Name: ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

El método presentado en este artículo surgió de un trabajo financiado por el BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) y una beca de doctorado MRC (MH).

Nota: Todos los experimentos se realizaron con arreglo a la del Kings College de Londres, Reino Unido y las pautas de cuidado de animales Reino Unido Home Office. 1. Disección de e14 Cerebelo <ol><li> Incubar huevos marrones gallina embrionados a 38 ° C para el día embrionario 14. </li><li> Con una tijera de huevo decapitan embrión de pollo in ovo y quitar la cabeza a una placa de Petri que contiene el hielo frío PBS (Figura 1). </li><li> Con unas pinzas est?...

El protocolo informó aquí describe un método para la disección, la electroporación y cultivo de rebanadas de embrionario Día 14 cerebelo del polluelo. Este protocolo permite la focalización de electroporación para pequeñas regiones focales de la EGL, incluyendo aislados focalización de los lóbulos del cerebelo individuales. Permite el análisis genético y de imagen en alta resolución y conveniencia, ya un bajo costo en comparación con las técnicas establecidas en roedores 43-47. Este análisis ...

El cerebelo se encuentra en el extremo anterior de la parte posterior del cerebro y es responsable de la integración de procesamiento sensorial y motora en el cerebro madura, así como la regulación de los procesos cognitivos superiores 1. En los mamíferos y las aves, posee una morfología elaborado y está fuertemente foliada, un producto de la extensa amplificación de tránsito de progenitores durante el desarrollo que produce más de la mitad de las neuronas en el cerebro adulto. El cerebelo ha sido objeto de estudio para los neurobiólogos durante siglos y en la era molecular asimismo ha recibido mucha atención. Esto se refiere no sólo a su biología inherentemente interesante, pero también al hecho de que está fuertemente implicado en la enfermedad humana, incluyendo trastornos genéticos del desarrollo tales como trastornos del espectro autista 2 y lo más prominente que el cáncer cerebelosa, meduloblastoma 3, que es el cerebro pediátrica más frecuente tumor. Es importante destacar que es un excelente sistema modelo dentro which para estudiar la asignación de destino y la neurogénesis durante el desarrollo cerebral 4. En los últimos años, también se ha establecido como un sistema modelo para el estudio comparativo del desarrollo del cerebro, debido a la gran diversidad de formas de cerebelo visto a través de la filogenia de los vertebrados 10.5. El cerebelo se desarrolla desde el medio dorsal de rhombomere 1 en el cerebro posterior 11 y su desarrollo se compone de dos poblaciones progenitoras primarias, el labio rómbico y la zona ventricular. El labio rómbico se extiende alrededor de la región dorsal del neuroepitelio del cerebro posterior en la frontera con la placa de techo. Es el lugar de nacimiento de las neuronas excitadoras glutamatérgicas del cerebelo 12.14. La zona ventricular da lugar a las neuronas del cerebelo GABAérgicas inhibitorias, lo más prominente las neuronas de Purkinje grandes 14,15. Más adelante en el desarrollo (desde aproximadamente el día embrionario 13,5 en el ratón; e6 en chick 16), Progen glutamatérgicaITORS migran tangencialmente desde el labio rómbico y formar una capa pial de progenitores: una zona progenitor secundaria llamada la capa de gránulos externa (EGL). Es esta capa que sufre la extensa amplificación de tránsito que lleva a la gran cantidad de neuronas granulares se encuentran en el cerebro maduro. Proliferación en el EGL larga se ha relacionado con la localización sub-pial que resulta de la migración tangencial desde el labio rómbico 17, con el interruptor de salida del ciclo celular y la diferenciación neuronal de células progenitoras que se asocia con su salida de la capa de EGL exterior hacia el centro EGL 18. La migración tangencial extensivo de células granulares post-mitótico en el eje medial-lateral se produce en el medio y EGL interior 19, antes de la migración radial definitiva en la capa de gránulos interior de la corteza cerebelosa maduro. La migración de células del labio rómbico sobre la superficie cerebelosa es dependiente de la señalización de CXCL12 de la pia 20-22 de </sup&gt; Y células granulares expresan el receptor CXCR4 CXCL12. Su migración tangencial es, pues, que recuerda a la de la migración tangencial neocortical poblaciones interneuronas inhibitorias 23-25. Curiosamente, los estudios de microscopía electrónica 17 han sugerido que las células EGL con una morfología proliferativa mantienen contacto pial, que une el comportamiento celular con capacidad proliferativa en una forma que recuerda de los progenitores basales de la corteza de mamíferos 26. Esto se refleja en la estratificación antes mencionado de la EGL en tres subcapas que se definen por ambientes extracelulares distintos y donde los precursores de los gránulos tienen distinta expresión génica signaturas 18. Proliferación de los progenitores en el oEGL se produce con una distribución normal de tamaños de clones de tal manera que cuando los progenitores son individualmente marcadas genéticamente al final del desarrollo embrionario en el ratón, dan lugar a un promedio de 250-500 g mediana de postmitoticneuronas ranule 27,28. Proliferación depende de la señalización de SHH mitogénica de las neuronas de Purkinje subyacente 29-32. La capacidad de responder a SHH ha demostrado ser totalmente dependiente de la expresión autónoma de células del factor de transcripción Atoh1, tanto in vitro como in vivo 33 34,35. Del mismo modo, salida del ciclo celular y la diferenciación se ha demostrado que dependen de la expresión del factor de transcripción aguas abajo NeuroD1 36, que es probable que un represor directa de Atoh1 37. A pesar de este progreso, y un considerable avance en el desciframiento de la base biológica de células de salida del ciclo celular 38 a 42, el mecanismo molecular fundamental (s) que subyacen a la decisión de salir del ciclo celular y la transición de un progenitor a una neurona diferenciación y la la migración tangencial postmitotic asociada en el EGL interior, así como el interruptor de tardea la migración radial, siendo incompleta entendido. Esto es en gran medida debido a la intratabilidad experimental de la EGL: se está desarrollando tarde, y difícil de dirigir genéticamente ya que muchas de las mismas moléculas neurogénicos también son cruciales antes en la vida de los precursores de gránulos en el labio rómbico. Para superar este problema, numerosos autores han desarrollado in vivo y ex vivo electroporación como un método para dirigir el cerebelo postnatal en roedores 43-48. Aquí, pioneros en el uso de la electroporación ex vivo en chick para estudiar la EGL, que representa considerables ventajas en términos de coste y conveniencia. Nuestro método de electroporación y cultivo ex vivo rebanada de tejido cerebeloso chica utiliza el tejido diseccionado a partir del día embrionario 14 pollitos en el pico de la proliferación de EGL. Este método permite la orientación genética de la EGL independientemente del labio rómbico y será el escenario para la disección genética de la transición del gránuloprogenitoras de neuronas gránulo postmitotic en el cerebelo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

La capa externa del gránulo cerebelosa (EGL) es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo, y un excelente modelo para el estudio de la proliferación y diferenciación neuronal. Además, las modificaciones evolutivas de su capacidad proliferativa han sido responsables de la dramática expansión del tamaño del cerebelo en los amniotas, por lo que el cerebelo un excelente modelo para estudios de evo-devo del cerebro de los vertebrados. Las células que constituyen el EGL, progenitores granulares del cerebelo, también representan una célula importante de origen para el meduloblastoma, el tumor neuronal pediátrica más frecuente. Después de la amplificación de tránsito, los precursores de gránulos migran radialmente en la capa granular interna del cerebelo donde representan la mayor población neuronal en el cerebro mamífero maduro. En polluelo, el pico de la proliferación EGL se produce hacia el final de la segunda semana de gestación. Con el fin de apuntar a la modificación genética a esta capa enel pico de la proliferación, hemos desarrollado un método para la manipulación genética a través ex vivo electroporación de rebanadas cerebelo de embriones Día 14 embriones de pollo. Este método recapitula varios aspectos importantes de desarrollo in vivo de las neuronas gránulo y será útil en la generación de un conocimiento profundo de la proliferación de células granulares del cerebelo y la diferenciación, y por lo tanto del desarrollo del cerebelo, la evolución y la enfermedad.

En esta sección se ilustra ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante electroporación y la cultura del cerebelo rebanada de embriones Día 14 pollitos. La disección del cerebelo se ilustra en la Figura 1 y la cámara de electroporación establecido se muestra en la Figura 2. Se demuestra que es posible para electroporar y con éxito rebanadas cerebelares de cultivo, que retienen su estructura y morfolog...

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

La capa externa del gránulo del cerebelo es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para orientar la modificación genética a esta capa en el pico de la proliferación mediante electroporación ex vivo y la cultura de las rebanadas del cerebelo a partir de embriones Día 14 embriones de pollo.

Ex Vivo Cultura de polluelo cerebelosos Rebanadas y espacialmente focalizadas Electroporación de gránulos precursores celulares

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

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Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Enfoque electroporación

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

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Optimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

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Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

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Análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas embrionarias usando índice célula clasificación combinada con células endoteliales nicho cultura Co

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CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Mediada por CRISPR pérdida de función análisis en gránulo cerebeloso células usando en el útero electroporación basado en la transferencia de genes

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Método de electroporación para la entrega in Vivo de ADN plásmido en el telencéfalo adulto de pez cebra

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...