Name: ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Metoden som presenteres i denne artikkelen oppsto fra arbeid finansiert av BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) og en MRC doktorgradsstudent (MH).

Merk: Alle forsøkene ble utført med henhold til Kings College London, UK og retningslinjene UK hjemmekontoret dyr omsorg. 1. Disseksjon av e14 lillehjernen <ol><li> Inkuber brune befruktede hønseegg ved 38 ° C til embryonale dag 14. </li><li> Bruke egg saks halshogge chick embryo i ovo og fjerne hodet til en petriskål med iskald PBS (figur 1A). </li><li> Ved hjelp av standard tang, lage snitt bak hvert øye hele veien gjennom vevet, fjerne øyne og øvre kjev...

Protokollen rapportert her beskriver en metode for å dissekere, electroporating og dyrking skiver av embryonale Dag 14 cerebellum fra dama. Denne protokollen muliggjør målretting av elektroporering til små fokus regioner av EGL, inkludert isolerte målretting av individuelle lillehjernen fliker. Det gjør det mulig genetisk analyse og bildebehandling med høy oppløsning og bekvemmelighet, og til en lav pris i forhold til etablerte teknikker i gnagere 43-47. En slik analyse er foreløpig ikke mulig in...

Lillehjernen sitter på fremre enden av hindbrain og er ansvarlig for integrering av sensorisk og motorisk behandling i modne hjernen samt regulere høyere kognitive prosesser 1. I pattedyr og fugler, besitter det en forseggjort morfologi og er tungt foliert, et produkt fra transitt omfattende forsterkning av progenitorceller under utvikling som produserer over halvparten av nervecellene i den voksne hjernen. Lillehjernen har vært gjenstand for studier for nevrobiologer i århundrer og i molekylær epoken har også fått betydelig oppmerksomhet. Dette gjelder ikke bare for sin iboende interessant biologi, men også til det faktum at det er sterkt implisert i human sykdom inkludert utviklings genetiske lidelser så som autisme 2 og er mest fremtredende i cerebellar kreft, medulloblastom 3, som er den mest utbredte pediatriske hjerne svulst. Viktigst er det en utmerket modell system innen which å studere skjebnen tildeling og neurogenesis under hjernens utvikling 4. I de senere årene har det også blitt etablert som et modellsystem for sammenlignende studie av hjernens utvikling, på grunn av den enorme mangfoldet av lillehjernen former sett over virveldyr fylogeni 5-10. Lillehjernen utvikler seg fra rygghalvparten av rhombomere en i hindbrain 11 og utviklingsmessig består av to primære progenitor populasjoner, rombe leppen og ventrikulær sone. Den rhombic leppe strekker seg rundt rygg regionen i neuroepithelium av hindbrain på grensen med taket plate. Det er fødestedet til de glutamaterge eksitatoriske nevroner i lillehjernen 12-14. Ventrikulære sonen gir opphav til de hemmende gabaergic cerebellare nevroner, mest fremtredende de store Purkinje nevroner 14,15. Senere i utvikling (fra ca embryonale dag 13,5 i mus, e6 i chick 16), glutamatergic Progenitors migrere tangentielt fra rhombic leppe og danne et pial lag av stamfedre: en sekundær stamfar sone kalt ekstern granulat lag (EGL). Det er dette laget som gjennomgår omfattende transitt forsterkning som fører til det store antallet granule nevroner som finnes i den modne hjernen. Spredning i EGL har lenge vært knyttet til sub-pial sted at resultatene fra tangential migrasjon fra rhombic leppe 17, med bryteren til cellesyklusen exit og nevronale differensiering av stamceller bli assosiert med sin exit fra det ytre EGL lag i midten EGL 18. Omfattende tangentiell migrering av post-mitotiske granule celler i medial-lateral akse forekommer i den midtre og indre EGL 19, før den endelige radial migrering inn i det indre granulat laget av modne lillehjernen cortex. Migrering av celler fra rombisk leppen over cerebellar overflaten er avhengig av signalering fra CXCL12 pia 20-22 </sup&gt; Og granule celler uttrykker CXCL12 reseptoren CXCR4. Deres tangential migrasjon er dermed minner om at av neokortikale tangentielt migrere hemmende Interneuron populasjoner 23-25. Forbløffende nok elektron mikroskopiske studier 17 har antydet at EGL celler med en proliferativ morfologi opprett pial kontakt, linking celle atferd med proliferativ kapasitet på en måte som minner om de basale stamfedre av pattedyr cortex 26. Dette gjenspeiles i den ovenfor nevnte lagdeling av EGL i tre sjikt som er definert av forskjellige ekstracellulære omgivelser og hvor granule forløpere adskilte genekspresjon 18 signaturer. Proliferasjon av progenitorceller i oEGL oppstår med en normal fordeling av klone størrelser, slik at når forløpere er individuelt genetisk merket i enden av embryoutvikling i mus, gir de opphav til en median gjennomsnitt på 250-500 g postmitoticranule nevroner 27,28. Spredning er avhengig mitogent SHH signale fra underliggende Purkinjefibrene nevroner 29-32. Evnen til å reagere på SHH har vist seg å være helt avhengig av celleautonome ekspresjonen av transkripsjonsfaktor Atoh1, både in vitro og 33 in vivo 34,35. Likeledes har cellesyklus utgang og differensiering blitt vist å være avhengig av ekspresjonen av den nedstrøms transkripsjonsfaktor NeuroD1 36, som mest sannsynlig et direkte repressor av Atoh1 37. Til tross for denne utviklingen, og et betydelig fremskritt i å tyde cellen biologisk basis av cellesyklus utgang 38-42, til den grunnleggende molekylære mekanismen (e) som ligger til grunn for avgjørelsen avslutter cellesyklus og å gå over fra en progenitor til en differensierende neuron, og tilhørende postmitotic tangentiell migrasjon i den indre EGL, så vel som den senere bryterentil radial migrasjon, forblir ufullstendig forstått. Dette er i stor grad på grunn av den eksperimentelle intractability av EGL: det er forsinket utvikling, og er vanskelig å målrette genetisk siden mange av de samme nevrogene molekyler er også avgjørende tidligere i livet av granule forløpere ved rhombic leppe. For å overvinne dette problemet, har mange forfattere utviklet in vivo og ex vivo elektroporering som en metode for å målrette barsel cerebellum hos gnagere 43-48. Her har vi pioner bruk av ex vivo elektroporering i chick å studere EGL, som representerer betydelige fordeler i form av pris og brukervennlighet. Vår metode for elektroporering og ex vivo skive kultur av chick lillehjernen vev anvendelser vev dissekert fra embryonale Day 14 unger på toppen av EGL spredning. Denne metoden gjør genetisk målretting av EGL uavhengig av rhombic leppe og vil sette scenen for genetisk disseksjon av overgangen fra granulatstamfar til postmitotic granulat nevron i lillehjernen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

Lillehjernen eksterne granule lag (EGL) er stedet for den største transitt forsterkning i utviklingen av hjernen, og en utmerket modell for å studere neuronal spredning og differensiering. I tillegg er det evolusjonære modifikasjoner av den proliferative evne vært ansvarlig for den dramatiske utvidelse av lillehjernen størrelse i amniotes, noe som gjør cerebellum en utmerket modell for evo-Devo studier av virveldyr hjernen. Konstituerende cellene i EGL, lillehjernen granule stamfedre, også representerer en betydelig celle utstedt medulloblastoma, den mest utbredte pediatrisk nevronale svulst. Etter sin vei forsterkning, granule forløpere migrere radielt inn i den indre granulære lag av lillehjernen, hvor de representerer den største neuronal populasjon i den modne hjernen hos pattedyr. I chick, oppstår toppen av EGL proliferasjon mot slutten av den andre uken av drektighetsperioden. For å målrette genetisk modifisering av dette lag vedtoppen av spredning, har vi utviklet en metode for genetisk manipulasjon gjennom ex vivo elektroporering av lillehjernen skiver fra embryonale Day 14 kyllingfoster. Denne metoden sammenfatter flere viktige sider ved in vivo granule neuron utvikling og vil være nyttig i å generere en grundig forståelse av cerebellar granule celleproliferasjon og differensiering, og dermed av cerebellum utvikling, evolusjon og sykdom.

Denne delen viser eksempler på resultater som kan oppnås ved hjelp av slice elektroporering og kulturen i lillehjernen fra embryonale Dag 14 chick. Disseksjon av lillehjernen er illustrert i figur 1 og elektroporering kammeret satt opp er vist i figur 2. Vi viser at det er mulig å electroporate og hell kultur cerebellare stykker, som beholder sin struktur og cellulære morfologi in vitro (figur</e...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Lillehjernen eksterne granulat laget er åsted for det største transitt forsterkning i utviklingen av hjernen. Her presenterer vi en protokoll for å målrette genmodifisering til dette laget på toppen av spredning ved hjelp av ex vivo elektroporering og kulturen i lillehjernen skiver fra embryonale Day 14 kyllingfoster.

Ex vivo Culture of Chick lillehjernen Slices og Romlig Målrettet Electroporation av granulat Cell Forstadier

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick netthinne for primære cellekulturstudier: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimalisert<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Dyrking av Chick embryoer til avanserte stadier av utvikling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation og organotypiske Slice Culture of Mouse hippocampus Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex vivo Culture of Faryngeal Arches å studere Hjerte og Muscle stamfedre og deres nisje

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetisk tilnærming til Avdekke Stress resistensgener i Mus - En High-throughput Screen i ES-celler

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardiell utvekst Kultur-analysen og<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Vurdering av Epikardial-avledet celle migrasjon

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonal analyse av embryonale stamcelleforskningen blodkreft forløpere bruke enkeltcelle indeks sortering kombinert med endotelial celle nisje co kultur

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediert tap av funksjon analyse i lillehjernen Granule celler ved hjelp av In Utero Electroporation-baserte genoverføring

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Ex vivo av den gnager placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation metode for in vivo levering av plasmider DNA i Adult sebrafisk Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...