Name: ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Метод, представленный в этой статье возник из работы, финансируемой по BBSRC BB / I021507 / 1 (ТБ, RJTW) и докторская стипендия MRC (МН).

Примечание: Все эксперименты проводились с соответствии с Королевского колледжа в Лондоне, Великобритании и руководящих принципов по уходу за животными UK Главная Office. 1. Вскрытие E14 мозжечка <ol><li> Выдержите коричневые оплодотворенной кур яйца на 38 ° С до эмбрионального ...

Протокол сообщил здесь описан способ рассечения, электропорации и культивирование срезов эмбрионального день 14 мозжечка с птенцом. Этот протокол позволяет адресности электропорации малых фокусных регионов EGL, в том числе изолированных адресности отдельных мозжечка лепестков. Это да...

Мозжечок расположен у переднего конца заднего мозга и отвечает за интеграцию сенсорной и моторной переработки в зрелом мозге, а также регулирования более высокие когнитивные процессы 1. У млекопитающих и птиц, это имеет продуманную морфологии и степени расслаивается, продукт обширного транзитной усиления предшественников в процессе разработки, который производит более половины нейронов в мозге взрослого. Мозжечок является предметом изучения для нейробиологов в течение многих столетий и в молекулярной эры также уделено значительное внимание. Это относится не только к его сути интересной биологии, но также в том, что она в значительной степени причастны к болезни человека, включая развития генетических расстройств, таких как расстройства аутистического спектра 2 и наиболее важное мозжечка рака, медуллобластомой 3, который является наиболее распространенным педиатрических мозга опухоли. Важно отметить, что это отличная модель системы в WHIch изучать распределение судьба и нейрогенез во время развития мозга 4. В последние годы, он также был создан в качестве модельной системы для сравнительного исследования развития мозга, в связи с огромным разнообразием форм мозжечка видели по позвоночных филогении 5-10. Мозжечок развивается из дорсальной половине ромбомера 1 в заднем мозге и развитием 11 состоит из двух основных популяций клеток-предшественников, ромбической губой и вентрикулярной зоне. Ромбической губы простирается вокруг спинного области нейроэпителия заднего мозга на границе с потолочной панели. Это родина глутаматергических возбуждающих нейронов мозжечка 12-14. Желудочковая зона приводит к тормозных ГАМК нейронов мозжечка, наиболее заметно большие Пуркинье нейронов 14,15. Позднее в развитии (от примерно 13,5 эмбриональный день у мышей; е6 в куриных 16), глутаматергической Progenitors мигрировать касательной с ромбической губы и образуют слой мягкой мозговой оболочки клеток-предшественников: зона вторичного предшественников называется внешним гранул слой (EGL). Именно это слой, который подвергается обширной транзитной усиление, что приводит к огромным количеством гранул нейронов, найденных в зрелом мозге. Распространение в EGL уже давно связан с суб-пиальных месте, что результаты от касательной миграции из ромбической губы 17, с переходом на выходе клеточного цикла и дифференцировки нейронов предшественников, ассоциированных с их выходом из внешнего слоя EGL в середине EGL 18. Обширная касательной миграция постмитотических зернистых клеток в медиальной-боковой оси происходит в середине и внутренней EGL 19, до окончательного радиальной миграции во внутреннюю гранул слоем зрелой коре мозжечка. Миграция клеток из ромбической губы над мозжечка поверхности зависит от CXCL12 сигнализации от Пиа 20-22 </sup&gt; И ЗК выразить CXCL12 рецептор CXCR4. Их касательной миграция, таким образом, напоминает, что из неокортекса касательной миграции населения ингибирующие интернейронов 23-25. Интересно, электронные микроскопические исследования 17 показали, что EGL клетки с пролиферативной морфологии поддерживать контакт мягкой мозговой оболочки, связывая поведение клеток с пролиферативной способности в манере, напоминающей базальных клеток-предшественников в коре млекопитающих 26. Это нашло свое отражение в вышеупомянутом стратификации EGL в трех подслоев, которые определены различными внеклеточного сред и где гранулы прекурсоров отчетливое выражение гена подписи 18. Пролиферация клеток-предшественников в oEGL происходит с нормальным распределением размеров клонов, так что, когда предшественники отдельности генетически помечены в конце эмбрионального развития у мышей, они приводят к срединной среднем 250-500 г постмитотичностиranule нейроны 27,28. Распространение зависит от митогенной сигнализации SHH от основных Пуркинье нейронов 29-32. Способность реагировать на SHH было показано, что полностью зависит от клеточного автономной экспрессии фактора транскрипции Atoh1, как в пробирке 33 и в естественных условиях 34,35. Кроме того, выход клеточного цикла и дифференциации, как было показано, зависит от экспрессии ниже по потоку фактора транскрипции NeuroD1 36, которая, вероятно прямым репрессором Atoh1 37. Несмотря на этот прогресс, и значительный продвижения в расшифровке биологическую основу клеток клеточного цикла выхода 38-42, фундаментальная молекулярный механизм (ы), которые лежат в основе решения для выхода из клеточного цикла и перехода от предшественника к дифференциации нейрона, и Associated постмитотическими касательной миграции во внутреннем EGL, а также позднее переключательрадиальной миграции, по-прежнему полностью понял. Это в значительной степени из-за экспериментальной труднорешаемости в EGL: это поздно развивается, и трудно целевой генной так как многие из тех же молекул нейрогенных также важны в начале жизни гранул предшественников в ромбической губы. Чтобы преодолеть эту проблему, многие авторы разработали в естественных условиях и экс естественных условиях электропорации как метода целевым послеродовой мозжечка у грызунов 43-48. Здесь мы пионерами использование экс виво электропорации в куриных изучать EGL, который представляет значительные преимущества с точки зрения стоимости и удобства. Наш метод электропорации и экс естественных среза культуры куриного мозжечка ткани использует ткани рассекают из эмбриональных день 14 цыплят на пике распространения EGL. Этот метод позволяет генетический адресности EGL независимо от ромбической губы и подготовить почву для генетического расчленения перехода от гранулпредшественников в постмитотичности гранул нейрона в мозжечке.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

Мозжечка внешний слой гранул (EGL) является местом крупнейшей транзитной усиления в развивающемся мозге, и отличная модель для изучения нейронов пролиферации и дифференцировки. Кроме того, эволюционные изменения ее пролиферативной способностью были ответственны за резкого расширения мозжечковой размера в амниот, что делает мозжечок отличная модель для Evo-Devo исследований позвоночных мозг. Учредительные клетки EGL, мозжечка гранул предшественники, также представляют собой значительную ячейку происхождения медуллобластомой, одной из самых распространенных педиатрической нейронов опухоли. После транзитного усиления, гранул прекурсоров мигрировать в радиальном направлении внутренней зернистого слоя мозжечка, где они представляют большой нейронов населения в зрелом мозге млекопитающих. У кур, пик распространения EGL происходит в конце второй недели беременности. В целях выявления генетической модификации к этому слою напик распространения, мы разработали метод для генетических манипуляций через экс естественных условиях электропорации мозжечка ломтиками от эмбриональных день 14 куриных эмбрионов. Этот метод повторяет несколько важных аспектов в естественных развития гранул нейронов и будет полезен в создании полного понимания пролиферации мозжечка гранул и дифференцировки клеток, и, следовательно, развитие мозжечка, эволюции и болезни.

В этом разделе приведены примеры результатов, которые могут быть получены с помощью электропорации ломтик и культуры мозжечка из эмбриональных день 14 кур. Рассечение мозжечка показано на рисунке 1, и электропорации камера установка показана на рису...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Мозжечка внешний слой гранул сайт крупнейшего транзитного усиления в развивающемся мозге. Здесь мы приводим протокол целевой генетической модификации к этому слою на пике распространения с использованием естественных условиях электропорации экс и культуры мозжечка ломтиками из эмбриональных день 14 куриных эмбрионов.

Экс Vivo культуры Чик мозжечка ломтиками и пространственно Целевые Электропорация ЗК прекурсоров

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Эффективное Перенос генов в Чик сетчатки для первичной культуры клеток исследований:<em&gt; Экс-ово</em&gt; Электропорация подход

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Оптимизированный<em&gt; Экс-ово</em&gt; Культивирование куриных эмбрионов в продвинутых стадиях разработки

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Экс Utero электропорации и Органотипической фрагмент Культура мыши ткани гиппокампа

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Экс Vivo культуры глотки Арки для изучения Сердце и мышцы предшественников и свою нишу

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Вперед генетический подход к Раскройте стрессоустойчивости генов в мышах - высокой пропускной экране в ЭС клетках

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Эпикардиального вырост Культура Анализ и<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Оценка эпикардиального производный миграции клеток

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Клональный анализ прекурсоров эмбриональных гемопоэтических стволовых клеток с использованием индекса одну ячейку Сортировка в сочетании с эндотелиальных клеток нишу Сопредседатель культуры

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

ТРИФОСФАТЫ опосредованной потери функции анализа в мозжечковой грануле клеток с помощью в утробе матери на основе электропорации перенос генов

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Ex естественных условиях перфузии плаценты грызунов

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Электропорация Метод для In Vivo Доставка плазмидной ДНК в взрослых зебрафиш теленефалион

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...