Name: ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Il metodo presentato in questo articolo è nata dal lavoro finanziato dalla BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) e un dottorato studentship MRC (MH).

Nota: Tutti gli esperimenti sono stati effettuati con conformità a King College di Londra, Regno Unito e le linee guida per la cura degli animali nel Regno Unito Home Office. 1. La dissezione di e14 cervelletto <ol><li> Incubare le uova marroni embrionate di gallina a 38 ° C e 14 ° giorno embrionale. </li><li> Utilizzando le forbici uovo decapitano embrione di pollo in ovo e rimuovere la testa di una capsula di Petri contenente ghiaccio PBS freddo (Figura 1A). ...

Il protocollo qui riportato descrive un metodo per dissezione, electroporating e coltura fette di embrionale Giorno 14 cervelletto dal pulcino. Questo protocollo permette di targeting di elettroporazione per piccole regioni focali della EGL, compreso isolato di mira singoli lobi cerebellari. Consente analisi genetica e di imaging ad alta risoluzione e convenienza, e ad un basso costo rispetto alle tecniche consolidate nei roditori 43-47. Tale analisi non è attualmente possibile in vivo a causa del l...

Il cervelletto si trova all&#39;estremità anteriore del romboencefalo ed è responsabile per l&#39;integrazione di elaborazione sensoriale e motore nel cervello maturo e regolazione dei processi cognitivi elevati 1. Nei mammiferi e uccelli, possiede una morfologia complessa ed è fortemente lamellare, un prodotto di ampio amplificazione transito dei progenitori durante lo sviluppo che produce oltre la metà dei neuroni nel cervello adulto. Il cervelletto è stato oggetto di studio per neurobiologi da secoli e in epoca molecolare ha anche ricevuto notevole attenzione. Ciò si riferisce non solo alla sua intrinsecamente interessante biologia, ma anche per il fatto che essa è fortemente implicata nella malattia umana, compresa malattie genetiche dello sviluppo come disturbi dello spettro autistico 2 e più visibile il tumore cerebellare, il medulloblastoma 3, che è il cervello pediatrico più diffuso tumore. È importante sottolineare che si tratta di un ottimo sistema modello entro which per studiare l&#39;allocazione destino e neurogenesi durante lo sviluppo cerebrale 4. Negli ultimi anni, è stato anche affermato come sistema modello per lo studio comparato di sviluppo del cervello, a causa della grande diversità di forme cerebellari visto attraverso la filogenesi dei vertebrati 5-10. Il cervelletto si sviluppa dalla metà dorsale del rhombomere 1 in romboencefalo 11 ed evolutivamente comprende due popolazioni progenitrici primari, il labbro rombico e zona ventricolare. Il labbro romboidale si estende intorno alla regione dorsale del neuroepitelio del romboencefalo al confine con la lamiera del tetto. E &#39;il luogo di nascita dei neuroni eccitatori glutamatergici del cervelletto 12-14. La zona ventricolare suscita le inibitorie GABAergiche neuroni del cervelletto, il più prominente dei grandi neuroni Purkinje 14,15. Più tardi, in fase di sviluppo (da circa 13,5 giorno embrionali nel topo; e6 in pulcino 16), glutamatergico Progenmodifiche ai contenuti migrano tangenzialmente dal labbro romboidale e formano uno strato pial di progenitori: una zona progenitore secondaria chiamato lo strato esterno dei granuli (EGL). È questo livello che subisce l&#39;ampia amplificazione di transito che conduce l&#39;enorme numero di neuroni granulari presenti nel cervello maturo. Proliferazione nel EGL è stata a lungo legata alla posizione sub-pial che deriva dalla migrazione tangenziale dalla rombico labbro 17, con l&#39;interruttore di uscita del ciclo cellulare e la differenziazione neuronale di progenitori essendo associato con la loro uscita dallo strato esterno EGL in mezzo EGL 18. Extensive migrazione tangenziale di cellule granulari post-mitotici in asse mediale-laterale si verifica nel mezzo ed interno EGL 19, prima finale migrazione radiale nello strato granuli interno della corteccia cerebellare maturo. La migrazione delle cellule dal labbro rombico sulla superficie cerebellare dipende segnalazione CXCL12 dalla pia 20-22 </sup&gt; E cellule granulari esprimono il recettore CXCR4 CXCL12. La loro migrazione tangenziale è quindi ricorda quello di tangenzialmente neocorticale popolazioni migranti interneuroni inibitori 23-25. Curiosamente, elettroni studi microscopici 17 hanno suggerito che le cellule EGL con una morfologia proliferativa mantenere il contatto piale, che collega il comportamento delle cellule con capacità proliferativa in un modo che ricorda i progenitori basali della corteccia dei mammiferi 26. Ciò si riflette nel summenzionato stratificazione della EGL in tre sottolivelli che sono definiti da distinti ambienti extracellulari e dove precursori dei granuli hanno genica distinto firme 18. Proliferazione di progenitori nel oEGL avviene con una normale distribuzione delle dimensioni clone tale che quando progenitori sono singolarmente geneticamente etichettati al termine dello sviluppo embrionale nel topo, danno luogo ad una media di 250-500 mediana postmitotici gneuroni ranule 27,28. Proliferazione dipende segnalazione SHH mitogenic dal sottostante Purkinje neuroni 29-32. La capacità di rispondere a SHH ha dimostrato di essere interamente dipendente cella autonoma espressione del fattore di trascrizione Atoh1, sia in vitro che in vivo 33 34,35. Allo stesso modo, l&#39;uscita del ciclo cellulare e la differenziazione ha dimostrato di essere dipendente dalla espressione del fattore di trascrizione a valle NeuroD1 36, che è probabilmente un repressore diretta di Atoh1 37. Nonostante questi progressi, e un notevole avanzamento nel decifrare la cellula base biologica di uscita ciclo cellulare 38-42, i meccanismi molecolari fondamentali (s) che sono alla base della decisione di uscire dal ciclo cellulare e la transizione da un progenitore di un neurone di differenziazione, e la associato postmitotici migrazione tangenziale nel EGL interno così come l&#39;interruttore dopoalla migrazione radiale, rimanere completamente sconosciuto. Questo è in gran parte a causa della intrattabilità sperimentale della EGL: si sta sviluppando tardi, e difficili da indirizzare geneticamente poiché molte delle stesse molecole neurogenici sono anche fondamentale precedenza nella vita dei precursori dei granuli al labbro romboidale. Per superare questo problema, numerosi autori hanno sviluppato in vivo e ex vivo elettroporazione come metodo per indirizzare il cervelletto postnatale nei roditori 43-48. Qui, la strada nell&#39;uso di ex vivo elettroporazione in pulcino per studiare la EGL, che rappresenta notevoli vantaggi in termini di costi e convenienza. Il nostro metodo di elettroporazione e ex vivo della cultura fetta di tessuto cerebellare pulcino utilizza tessuto sezionato dal giorno embrionale 14 pulcini al culmine di EGL proliferazione. Questo metodo permette di targeting genetico della EGL indipendentemente dal labbro romboidale e porranno le basi per la dissezione genetica della transizione da granuliprogenitore di postmitotici neurone granello nel cervelletto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

Lo strato cerebellare granuli esterno (EGL) è il sito del più grande ampliamento di transito nel cervello in via di sviluppo, e un ottimo modello per studiare la proliferazione e la differenziazione neuronale. Inoltre, le modifiche evolutive della sua capacità proliferativa sono stati responsabili per la drammatica espansione delle dimensioni del cervelletto nei amnioti, rendendo il cervelletto un ottimo modello per gli studi evo-devo del cervello dei vertebrati. Le cellule che costituiscono il EGL, progenitori dei granuli cerebellari, rappresentano anche una cella significativo di origine per medulloblastoma, il più comune tumore pediatrico neuronale. A seguito di transito amplificazione, precursori dei granuli migrano radialmente nello strato granulare interno del cervelletto, dove essi rappresentano la più grande popolazione neuronale nel cervello dei mammiferi maturo. In pulcino, il picco di EGL proliferazione avviene verso la fine della seconda settimana di gestazione. Al fine di indirizzare la modificazione genetica di questo strato ail picco della proliferazione, abbiamo sviluppato un metodo per la manipolazione genetica ex vivo attraverso elettroporazione di fette cervelletto da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo. Questo metodo riassume alcuni aspetti importanti di in vivo granuli sviluppo dei neuroni e sarà utile per generare una conoscenza approfondita delle cerebellare proliferazione delle cellule dei granuli e la differenziazione, e quindi dello sviluppo del cervelletto, l&#39;evoluzione e la malattia.

Questa sezione illustra esempi di risultati che si possono ottenere con la fetta elettroporazione e la cultura del cervelletto da embrionale Giorno 14 pulcino. La dissezione del cervelletto è illustrato nella figura 1 e la camera di elettroporazione impostato è mostrato in Figura 2. Si dimostra che è possibile per l&#39;elettroporazione e con successo cultura fette cerebellare, che mantengono la loro struttura e morfologie cellulari <...

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Lo strato granulare esterno cerebellare è il sito della più grande amplificazione transito nel cervello sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo di indirizzare la modificazione genetica di questo strato al culmine della proliferazione usando ex vivo elettroporazione e la cultura di fette cerebellare da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo.

Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elettroporazione Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

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Ottimizzato<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Coltura di Chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

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Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

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Ex Cultura Vivo del faringea Archi allo Studio cuore e muscoli Progenitori e la loro nicchia

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

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Approccio genetico in avanti per scoprire la resistenza allo stress geni nei topi - Uno Schermo high-throughput in cellule ES

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardico escrescenza Cultura Assay e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; La valutazione della migrazione delle cellule di derivazione epicardico

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nell'Utero basati su elettroporazione trasferimento del Gene

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Perfusione ex vivo della placenta del roditore

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Metodo di elettroporazione per in vivo Consegna del DNA plasmide nel Telencephalon del pesce zebra adulto

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...