Name: chromatin immunoprecipitation assay for the identification of arabidopsis protein-dna interactions in vivo
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo at JoVE.com

The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Econom&#236;a y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).

1. Crosslinking של צמח החומר (1 שעה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול קווי ארבידופסיס השתמשו בניסוי (הסוג בר - WT - לעומת מוטציות, ו / או קווים המבטאים את הגרסה מתויגת של חלבון עניין שלך לעומת קווים המבטאים את התג לא התמזגו לכל חלבון) ל12-18 ימים בצלחות פטרי גד...

<ol>
	<li>Andres, F., Coupland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+flowering+responses+to+seasonal+cues.">The genetic basis of flowering responses to seasonal cues.</a> Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).</li><li>Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+flowering+by+ambient+temperature.">Control of flowering by ambient temperature.</a> J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).</li><li>Jarillo, J. A., Pi&#241;eiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+is+everything+in+plant+development.+The+central+role+of+floral+repressors.">Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors.</a> Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).</li><li>Pajoro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+(r)evolution+of+gene+regulatory+networks+controlling+Arabidopsis+plant+reproduction:+a+two-decade+history.">The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history.</a> J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).</li><li>He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+regulation+of+flowering.">Chromatin regulation of flowering.</a> Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).</li><li>Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodeling+in+plant+development.">Chromatin remodeling in plant development.</a> International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).</li><li>Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+protocol+for+studying+histone+modifications+in+Arabidopsis+plants.">An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).</li><li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3, 11 (2007).</li><li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+of+plant+transcription+factors+followed+by+sequencing+(ChIP-SEQ)+or+hybridization+to+whole+genome+arrays+(ChIP-CHIP).">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP).</a> Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).</li><li>Gomez-Mena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=early+bolting+in+short+days:+An+Arabidopsis+mutation+that+causes+early+flowering+and+partially+suppresses+the+floral+phenotype+of+leafy.">early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy.</a> Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).</li><li>Pi&#241;eiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EARLY+BOLTING+IN+SHORT+DAYS+is+related+to+chromatin+remodeling+factors+and+regulates+flowering+in+Arabidopsis+by+repressing+FT.">EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT.</a> Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).</li><li>Lopez-Gonzalez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-dependent+repression+of+the+Arabidopsis+floral+integrator+genes+involves+plant+specific+PHD-containing+proteins.">Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins.</a> Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. , e3998 (2012).</li><li>Wong, M. L., Medrano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+for+mRNA+quantitation.">Real-time PCR for mRNA quantitation.</a> Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).</li><li>Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+formaldehyde+fixation+and+immunoprecipitation+technique+for+studying+protein-DNA+interactions.">A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions.</a> Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).</li><li>Yu, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISTONE+DEACETYLASE6+interacts+with+FLOWERING+LOCUS+D+and+regulates+flowering+in+Arabidopsis.">HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+histone+H3+lysine+9+acetylation+and+dimethylation+in+Arabidopsis+reveals+correlation+between+multiple+histone+marks+and+gene+expression.">Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression.</a> Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).</li><li>Lafos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+H3K27+trimethylation+during+Arabidopsis+differentiation.">Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation.</a> PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).</li><li>Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+cells+and+isolation+of+high-quality+RNA+after+cryosectioning.">Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning.</a> Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li><li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+genes+of+the+MADS+transcription+factor+SEPALLATA3:+integration+of+developmental+and+hormonal+pathways+in+the+Arabidopsis+flower.">Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower.</a> PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).</li></ol>

פרוטוקול השבב המתואר כאן הוא טכניקה לשחזור ורבה עוצמה כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים ורצפי DNA ספציפיים in vivo בצמחי ארבידופסיס. זיהוי מוצלח של אתרי קישור לחלבונים של עניין מחייב בחירה נאותה של איברי צמח או שלבי התפתחות שבו האינטראקציות הרלוונטיות למעשה מתרחשות...

בשנים האחרונות מגוון רחב של כלים גנטיים, מולקולריים והגנומי פותחו בthaliana ארבידופסיס מיני מודל. טכנולוגיה זו יש להקל מאוד את ההתקדמות בהבנה כיצד התפתחות צמח מוסדרת. בין התהליכים התפתחותיים למדו באמצעות ארבידופסיס כמודל, הבקרה הגנטית של זמן פריחה כבר נותחה בהרחבה. מחקרים אלה הראו כי צמחים לווסת בדיוק מאוד הזמן של פריחה בתגובה לרמזים אנדוגני כגון הורמונים והגיל של הצמח, וגם לאותות סביבתיים כגון photoperiod וטמפרטורה לסנכרן פריחת זמן עם מחזור הטבעי של עונות 1, 2. הבידוד והאפיון של מוטציות ארבידופסיס עם שינויים בזמן של פריחה היה הקובע בחשיפת רשת מורכבת של גנים המווסתים את זמן הפריחה בתגובה לגורמי אנדוגני והסביבתיים. מעגלים הגנטיים אלהמשולב ברמה של כמה גני הורים הפועלים כמתגים של פריחה, והעיתוי של הייזום הפרחוני המדויק תלוי באיזון של פריחת קידום ומדחיק את פעילות שעובדות במעלה הזרם של גני אינטגרטור הפרחוני 1,3. האפיון הפונקציונלי של הגנים שזוהו על תפקידם בשליטה של ​​ייזום פריחה, נעזר בשימוש האחרון של גישות הגנומי, חשפו את התפקיד המרכזי של רגולציה תעתיק באפנון של זמן פריחה. למעשה, רבים מהגנים ההורים של שעתוק לקודד פריחת גורמי 4. בנוסף, מספר מתחמי חלבון שיפוץ הכרומטין להשפיע על הביטוי של גני הורים של פריחה. מספר מוטציות ארבידופסיס המבודדים לזמן הפריחה שינה התברר לשאת מוטציות בגני מקודדי מגוון של מכפילי הכרומטין. remodelers הכרומטין שונה שמציג את השינויים בposttranslational Histonדואר זנבות, למקם nucleosomes ביחס ל- DNA או להחליף ההיסטונים הקנונית על ידי גרסאות היסטון נחוצים לוויסות הנכונה של הפריחה בארבידופסיס 5,6. חלק מפעילויות שיפוץ הכרומטין אלה לזרז את התצהיר או הסרת שינויים קוולנטיים כגון acetylation או מתילציה בשאריות היסטון ספציפיות. סימני היסטון אלה מוכרים במיוחד על ידי effectors מיוחדת שמגייסות מתחמים אחרים שיפוץ הכרומטין, גורמי שעתוק או רכיבים של מכונות תעתיק להסדיר את פעילות תעתיק של גנים פורחים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מאפשר זיהוי של in vivo אתרים לחלבונים של עניין מחייב DNA (איור 1). הליך זה מנצל את היכולת של כימיקלים מסוימים לקישור צולב חלבונים לדנ&quot;א. מתחמי DNA החלבון וכתוצאה מכך ניתן immunoprecipitated אז באמצעות אגא נוגדנים הספציפיגורמי שעתוק Inst, מחייב חלבוני הכרומטין, או שינויים מסוימים וepitopes Heterologous (המכונים &quot;תגים&quot; בדרך כלל) שצורפו לחלבון של בחירה. ה- DNA מטוהר מimmunoprecipitates אלה יכול לשמש כתבנית בתגובות PCR (qPCR) כדי להעריך להעשרה של רצפים מסוימים של עניין. בדרך זו, ניתן להקים אתרי הקישור של גורמי שעתוק או ההפצה של סימני היסטון בגנים מסוימים 7,8. בנוסף, בשילוב עם הדור הבא רצף (NGS) המאפשר רצף מקביל מאסיבי, טכנולוגיית שבבים הפכה אפשרית זיהוי הגנום של אתרי הקישור של גורמי שעתוק כמו גם נופי epigenomic הסרת לוט משינויי היסטון. יתר על כן, הניתוח בו זמני של ביטוי גנים מאפשר ניטור איך המחייב של רגולטורי תעתיק או התצהיר של סימני היסטון מסוימים לתאם עם תעתיק פעילויותיוty של גנים 9. השימוש בפרוטוקולי שבב בארבידופסיס אפשר להעריך את ההשפעה שמגוון של רגולטורי תעתיק יש בארגון הכרומטין של גני הורים של פריחה וכיצד שינויים המבניים אלה משפיעים על ביטוי גני 5,6. תוצאות קודמות הראו כי הנעילה מוקד ארבידופסיס מוקדם בימים קצרים (EBS) פועלת כמדכאת של פריחה ומוטציות בגן זה מופע ההאצה של פריחה וגברת ביטוי של גן ההורים של FT פריחה. בנוסף, מוטציות פסד של הפונקציה בFT לדכא באופן מלא את הפנוטיפ הפריחה המוקדם של הצמחים מוטנטים EBS, המצביע על כך FT דרוש לפריחה המוקדמת של מוטציות EBS ושEBS הוא הכרחי לדיכוי של גן הורים זה של פריחת 10 , 11. EBS מקודד חלבון המכיל PHD שיכול להיקשר באופן ספציפי di- היסטון H3 וtrimethylated בהליזין דואר 4 שאריות (H3K4me2 / 3), המצביעות על תפקיד לEBS בדיכוי בתיווך הכרומטין של 12 FT. השימוש בגישת השבב הוכיח כי EBS החלבון המכיל PHD ארבידופסיס 10,11 נקשר אזורי רגולציה של FT גן אינטגרטור הפרחוני להדחיק ביטויה 12. נתונים נוספים שהושגו באמצעות השימוש בטכנולוגיית השבבים הראו כי נדרש חלבון זה כדי לשמור על רמות נמוכות של acetylation היסטון, סימן היכר של שעתוק פעיל, בהכרומטין של גן הורים זה של פריחה בשלבים ראשוניים של פיתוח ארבידופסיס. תצפיות אלה, יחד עם נתונים ביטוי גנטי וגן, להוכיח שיש חלבון זה ארבידופסיס PHD המכיל תפקיד מרכזי בכוונון העדין של זמן פריחה על ידי ויסות הביטוי של גן אינטגרטור הפרחוני 12 FT. העבודה המוצגת כאן מספקת שיטה מותאמת שימושית לא רק לניתוח של ההיסטונים אלא גם לאחריםהכרומטין קשורים חלבונים, ועם התייעלות וצמצום זמן ניסוי. יתר על כן, דו&quot;ח זה מדגים כיצד השימוש בפרוטוקולי שבב סיפק תובנות חדשות את הקשר בין שינויים בשינויי הכרומטין ומדינות תעתיק של גני צמח, וכיצד מנגנונים אלה בתיווך הכרומטין של השפעת שליטת ביטוי גנים בתחילת הפריחה בארבידופסיס.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25</td>
			<td>Use under the fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Standard sonication device</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01010002 (UCD200TO)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#174; magnetic beads coupled with protein A or protein G</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10003D/10001D</td>
			<td>Check manufacturer&#8217;s manual for antibody affinity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 Surfact-Amps&#8482; Detergent Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>85112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mouse, rat, rabbit&#8230;)-IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15400001, C15420001, C15410206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack - DynaMag&#8482;-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex&#174; 100 Resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#174; 480 SYBR Green I Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation assay for the identification of arabidopsis protein-dna interactions in vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

ניתן בחרו לצאת שמונה שלבים עיקריים בפרוטוקול שבב זה לזיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א in vivo, כוללים גידול וקציר של חומר צמחי, cross-linking של הכרומטין, בידוד הכרומטין, פיצול הכרומטין, בידוד סלקטיבי של המתחמים בין ה- DNA ו החלבון של עניין על ידי immunoprecipitation, עיכול חלבון, ט...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

immunoprecipitation הכרומטין הוא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי DNA מחייבת אתרים של חלבוני ארבידופסיס in vivo. הליך זה כולל הכרומטין המקשר בין-ופיצול, immunoprecipitation עם נוגדנים נגד סלקטיבית החלבון של עניין, וניתוח qPCR של DNA הקשור. אנו מתארים assay שבב פשוט מותאם לצמחי ארבידופסיס.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...