Name: ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

O método apresentado neste artigo surgiu de trabalho financiado pelo BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) e uma bolsa de estudo de doutorado MRC (MH).

Nota: Todas as experiências foram realizadas com acordo de Kings College London, Reino Unido e as orientações de cuidados de animais UK Home Office. 1. Dissecção da e14 Cerebelo <ol><li> Incubar ovos de galinha fertilizados marrom a 38 ° C para o dia 14 embrionário. </li><li> Usando uma tesoura de ovos decapitam embrião de galinha in ovo e remover a cabeça para uma placa de Petri contendo PBS gelado (Figura 1A). </li><li> Utilizando uma pinça standard, f...

O protocolo aqui relatado descreve um método para a dissecação, electroporating e cultura de fatias de embrionário do dia 14 a partir do cerebelo de pinto. Este protocolo permite a segmentação de eletroporação para pequenas regiões focais do EGL, incluindo isolado direcionamento dos lóbulos do cerebelo individuais. Ele permite a análise genética e de imagem com uma resolução elevada e conveniência, e de baixo custo em comparação com técnicas estabelecidas em roedores 43-47. Essa análise nã...

O cerebelo fica no final anterior da parte posterior do cérebro e é responsável pela integração do processamento sensorial e motor no cérebro maduro, bem como regulando processos cognitivos superiores 1. Nos mamíferos e aves, que possui uma morfologia elaborada e é fortemente foliados, um produto de grande amplificação trânsito de progenitores durante o desenvolvimento, que produz mais de metade dos neurónios no cérebro adulto. O cerebelo tem sido um tema de estudo para os neurobiólogos durante séculos e na era molecular recebeu igualmente uma atenção significativa. Isto diz respeito não só à sua biologia inerentemente interessante, mas também ao fato de que ele é fortemente implicado na doença humana, incluindo doenças genéticas de desenvolvimento, como transtornos do espectro do autismo 2 e mais proeminente o câncer cerebelar, meduloblastoma 3, que é o cérebro pediátrico mais prevalente tumor. Importante, é um excelente sistema de modelo dentro which para estudar alocação destino e neurogênese durante o desenvolvimento cerebral 4. Nos últimos anos, foi também estabelecida como um sistema modelo para o estudo comparativo de desenvolvimento do cérebro, devido à grande diversidade de formas de cerebelo visto do outro lado da filogenia vertebrado 5-10. O cerebelo desenvolve a partir da metade dorsal da rhombomere 1 no cérebro posterior 11 e desenvolvente é composta de duas populações progenitoras primárias, o lábio rômbica e da zona ventricular. O lábio rhombic se estende em torno da região dorsal do neuroepitélio da hindbrain na fronteira com a placa de telhado. É o berço dos neurônios excitatórios glutamatérgicos do cerebelo 12-14. A zona ventricular dá origem a neurônios do cerebelo GABAérgicos inibitórios, o mais proeminente os neurônios de Purkinje grandes 14,15. Mais tarde, em desenvolvimento (de cerca dia embrionário 13,5 em rato; e6 em pinto 16), Progen glutamatergicitors migrar tangencialmente a partir do lábio rômbica e formar uma camada de células progenitoras pial: uma zona secundária chamada de progenitor a camada externa de grânulo (EGL). É esta camada que sofre a grande amplificação de trânsito que leva para o grande número de neurônios granulares encontrados no cérebro maduro. Proliferação na EGL tem sido ligada à localização sub-pial que resulta da migração tangencial do lábio rômbico 17, com o interruptor para sair do ciclo celular e diferenciação neuronal de células progenitoras estarem associados com a sua saída a partir da camada exterior EGL para o meio EGL 18. Migração tangencial extensivo de células granulares pós-mitóticas no eixo lateral-medial ocorre no médio e interno EGL 19, antes da migração radial final para a camada de grânulos interior do córtex cerebelar maduro. A migração de células a partir do lábio rômbico sobre a superfície do cerebelo é dependente da sinalização da CXCL12 Pia 20-22 </sup&gt; E células de grânulos de expressar o receptor CXCR4 CXCL12. Sua migração tangencial é, portanto, lembra a dos tangencialmente neocortical migrando populações interneurônio inibitórios 23-25. Curiosamente, elétrons estudos microscópicos 17 sugeriram que as células EGL com uma morfologia proliferativa manter contato pial, ligando o comportamento das células com capacidade proliferativa de uma forma que lembra os progenitores basais do córtex dos mamíferos 26. Isso se reflete na estratificação acima mencionado da EGL em três subcamadas que são definidas por ambientes extracelulares distintas e onde os precursores granulares têm expressão genética distinta assinaturas 18. A proliferação de células progenitoras no oEGL ocorre com uma distribuição normal de tamanhos de clones de tal modo que quando são individualmente progenitores geneticamente marcado no final do desenvolvimento embrionário no ratinho, o que dá origem a uma média de 250-500 g mediana pós-mitóticoneurônios ranule 27,28. Proliferação é dependente de sinalização mitogénica de SHH subjacente Purkinje neurônios 29-32. A capacidade de responder a Shh foi demonstrado ser totalmente dependente de célula expressão autónoma do factor de transcrição Atoh1, tanto in vitro e in vivo 33 34,35. Da mesma forma, sair do ciclo celular e diferenciação tem sido mostrado para ser dependentes da expressão do factor de transcrição a jusante NeuroD1 36, o qual é provável que um repressor directo da Atoh1 37. Apesar deste progresso, e avanço considerável em decifrar a base biológica do ciclo celular de células de saída 38-42, o mecanismo molecular fundamental (s) que estão subjacentes à decisão de sair do ciclo celular e para a transição de um progenitor para um neurónio de diferenciação, e a migração tangencial pós-mitótico associado na EGL interior, bem como o interruptor mais tardea migração radial, permanecem completamente compreendida. Isto é, em grande medida devido ao intractability experimental da EGL: é manifestação tardia, e difícil de atingir uma vez que geneticamente muitas das mesmas moléculas neurogénicos também são cruciais no início da vida de precursores de grânulos no lábio rômbico. Para superar este problema, vários autores desenvolveram in vivo e ex vivo, electroporação, como um método para direccionar o cerebelo pós-natal em roedores 43-48. Aqui, nós caminho o uso de electroporação em ex vivo para estudar o pintainho EGL, o que representa consideráveis ​​vantagens em termos de custo e comodidade. Nosso método de eletroporação e ex vivo cultura fatia de tecido cerebelar pintainho utiliza tecido dissecado a partir do dia embrionário 14 pintos no pico da proliferação EGL. Este método permite a segmentação genética da EGL independentemente do lábio rhombic e irá definir o cenário para a análise genética da transição do grânuloprogenitoras para neurónios de grânulos pós-mitótico no cerebelo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

A camada externa de grânulo cerebelar (EGL) é o local de maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento, e um excelente modelo para estudar a proliferação e diferenciação neuronal. Além disso, as modificações evolutivas da sua capacidade proliferativa ter sido responsável pela dramática expansão do tamanho do cerebelo nas amniotes, tornando o cerebelo um excelente modelo para estudos evo-devo do cérebro dos vertebrados. As células constituintes da EGL, progenitores de grânulos de cerebelo, também representam um celular significativa de origem para meduloblastoma, o tumor neuronal pediátrica mais prevalente. A seguir à amplificação de trânsito, os precursores de grânulos migrar radialmente para dentro da camada granular interna do cerebelo, onde eles representam a maior população de neurónios no cérebro de mamíferos madura. Em pintainho, o pico de proliferação EGL ocorre no final da segunda semana de gestação. A fim de direccionar a modificação genética para esta camada emo pico de proliferação, temos desenvolvido um método para a manipulação genética ex vivo através de electroporação de fatias do cerebelo a partir do Dia 14 embriões de pintos embrionários. Este método recapitula vários aspectos importantes da in vivo de grânulos desenvolvimento neuronal e será útil para gerar uma compreensão completa da proliferação de células granulares do cerebelo e diferenciação, e, portanto, do desenvolvimento do cerebelo, e a evolução da doença.

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos utilizando eletroporação fatia e cultura de cerebelo de embrionário Dia 14 do pintinho. A dissecção do cerebelo é ilustrada na Figura 1 e a câmara de electroporação configuração é mostrado na Figura 2. Nós mostramos que é possível electroporate e com sucesso fatias de cerebelo de cultura, que retêm a sua estrutura e morfologias celulares <e...

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias.

Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Eletroporação Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Biologia do Desenvolvimento

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Otimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

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Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

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Ex Cultura Vivo de Pharyngeal Arcos para estudo do coração e do músculo Progenitores e seu nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Abordagem genética para a frente para descobrir genes de resistência a estresse em ratos - Uma tela de alta capacidade em células ES

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicárdio Conseqüência Cultura Ensaio e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Avaliação da migração celular Epicárdica derivado

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Perfusão ex vivo da placenta de roedores

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Método de Electroporation para in vivo entrega de DNA plasmídeo no adulto zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...