignende undersøgelse af hjernens udvikling, på grund af den enorme mangfoldighed af cerebellare former ses på tværs af hvirveldyr fylogeni 5-10. Lillehjernen udvikler sig fra den dorsale halvdel af rhombomere 1 i baghjerne 11 og udviklingsmæssigt består af to primære progenitorpopulationer, at rhombisk læbe og den ventrikulære zone. Den rhombisk læbe strækker sig rundt om dorsale region af neuroepithelium af baghjerne ved grænsen med taget pladen. Det er fødestedet for de glutamaterge excitatoriske neuroner i cerebellum 12-14. Den ventrikulære zone giver anledning til hæmmende GABAerge cerebellare neuroner, mest fremtrædende de store Purkinje neuroner 14,15. Senere i udvikling (fra omkring embryonale dag 13.5 i mus, e6 i chick 16), glutamaterg Progenkondensatorerne migrere tangentielt fra rombisk læbe og danner et pial lag af forfædre: en sekundær stamfader zone kaldes det ydre granulat lag (EGL). Det er dette lag, der gennemgår den omfattende transit forstærkning, der fører til det store antal granula neuroner findes i den modne hjerne. Proliferation i EGL har længe været forbundet med sub-pial beliggenhed, at resultaterne fra tangential overgang fra rhombiske læbe 17, med kontakten til cellecyklus exit og neuronal differentiering af progenitorer er forbundet med deres udgang fra det ydre EGL laget i midten EGL 18. Omfattende tangential migration af post-mitotiske celler i granuleceller medial-laterale akse forekommer i mellemøret og det indre EGL 19, før den endelige radial migration ind i det indre granulat lag af det modne cerebellare cortex. Migration af celler fra rhombisk Lip over cerebellar overflade er afhængig CXCL12 signalering fra pia 20-22 </sup&gt; Og granulerede celler udtrykker CXCL12 receptor CXCR4. Deres tangential migration er således minder om den, neocorticale tangentielt migrere hæmmende interneuron befolkninger 23-25. Interessant, elektron mikroskopiske undersøgelser 17 har antydet, at EGL celler med en proliferativ morfologi opretholde pial kontakt, der forbinder celle adfærd med proliferativ kapacitet på en måde, der minder om de basale stamfædre af pattedyrs cortex 26. Dette afspejles i den førnævnte lagdeling af EGL i tre underlag, der er defineret ved distinkte ekstracellulære miljøer og hvor granula-forstadier har forskellige genekspression signaturer 18. Proliferation af progenitorer i oEGL forekommer med en normal fordeling af klon størrelser således, at når stamfædre er individuelt genetisk mærket ved udgangen af ​​fosterudviklingen i musen, de giver anledning til en median gennemsnit på 250-500 g postmitotiskeranule neuroner 27,28. Spredning er afhængig af mitogen SHH signalering fra underliggende Purkinje neuroner 29-32. Evnen til at reagere på SHH har vist sig at være helt afhængig celleautonom ekspression af transkriptionsfaktoren Atoh1, både in vitro 33 og in vivo 34,35. Ligeledes har cellecyklus exit og differentiering vist sig at være afhængig af ekspressionen af nedstrøms transkriptionsfaktor NeuroD1 36, hvilket sandsynligvis en direkte repressor Atoh1 37. Trods disse fremskridt og en betydelig fremgang i dechifrere cellen biologiske grundlag for cellecyklus exit 38-42, at den grundlæggende molekylære mekanisme (r), der ligger bag beslutningen forlade cellecyklen og til at skifte fra en progenitor til en differentierende neuron, og associerede postmitotiske tangential migration i den indre EGL samt senere switchradial migration, forbliver ufuldstændigt forstået. Dette er i vid udstrækning på grund af den eksperimentelle intractability af EGL: det er sent udvikling, og vanskelige at målrette genetisk da mange af de samme neurogene molekyler er også afgørende tidligere i livet af granula-forstadier ved rhombisk Lip. For at overvinde dette problem har adskillige forfattere udviklet in vivo og ex vivo elektroporation som en metode til at målrette den postnatale cerebellum hos gnavere 43-48. Her har vi pioner brugen af ex vivo elektroporation i chick at studere EGL, som repræsenterer betydelige fordele med hensyn til omkostninger og bekvemmelighed. Vores metode til elektroporation og ex vivo-skive kultur chick cerebellar væv anvendelser væv dissekeret fra embryonale Dag 14 kyllinger på toppen af EGL spredning. Denne metode gør det muligt genetisk målretning af EGL uafhængigt af rombisk læbe og vil sætte scenen for genetisk dissektion af overgangen fra granulatprogenitor til postmitotiske granulat neuron i cerebellum.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

Den cerebellar eksterne granulat lag (EGL) er stedet for den største transit forstærkning i den udviklende hjerne, og en fremragende model til at studere neuronal proliferation og differentiering. Desuden har evolutionære ændringer af dets proliferative kapacitet været ansvarlig for en dramatisk udvidelse af cerebellar størrelse i amniotes, gør lillehjernen en fremragende model for evo-Devo undersøgelser af hvirveldyrs hjerne. De konstituerende celler i EGL, cerebellare granula stamfædre, også udgøre en betydelig celle af oprindelse for medulloblastom, den mest udbredte pædiatriske neuronal tumor. Efter amplifikation transit, granulat forstadier vandrer radialt i det indre granulære lag af cerebellum, hvor de udgør den største neuronal population i den modne pattedyrs hjerne. I chick, toppen af ​​EGL proliferation forekommer i slutningen af ​​den anden uge af svangerskabet. For at målrette genetisk modifikation dette lag påtoppen af spredning, har vi udviklet en metode til genetisk manipulation gennem ex vivo elektroporation af cerebellum skiver fra embryonale Dag 14 kyllingeembryoer. Denne metode rekapitulerer flere vigtige aspekter af in vivo granulat neuron udvikling og vil være nyttige i generering af en grundig forståelse af cerebellar granula celleproliferation og differentiering, og dermed cerebellum udvikling, evolution og sygdom.

Dette afsnit viser eksempler på resultater, der kan opnås ved hjælp af slice elektroporation og kultur lillehjernen fra embryonale Dag 14 kylling. Dissektion af cerebellum er illustreret i figur 1 og elektroporation kammer oprettet er vist i figur 2. Vi viser, at det er muligt at elektroporere og med held kultur cerebellare skiver, som bibeholder deres struktur og cellulære morfologier in vitro (figur 3A). Målrettet elektro...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Den cerebellar eksterne granulat lag er stedet for den største transit forstærkning i den udviklende hjerne. Her præsenterer vi en protokol til at målrette genetisk modifikation til dette lag på toppen af spredning ved hjælp af ex vivo elektroporation og kultur i cerebellare skiver fra embryonale Dag 14 kyllingeembryoer.

Ex Vivo Kultur Chick cerebellare Skiver og Rumligt Målrettet Elektroporation af granulat celleforstadier

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick nethinder for primær cellekultur Studies: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimeret<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Dyrkning af kyllingeembryoer til fremskredne stadier af udvikling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Elektroporering og organotypisk Slice kultur Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Kultur Faryngeal Arches at studere hjerte og Muskel Progenitorer og deres niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Frem Genetisk tilgang til Afdække Stress resistensgener i mus - En Højkapacitetsforskning skærm i ES-celler

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardial Udvækst Kultur Assay og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Vurdering af Epikardial-afledt cellemigration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonede analyse af embryonale hæmatopoietisk stamcelle prækursorer ved hjælp af enkelt celle indeks sortering kombineret med endotel celle Niche Co kultur

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-medieret tab af funktion analyse i cerebellare granula celler ved hjælp af In Utero elektroporation-baseret overførsel af gener

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Ex vivo perfusion af rodent placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Elektro porationsmetode til in vivo-levering af plasmid-DNA i den voksne Zebrafish telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...