Name: ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Bu makalede sunulan yöntem BBSRC BB / tarafından finanse edilen çalışma ortaya çıktı I021507 / 1 (TB, RJTW) ve MRC doktora öğrencilik (MH).

Not: Bütün deneyler King College London, İngiltere ve İngiltere Home Office hayvan bakımı kurallarına uygun gerçekleştirilmiştir. E14 Serebellumunda 1. Diseksiyon <ol><li> Embriyonik Gün 14-38 ° C&#39;de kahverengi döllenmiş tavukların yumurtalarını kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Kullanımı yumurta makas ovo civciv embriyo başını kesmek ve buz PBS (Şekil 1A) içeren bir Petri baş kaldırmak. </li><li> Standart forseps kullanarak, gözler...

Burada rapor edilen protokol kesme electroporating ve piliç embriyonik gün 14 beyincik dilimleri kültürlenmesi için bir yöntemi anlatmaktadır. Bu protokol, bireysel serebellar lob izole hedefleme dahil EGL küçük odak bölgelerinde, elektroporasyon hedefleme sağlar. Bu yüksek çözünürlük ve kolaylık genetik analiz ve görüntüleme sağlar ve düşük maliyetle kemirgenler 43-47 kurulan tekniklere göre. Böyle bir analiz sonucu değişiklikler EGL etkileyebilir demektir uzatılmış gelişim ...

Beyincik Beyin ön ucunda oturur ve olgun beyindeki duyu ve motor işleme entegrasyonu sorumlu yanı sıra yüksek bilişsel süreçleri 1 düzenleyen olduğunu. Memeliler ve kuşlar, bu yetişkin beyindeki nöronların yarıdan fazlası ürettiği gelişimi sırasında, atalarıdır geniş geçiş amplifikasyon ürünü ayrıntılı bir morfoloji sahip ve ağır foliated edilir. Beyincik yüzyıllardır Nörobiyologlar ve moleküler çağda çalışmanın konusu olmuştur aynı şekilde önemli dikkat çekmiştir. Bu, özünde ilginç biyoloji, ama aynı zamanda ağır gibi en yaygın pediatrik beyin otizm spektrum bozuklukları 2 ve en belirgin serebellar kanser, medulloblastoma 3 gibi gelişimsel genetik bozukluklar da dahil olmak üzere insanlara hastalık bulaştıran gerçeği değil sadece ilgilidir tümör. Önemlisi, bu wh içinde mükemmel bir model sistemich beyin gelişimi 4 sırasında kaderi tahsisi ve nörogenezi incelemek için. Son yıllarda, aynı zamanda omurgalı phylogeny 5-10 arasında görülen serebellar formların büyük çeşitlilik nedeniyle, beyin gelişiminin karşılaştırmalı çalışma için bir model sistem olarak kurulmuştur. Beyincik Beyin 11&#39;de rhombomere 1 dorsal yarısından itibaren gelişir ve gelişimsel iki ana progenitör popülasyonları, eşkenar dudak ve ventriküler zon oluşur. Eşkenar dudak çatı plakası sınırındaki Beyin ve neuroepithelium dorsal bölgenin çevresinde uzanır. Bu beyincik 12-14 glutamaterjik eksitatör nöronların doğduğu yerdir. Ventriküler bölge en belirgin inhibitör GABAerjik serebellar nöronların, büyük Purkinje nöronları 14,15 yol açar. Daha sonra geliştirme (fare embriyonik gün 13.5 ila yaklaşık, civciv 16 e6), glutamaterjik ProGenitors eşkenar dudaktan teğet göç ve atalarıdır bir pial bir tabaka oluşturur: ikincil progenitör bölgesi dış granül tabakası (EGL) çağırdı. Olgun beyinde bulunan granül nöronların büyük sayılara neden kapsamlı geçiş amplifikasyon uğrar bu tabakadır. EGL çoğalma uzun hücre döngüsü çıkışı ve ortasına dış EGL katmandan kendi çıkış ile bağlantılıdır progenitörlerin nöronal farklılaşma anahtarıyla, eşkenar dörtgen şeklinde dudak 17 Tanjansiyal göç kaynaklanan alt Pial konumu ile bağlantılı olmuştur EGL 18. Medial-lateral ekseninde post-mitotik granül hücrelerinin Geniş teğet göç olgun serebellar korteksin iç granül tabakası içine son radyal göç öncesi, orta ve iç EGL 19 oluşur. Serebellar yüzey üzerinde eşkenar dudak hücrelerin göç pia 20-22 den CXCL12 sinyalizasyon bağlıdır </sup&gt; Ve granül hücrelerinin CXCL12 reseptörü CXCR4 ifade eder. Onların teğet migrasyon inhibitör interneuron popülasyonları 23-25 ​​göç neokortikal teğet o böylece anımsatıyor. Şaşırtıcı, elektron mikroskobik çalışmalar 17 proliferatif morfolojiye sahip EGL hücreleri memeli korteks 26 bazal atalarıdır anımsatan tarzda çoğalma yeteneği ile hücre davranışını bağlayan, pial temas halinde olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu 18 imzaların granül ön farklı gen ekspresyonunu sahip farklı hücre dışı durumlar tarafından tanımlanan üç alt katmanlar halinde EGL yukarıda belirtilen tabakalaşma yansıtılır. OEGL progenitörlerin Çoğalma atalarıdır bireysel genetik fare embriyonik gelişim sonunda etiketli, onlar 250-500 postmitotic g medyan ortalama doğuran şekilde klon boyutları normal dağılım oluşurranule nöronlar 27,28. Çoğalma Purkinje nöronları 29-32, altta yatan mitojenik SHH sinyallemesinin bağlıdır. SHH&#39;nin cevap verme transkripsiyon faktörünün Atoh1 hücre bağımsız ekspresyonu üzerine tamamen bağlı olduğu gösterilmiştir, in vitro ve in vivo 33 34,35 hem de. Benzer şekilde, hücre döngüsü çıkışı ve farklılaşması olasılıkla Atoh1 37 doğrudan bir bastırıcısıdır alt transkripsiyon faktörü NeuroD1 36, ifadesine bağımlı olduğu gösterilmiştir. Hücre döngüsü çıkışına 38-42 hücre biyolojik temelini çözmekte bu ilerleme ve önemli ilerleme olmasına rağmen, karar altında yatan temel moleküler mekanizma (lar) hücre döngüsünü çıkmak için bir ayırt nöron bir progenitör geçiş için, ve İç EGL de ilişkili postmitotic teğet göç yanı sıra, daha sonra anahtarradyal göç, anlaşılan eksik kalır. Bu, EGL deneysel inatçılığı büyük ölçüde: geç gelişen ve aynı nörojenik moleküllerin pek çoğu önemli önceki granül öncülerinin hayatta eşkenar paralel dudak altındadır beri genetik hedef zordur. Bu sorunu aşmak için, sayısız yazar kemirgenler 43-48 doğum sonrası beyincik hedeflemek için bir yöntem olarak in vivo ve ex vivo elektroporasyon gelişmiştir. Burada, maliyet ve kolaylık açısından önemli avantajlar temsil EGL, incelemek için civciv ex vivo elektroporasyon kullanımını öncülük. Elektroporasyon ve civciv serebellar doku ex vivo dilim kültürü Bizim yöntemi 14 civciv EGL çoğalması zirvesinde embriyonik Gün doku disseke kullanır. Bu yöntem, eşkenar dudak bağımsız EGL genetik hedefleme izin verir ve granül geçişin genetik diseksiyon için sahne koyacaktırbeyincik postmitotic granül nöron progenitör.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

Serebellar dış granül tabakası (EGL) gelişmekte olan beyinde büyük Transit büyütme site ve nöronal çoğalmasını ve farklılaşmasını çalışmak için mükemmel bir model. Buna ek olarak, çoğalma yeteneği evrimsel değişiklikler beyinciği omurgalı beynin evo-devo çalışmaları için mükemmel bir model haline amniotları serebellar büyüklükte dramatik genişleme sorumlu olmuştur. EGL kurucu hücreleri, serebellar granül ataları da, Medulloblastoma için en yaygın pediatrik nöronal tümör kökenli önemli bir hücreyi temsil etmektedir. Transit amplifikasyon ardından, granül öncüleri olgun memeli beyninde büyük nöronal nüfusu temsil beyincik iç granüler tabaka içine radyal göç. Civciv, EGL çoğalması pik gebelik ikinci hafta sonuna doğru ortaya çıkar. Bu tabakaya genetik değişimine hedeflemek içinproliferasyonunun en yüksek, embriyonik gün 14 civciv embriyolarından serebellum dilimleri ex vivo elektroporasyon yoluyla genetik manipülasyonu için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, in vivo granül nöron geliştirme birkaç önemli yönlerini özetlediği ve beyincik granül hücre çoğalması ve farklılaşması tam bir anlayış oluşturmada yararlı olacaktır ve böylece beyincik geliştirme, evrim ve hastalığın.

Bu bölüm, embriyonik gün 14 hatundan kesit elektroporasyon ve beyincik kültürü kullanılarak elde edilebilir sonuçlarının örneklerini göstermektedir. Beyincik diseksiyon Şekil 1 içinde tasvir edilmektedir ve ayarlamak elektroporasyon haznesi, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Bu başarılı in vitro (Şekil 3A), yapı ve hücresel morfolojik korumak kültür serebellar dilimleri, elektroporasyona ve mümkün olduğ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir<em&gt; Eski-ovo</em&gt; Elektroporasyon Yaklaşımı

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimize<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardiyal dışsal gelişimi Kültürü Deneyi ve<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Epikardiyal türetilmiş Hücre Göç Değerlendirilmesi

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Rodent placenta 'nın ex vivo perfüzyon

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Yetişkin Zebrafish Telencephalon Plazmid DNA In Vivo Teslim için Elektroporasyon Yöntemi

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...