Name: ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

De methode die in dit artikel is ontstaan ​​uit het werk gefinancierd door de BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) en een MRC doctoraal studententijd (MH).

Let op: Alle experimenten werden uitgevoerd met overeenstemming met het King&#39;s College in Londen, Verenigd Koninkrijk en het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken richtlijnen verzorging van dieren. 1. Dissectie van e14 kleine hersenen <ol><li> Broeden eieren bruin bevruchte kippeneieren bij 38 ° C tot embryonale Dag 14. </li><li> Met behulp van ei schaar onthoofden kippenembryo in ovo en verwijder het hoofd naar een petrischaal met ijskoude PBS (Figuur 1A).</strong...

Het protocol hier gemeld beschrijft een methode voor het ontleden, elektroporeren en het kweken van plakjes embryonale Dag 14 cerebellum van het kuiken. Dit protocol maakt targeting van elektroporatie kleine focale gebieden van de EGL, inclusief geïsoleerde targeting van individuele cerebellaire lobben. Het maakt genetische analyse en weergave met een hoge resolutie te bereiken, en tegen lage kosten in vergelijking met bestaande technieken bij knaagdieren 43-47. Dergelijke analyse is momenteel niet mogelijk ...

Het cerebellum zit aan het voorste uiteinde van de achterhersenen en is verantwoordelijk voor de integratie van sensorische en motorische verwerking in de volwassen hersenen en regulering hogere cognitieve processen 1. In zoogdieren en vogels, bezit een uitgebreid morfologie en zwaar gelaagde, een resultaat van uitgebreid doorvoer amplificatie van progenitors in ontwikkeling die produceert dan de helft van de neuronen in de volwassen hersenen. Het cerebellum is een onderwerp van onderzoek geweest neurobiologists eeuwenlang en in de moleculaire tijdperk is ook veel aandacht gekregen. Dit heeft niet alleen zijn inherent interessant biologie, maar ook op het feit dat het zwaar is betrokken bij humane ziekten waaronder ontwikkelingsstoornissen genetische aandoeningen zoals autismespectrumstoornissen 2 en het meest opvallend de cerebellaire kanker, medulloblastoom 3, dat is de meest voorkomende pediatrische brain tumor. Belangrijk is een uitstekend modelsysteem binnen which allocatie lot en neurogenese studeren tijdens de ontwikkeling van de hersenen 4. De laatste jaren is ook vastgesteld als modelsysteem voor de vergelijkende studie van hersenontwikkeling, vanwege de enorme diversiteit van cerebellaire vormen gezien in de vertebraat fylogenie 5-10. Het cerebellum ontwikkelt de dorsale helft van rhombomere 1 in de achterhersenen en ontwikkelingsgebied 11 omvat twee primaire progenitorpopulaties de ruitvormige lip en de ventriculaire zone. De ruitvormige lip strekt zich uit rond het dorsale gebied van de neuroepithelium van de achterhersenen aan de grens met de dakplaat. Het is de geboorteplaats van de glutamaat prikkelende neuronen van het cerebellum 12-14. De ventriculaire zone leidt tot de remmende GABAergic cerebellaire neuronen, het meest opvallend grote Purkinje neuronen 14,15. Later in de ontwikkeling (van ongeveer embryonale dag 13,5 in de muis; e6 in kuiken 16), glutamaat Progensatoren migreren tangentieel van de ruitvormige lip en vormen een pial laag van voorlopers: een secundaire voorlopercellen zone genaamd de externe korrel laag (EGL). Het is deze laag die de uitgebreide amplificatie doorvoer die leidt naar de grote aantallen granule neuronen in de volwassen hersenen ondergaat. Proliferatie in de EGL is lang verbonden met de sub-pial plaats als gevolg van tangentiële migratie van de ruitvormige lip 17, de schakelaar celcyclus verlaten en neuronale differentiatie van voorlopercellen behoort bij het ​​verlaten van de buitenste EGL laag in het midden EGL 18. Uitgebreide tangentiële migratie van post-mitotische granule cellen in mediale-laterale as optreedt in het midden en binnenste EGL 19 vóór definitieve radiale migratie naar de binnenste laag van de korrel rijpe cerebellaire cortex. Migratie van cellen uit de ruitvormige lip over de cerebellaire oppervlakte is afhankelijk van CXCL12 signalering van de pia 20-22 </sup&gt; En granule cellen drukken de CXCL12 receptor CXCR4. Hun tangentiële migratie is dus denken aan die van de neocorticale tangentiaal migreren remmende interneuron bevolking 23-25. Intrigerend elektronenmicroscopische studies 17 hebben gesuggereerd dat EGL cellen met een proliferatieve morfologie behouden pial contact, het koppelen van de cel gedrag proliferatieve mogelijkheden op een manier die doet denken aan de basale voorouders van de zoogdieren cortex 26. Dit komt tot uiting in de genoemde stratificatie van de EGL in drie sub-lagen die worden gedefinieerd door verschillende extracellulaire milieu en indien granule precursors hebben verschillende genexpressie handtekeningen 18. Proliferatie van voorlopers in de oEGL optreedt met een normale verdeling van kloon afmetingen zodanig dat als voorlopers individueel genetisch gemerkt eind embryonale ontwikkeling bij de muis, geven aanleiding tot een mediaan gemiddelde van 250-500 g postmitotischeranule neuronen 27,28. Proliferatie is afhankelijk van mitogene SHH signalering van onderliggende Purkinje neuronen 29-32. Het vermogen om te reageren op SHH aangetoond volledig afhankelijk cell autonome expressie van de transcriptiefactor Atoh1 te zijn, zowel in vitro 33 en in vivo 34,35. Evenzo heeft celcyclus verlaten en differentiatie getoond afhankelijk van de expressie van het stroomafwaartse transcriptiefactor NeuroD1 36, die waarschijnlijk een directe repressor van Atoh1 37 zijn. Ondanks deze vooruitgang, en de aanzienlijke vooruitgang in het ontcijferen van de celbiologische basis van de celcyclus exit 38-42, het fundamentele moleculaire mechanisme (s) dat de beslissing ten grondslag liggen aan de celcyclus verlaten en om de overgang van een voorloper van een differentiërende neuron, en de geassocieerde postmitotische tangentiële migratie in het binnenste EGL en de latere switchradiale migratie, blijft onvolledig begrepen. Dit is grotendeels vanwege het experimentele eigenzinnigheid van de EGL: het laat ontwikkelen, en moeilijk genetisch doel omdat veel van dezelfde neurogene moleculen ook cruciaal vroeger in het leven van korrel precursors in het ruitvormige lip. Om dit probleem te overwinnen zijn talrijke auteurs in vivo en ex vivo elektroporatie ontwikkeld als een methode om de postnatale cerebellum bij knaagdieren 43-48 richten. Hier hebben we pionier het gebruik van ex vivo elektroporatie in chick op de EGL, die aanzienlijke voordelen vertegenwoordigt in termen van kosten en het gemak bestuderen. Onze methode van elektroporatie en ex vivo stukje cultuur van chick cerebellaire weefsel maakt gebruik van weefsel ontleed uit embryonale dag 14 kuikens op het hoogtepunt van EGL proliferatie. Deze methode maakt genetische targeting van het EGL onafhankelijk van de ruitvormige lip en het stadium voor genetische dissectie van de overgang van granulevoorlopercellen te postmitotische korrel neuron in het cerebellum.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

Cerebellaire granule uitwendige laag (EGL) is de plaats van de grootste doorvoer versterking in de zich ontwikkelende hersenen en een uitstekend model voor het bestuderen van neuronale proliferatie en differentiatie. Bovendien zijn evolutionaire modificaties van de proliferatieve capaciteit belast de intense beleving van cerebellaire grootte in de amnioten geweest, waardoor het cerebellum een ​​uitstekend model voor evo-devo studies van de gewervelde hersenen. De constituerende cellen van EGL, cerebellaire granule voorlopers, ook een belangrijke cel van oorsprong vormen voor medulloblastoom, de meest voorkomende pediatrische neuronale tumor. Na doorvoer amplificatie granule precursoren migreren radiaal in de interne granulaire laag van het cerebellum, waar zij de grootste neuronale populatie in het volwassen hersenen. In kuiken, de piek van EGL proliferatie optreedt aan het einde van de tweede week van de zwangerschap. Om genetische modificatie om deze laag te richten opde piek van proliferatie, hebben we een werkwijze voor genetische manipulatie door middel van ex vivo elektroporatie van cerebellum segmenten uit embryonale dag 14 kippenembryo&#39;s ontwikkeld. Deze werkwijze herhaalt verscheidene belangrijke aspecten van in vivo granule neuron ontwikkeling en zal bruikbaar zijn bij het ​​genereren van een grondig begrip van cerebellaire granule celproliferatie en differentiatie en dus van cerebellum ontwikkeling, groei en ziekte.

Dit gedeelte illustreert voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van slice elektroporatie en cultuur van cerebellum uit embryonale dag 14 chick. De ontleding van het cerebellum is geïllustreerd in figuur 1 en elektroporatie kamer ingesteld is weergegeven in figuur 2. We tonen aan dat het mogelijk is cultuur cerebellaire schijfjes, die de structuur en cellulaire morfologie (figuur 3A) behoud...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Cerebellaire granule uitwendige laag is de plaats van de grootste doorvoer versterking in de zich ontwikkelende hersenen. Hier presenteren we een protocol voor genetische modificatie om deze laag te richten op het hoogtepunt van proliferatie via ex vivo elektroporatie en cultuur van cerebellaire plakjes uit embryonale dag 14 kippenembryo&#39;s.

Ex Vivo Cultuur van Chick Cerebellaire Slices en Ruimtelijk Gerichte Elektroporatie van Korrel cel precursoren

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporatie Aanpak

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Geoptimaliseerd<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Het kweken van kippenembryo&#39;s tot geavanceerde stadia van ontwikkeling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Cultuur van pharynxbogen to Heart en Muscle voorouders en hun niche Studie

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetische Aanpak stress resistentiegenen in Muizen Ontdek - Een High-throughput scherm in ES-cellen

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardiale uitgroei Cultuur en Assay<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Evaluatie van Epicardial-afgeleide Cell Migratie

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-gemedieerde verlies van functie analyse in cerebellaire submodule cellen gebruiken In Utero Electroporation gebaseerde gentransfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Ex vivo doorbloeding van de knaagdieren placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Elektroporation methode voor in vivo levering van plasmide DNA in de volwassen zebravis Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...