Name: ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Den metod som presenteras i den här artikeln uppstod från arbetet finansieras av BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) och MRC doktorand (MH).

Obs: Alla experiment utfördes med enlighet med Kings College London, Storbritannien och riktlinjerna för brittiska hemmakontoret djurskötsel. 1. Dissektion av e14 Cerebellum <ol><li> Inkubera brun befruktade hönsägg vid 38 ° C till embryonal dag 14. </li><li> Använda ägg sax halshugga kycklingembryo in ovo och ta bort huvudet till en petriskål med iskall PBS (Figur 1A). </li><li> Med användning av standard pincett, gör snitt bakom varje öga hela vägen...

Protokollet redovisas här beskriver en metod för att dissekera, electroporating och odling skivor embryonala dag 14 lillhjärnan från ungen. Detta protokoll möjliggör målsökning av elektroporering till små bränn regioner i EGL, inklusive isolerade inriktning på enskilda cerebellära lober. Det möjliggör genetisk analys och bildbehandling med hög upplösning och bekvämlighet, och till en låg kostnad jämfört med etablerade tekniker i gnagare 43-47. En sådan analys är för närvarande inte mö...

Lillhjärnan sitter vid den främre änden av hindbrain och är ansvarig för integrationen av sensorisk och motorisk bearbetning i den mogna hjärnan samt reglering högre kognitiva processer 1. I däggdjur och fåglar, besitter det en utarbetad morfologi och är kraftigt folierade, en produkt från omfattande transit amplifiering av progenitorer under utvecklingen som producerar över hälften av nervceller i den vuxna hjärnan. Lillhjärnan har varit föremål för undersökning för neurobiologists i århundraden och den molekylära eran har också fått stor uppmärksamhet. Detta gäller inte bara dess inneboende intressanta biologi, men också till det faktum att det är starkt inblandad i mänskliga sjukdomar inklusive utvecklings genetiska störningar såsom autismspektrumstörningar 2 och mest framträdande lillhjärnan cancer, medulloblastom 3, vilket är den vanligaste barn hjärna tumör. Viktigt är det ett utmärkt modellsystem inom which att studera ödet tilldelning och neurogenes under hjärnans utveckling 4. Under de senaste åren har det också etablerats som ett modellsystem för jämförande studie av hjärnans utveckling, på grund av den enorma mångfald av cerebellära former ses över ryggradsdjur fylogeni 5-10. Lillhjärnan utvecklas från den dorsala halv av rhombomere en i bakhjäman 11 och utvecklingsmässigt består av två primära gångarpopulationer, den rombiska läppen och den ventrikulära zonen. Den rombiska läpp sträcker sig runt rygg regionen av neuroepithelium av bakhjäman vid gränsen med takplåt. Det är födelseplatsen för de glutamaterg excitatoriska nervceller i lillhjärnan 12-14. Den ventrikulära zonen ger upphov till de hämmande GABAergic cerebellära neuroner, framförallt de stora Purkinje nervceller 14,15. Senare under utveckling (från ca embryonala dag 13,5 i mus, e6 i chick 16), glutamaterga Progennärer migrera tangentiellt från rombiska läppen och bildar en pial lager av stamceller: en sekundär stamfader zon kallas yttre granulskiktet (EGL). Det är detta skikt som genomgår omfattande transit förstärkning som leder till det stora antalet granulära neuroner som finns i den mogna hjärnan. Spridning i EGL har länge kopplats samman med under pial plats som resultat av tangent migrering från rombiska läppen 17, med övergången till cellcykeln exit och neuronal differentiering av stamceller som i samband med deras utträde ur yttre EGL skiktet i mitten EGL 18. Omfattande tangentiell migration av post mitotiska granulceller i medial-lateral axel uppträder i mitten och inre EGL 19, före slutlig radiell migrering in i det inre granulatskiktet av det mogna cerebellär cortex. Migration av celler från rombiska läpp över lillhjärnan ytan är beroende av CXCL12 signalering från Pia 20-22 </sup&gt; Och granulceller uttrycker CXCL12 receptorn CXCR4. Deras tangentiell migration är således påminner om den hos hjärnbarkens tangentiellt migrera hämmande interneuronen populationer 23-25. Intressant, elektronmikroskopiska undersökningar 17 har föreslagit att EGL celler med en proliferativ morfologi hålla pial kontakt förbinder cellens beteende med proliferativ kapacitet på ett sätt som påminner om de basala stamfäder för däggdjurs cortex 26. Detta återspeglas i den tidigare nämnda skiktning av EGL i tre underskikt som definieras av olika extracellulära miljöer och där granulat prekursorer har distinkta genuttryck signaturer 18. Proliferation av progenitorceller i oEGL inträffar med en normal fördelning av klon storlekar så att när progenitorer är individuellt genetiskt märkt vid slutet av embryonal utveckling hos mus, ger de upphov till en median genomsnitt 250-500 postmitotisk granule neuroner 27,28. Spridning är beroende av mitogen SHH signalering från underliggande Purkinje neuroner 29-32. Förmågan att svara på SHH har visat sig vara helt beroende av cell självständig uttryck av transkriptionsfaktorn Atoh1, både in vitro 33 och in vivo 34,35. På samma sätt har cellcykel exit och differentiering visats vara beroende av expressionen av nedströms transkriptionsfaktorn NeuroD1 36, vilket sannolikt direkt repressor Atoh1 37. Trots dessa framsteg, och betydande framsteg i att dechiffrera cellen biologiska grunden för cellcykel exit 38-42, den grundläggande molekylära mekanismen (s) som ligger till grund för beslutet lämna cellcykeln och att övergå från en föregångare till en differentierande neuron, och tillhörande postmitotisk tangentiell migration i den inre EGL liksom senare switchradiell migration, fortfarande ofullständigt känd. Detta är till stor del på grund av den experimentella intractability av EGL: det är sent utveckling, och svåra att rikta genetiskt eftersom många av samma neurogena molekylerna är också avgörande tidigare i livet av granulat prekursorer på rombiska läppen. För att övervinna detta problem, har talrika författare utvecklats in vivo och ex vivo elektroporering som en metod för att rikta den postnatala cerebellum hos gnagare 43-48. Här, vi pionjär användningen av ex vivo elektroporering i chick att studera EGL, som representerar betydande fördelar i fråga om kostnader och bekvämlighet. Vår metod för elektroporering och ex vivo bit kultur av chick cerebellär vävnad använder vävnad dissekerades från embryonala dag 14 kycklingar på toppen av EGL spridning. Denna metod tillåter genetisk riktat EGL oberoende av rombiska läppen och kommer att sätta scenen för genetisk dissektion av övergången från granulatstamfader till postmitotisk granulat neuron i lillhjärnan.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

Lillhjärnan yttre granulskiktet (EGL) är platsen för den största transit förstärkningen i den växande hjärnan, och en utmärkt modell för att studera neuronal proliferation och differentiering. Dessutom har evolutionära förändringar av sin proliferativa förmåga varit ansvarig för den dramatiska expansionen av cerebellär storlek i amnioternas, vilket gör lillhjärnan en utmärkt modell för evo-devo studier av ryggradsdjur hjärnan. De ingående cellerna i EGL, cerebellära granulatföregångare, också utgöra en betydande cell ursprungs för medulloblastom, den vanligaste pediatriska neuronal tumör. Efter att ha passerat förstärkning, granulat prekursorer migrerar radiellt i den inre granulära skiktet av lillhjärnan där de utgör den största neuronala befolkningen i den mogna däggdjurshjärnan. I chick inträffar toppen av EGL spridning i slutet av den andra graviditetsveckan. För att rikta genetisk modifiering till detta skikt påtoppen av spridning, har vi utvecklat en metod för genetisk manipulation genom ex vivo elektroporering av cerebellum skivor från embryonala dag 14 kycklingembryon. Denna metod rekapitulerar flera viktiga aspekter av in vivo granulat neuron utveckling och kommer att vara användbara för att generera en grundlig förståelse av cerebellär granulat celltillväxt och differentiering, och därmed lillhjärnan utveckling, evolution och sjukdom.

Det här avsnittet visar exempel på resultat som kan uppnås med hjälp av skiva elektroporering och kultur av lillhjärnan från embryonala dag 14 chick. Dissektionen av lillhjärnan illustreras i figur 1 och elektroporeringskammaren inrättat visas i figur 2. Vi visar att det är möjligt att elektroporera och framgångsrikt kultur cerebellära segment, som bibehåller deras struktur och cellulära morfologier in ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Lillhjärnan yttre granulskiktet är platsen för den största transit förstärkningen i den växande hjärnan. Här presenterar vi ett protokoll för att rikta genetisk modifiering till detta skikt på toppen av spridning med hjälp av ex vivo elektroporering och kultur cerebellär skivor från embryonala dag 14 kycklingembryon.

Ex vivo Kultur av Chick Cerebellar skivor och rumsligt riktade elektroporering av Granulat cellprekursorer

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick näthinnor för Primär cellkulturstudier: En<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Tillvägagångssätt

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimerad<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Odling av kycklingembryon till avancerade stadier av utveckling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Elektroporation och Organotypic Slice Kultur av Mouse hippocampus Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex vivo Kultur av Pharyngeal Arches att studera hjärta och muskelstamfäder och deras nisch

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Framåt Genetisk strategi för Avslöja Stress resistensgener i möss - En hög kapacitet skärm i ES-celler

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardiella utväxt Kultur-analys och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Bedömning av epikardiella-härledda cellmigration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonal analys av hematopoetiska stamceller från embryon prekursorer använder enstaka Cell Index sortering kombinerade med endotelceller nisch samtidig kultur

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-medierad förlust av funktion analys i lillhjärnan Granule celler med hjälp av In Utero elektroporation-baserade genöverföring

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Ex vivo-perfusion av gnagare placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Elektroporation metod för in vivo leverans av plasmid DNA i den vuxna Zebrafish telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...