Name: metabolic characterization of polarized m1 and m2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis
Uploaded: 2015-11-28T14:00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Jan Van den Bossche received a Junior Postdoc grant from the Netherlands Heart Foundation (2013T003) and a VENI grant from ZonMW (91615052). Menno de Winther is an Established Investigator of the Netherlands Heart Foundation (2007T067), is supported by a Netherlands Heart Foundation grant (2010B022) and holds an AMC-fellowship. We also acknowledge the support from the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences for the GENIUS project &#8220;Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis&#8221; (CVON2011-19). We acknowledge Seahorse Bioscience for making open access publication possible. The authors thank Riekelt Houtkooper and Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) for all previous assistance with the Seahorse analyzer.

1. Los macrófagos derivados de médula ósea El cultivo y la polarización de hueso <ol><li> Día 0: Aislar fémur y la tibia huesos de 6-10 semanas de edad ratones de interés (C57BL / 6 en este ensayo). </li><li> Retire el tejido muscular de los huesos y colocar los huesos en un 9 cm petri plato lleno de helado de PBS. </li><li> La transferencia de los huesos a un plato de Petri de 9 cm llena de etanol al 70% y agitar suavemente la placa durante 30 segundos. </li><li> La transferencia de los huesos a un nuevo máximo 9 cm placa de Petri llena de PBS estéril enfriado con hielo. </li><li> Cortar el fémur y la tibia en ambos extremos con tijeras estériles. </li><li> Lavar los huesos con 10 ml de PBS estéril enfriado con hielo utilizando una jeringa de 10 ml y una aguja de 25 G. Recoger la médula ósea en un tubo de 50 ml. </li><li> Transferencia de las células de médula ósea a un nuevo tubo de 50 ml utilizando una aguja de 23 G. </li><li> Repita este paso con una aguja de 25 G. Nota: Se necesitan estos pasos para eliminar grupos de células y restos óseos. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Deseche el supernatant y resuspender las células en medio de 40 ml de células de cultivo (RPMI-1640 más 2 mM L-glutamina, 10% de FCS, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml) y 15% filtrada L-929 celular ( ATCC, CCL-1) medio -conditioned que contiene M-CSF (o alternativamente 10 ng ml M-CSF / recombinante en lugar de L-929 medio celular acondicionado). Nota: La generación de medio celular acondicionado L-929 se detalló anteriormente en esta revista en 2013. 11 </li><li> Cultura de las células de un ratón en dos 15 cm placas de Petri (no utilice placas de cultivo tratadas con células desde los macrófagos no se separará de este plástico) en 20 ml de medio de cultivo por la placa en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Añadir 10 ml medio de cultivo celular fresco en días 3, sin la eliminación de los 20 ml de medio de cultivo celular mayor. </li><li> Sustituir el viejo medio de cada placa con 20 ml de medio de cultivo fresco en el día 6. Hacer esto, también se eliminarán las células no adherentes. </li><li> Día 8: <ol><li> Separe las células incubándolas 5 men por lo 37 ° C en 10 ml de solución salina de citrato (cloruro de potasio 135 mM más citrato de sodio 15 mM en H 2 O, autoclave) y se lava con 10 ml de PBS. Cuente macrófagos óseas maduras derivadas de la médula (BMDM) el día 8 usando un contador de células. </li><li> Verificar la formación de maduro (CD11b + F4 / 80 +) BMDM mediante inspección visual o por citometría de flujo. Bloque 10 5 células con anti-CD16 centésima / CD32 en PBS durante 20 minutos en 100 l de PBS, se incuban con 1/200 anti-CD11b-FITC además 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 a TA, lavado y analizar por citometría de flujo. Nota: los macrófagos derivados de médula ósea de ratón El cultivo se ha publicado en detalle anteriormente en esta revista por Ying et al 11.. </li></ol></li><li> Sembrar las células 50.000 (recuentos de células óptimas necesitan ser optimizados) por pocillo en una microplaca de cultivo de células en 100 l de medio de cultivo. No sembrar células en los pozos de corrección de fondo (A1, A12, H1, H12) y poner medio solamente (sin células) en estos pozos. Sugerencia: Mantenga la pipeta en un ángulo uncombate de la mitad del lado de los pozos para la capa celular más homogénea. </li><li> Permita que las células se asienten a temperatura ambiente en una campana de cultivo de células durante 1 hora. Esto promoverá la distribución uniforme de células y reducir los efectos de borde. Supervisar el cumplimiento con un microscopio y la cultura en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Tres horas después de la siembra, estimular las células durante 24 horas con 10 ng / ml de LPS, o 20 ng / ml recombinante de ratón IL-4 para generar M1 o M2 macrófagos, respectivamente. Incluir los macrófagos no tratados naïve (M0) como control. Evaluar adecuada M1 y M2 macrófagos polarización mediante la medición de la secreción de IL-6, IL-12 inducida por LPS, TNF (ELISA) y IL-4 inducida por la arginasa-1 actividad y / o MMR (CD206) y MGL (CD301) expresión en la superficie (citometría de flujo) como se describió anteriormente 3,11. Nota: En este punto, las células pueden ser (pre) tratados con compuestos con farmacológicas de interés o macrófagos pueden ser estimulados con otros factores. Dado que, la variación entre pocillos separados podría ser substantial, es recomendable usar al menos 4 e idealmente 6 pocillos por condición. </li></ol> 2. Preparación del ensayo extracelular Flux <ol><li> Hidratar el cartucho del sensor un día antes de realizar el ensayo: <ol><li> Coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de utilidad. </li><li> Llenar cada pocillo de la placa de utilidad con 200 l de solución de calibrante y bajar el cartucho del sensor sobre la placa de utilidad sumergiendo los sensores en la solución calibrante. </li><li> Verifique el nivel de solución calibrador es lo suficientemente alta para mantener los sensores sumergidos y lugar en un no-CO 2 incubadora a 37ºC O / N. </li></ol></li><li> Preparar medio de ensayo en el día del ensayo como sigue: <ol><li> Cálido medio 50 ml de base XF a 37 ° C. </li><li> Añadir 500 l 200 mM de L-glutamina para obtener una mM concentración final 2. </li><li> Ajustar el pH a 7,4 usando NaOH 1 N y esterilizar con un filtro de 0,2 M y mantener el medio de ensayo a 37 ° C. </li></ol></li><li> Retire con cuidado el medio de cultivo celular de los macrófagos polarizadas y almacenarla a -20 ° C para su uso futuro (por ejemplo, ELISA para examinar la polarización de macrófagos adecuada). Lavar las células con medio de ensayo 100 l, añadir 180 l de medio de ensayo por pocillo y verificar bajo el microscopio que las células no se lavaron de distancia. Coloque la placa de cultivo de células en una incubadora a 37ºC sin CO 2 durante 1 hora antes de realizar la prueba. </li><li> Prepare 10 x compuesto inyección de mezclas de A hasta D tal como se describe en la Tabla 1, se calienta a 37 ° C, ajustar el pH a 7,4 y esterilizar filtro. <ol><li> Hacer todos los compuestos en estas mezclas a 10x la concentración final en los pocillos de cultivo celular y optimizar estas concentraciones para cada tipo de célula. </li></ol></li><li> Cargue el cartucho del sensor usando las guías de carga provistos de volúmenes indicados (Tabla 1) de los preparados 10x mezclas de compuestos de la inyección en los puertos A, B, C y D, respectively. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> Mezcla / Inyección </td><td> Compuestos </td><td> El volumen agregado de conseguir 10x mezcla de (l) </td><td> Volumen medio de ensayo (ml) </td><td> Volumen inyectado durante la marcha (l) </td><td> La concentración final en el ensayo </td></tr><tr><td> LA </td><td> 2,5 M (45%) de glucosa </td><td> 300 </td><td> 2.7 </td><td> 20 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> segundo </td><td> 5 mM oligomicina A (OM) </td><td> 9 </td><td> 3.0 </td><td> 22 </td><td> 1,5 M </td></tr><tr><td> do </td><td> 5 mM FCCP </td><td> 9 </td><td> 2.7 </td><td> 25 </td><td> 1,5 M </td></tr><tr><td></td><td> Solución 100 mM de piruvato sódico </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> re </td><td> 5 mM antimicina A (AA) </td&gt; <td> 15 </td><td> 3.0 </td><td> 28 </td><td> 2,5 M </td></tr><tr><td></td><td> Rotenona 5 mM (Rot) </td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td> 1,25 M </td></tr></tbody></table> Tabla 1. mezclas de inyección. 3. Caracterización Bioenergético de polarizado M1 y M2 BMDM utilizando un extracelular Flux Analizador <ol><li> Crear una plantilla de ensayo con el asistente de ensayo con MIX 2 minutos y 3 veces minutos medir y (al menos) 3 mediciones de mezcla y de tipos de bucles antes de cada una de las 4 inyecciones (Tabla 1) y después de la última inyección. Nota: Estas concentraciones son válidos para los macrófagos derivados de médula ósea y RAW264.7 líneas celulares de macrófagos, pero deben ser optimizados para cada tipo de célula. Se necesita Adición de piruvato en la mezcla de FCCP para alimentar la respiración máxima. </li><li> Empieza la carrera empujando la parte inferior de inicio y siga las instrucciones del aparato. Primera carga el cocheplaca de cartucho con las sondas hidratados para permitir la calibración de aparatos y próxima carga la placa celular. </li><li> Después del ensayo, desechar cuidadosamente todo medio de ensayo y almacenar la cultura de microplacas celulares analizadas a -20 ° C para una futura normalización de células usando el kit de ensayo de proliferación celular como se describe en detalle por el proveedor. <ol><li> Brevemente, preparar un tampón de lisis celular 1x diluyendo el componente B de 20 veces en agua destilada y diluir el compuesto A 400 veces en el tampón de lisis celular 1x. Añadir 200 l por pocillo, incubar 5 minutos a temperatura ambiente y medir la fluorescencia con ~ 180 nm de excitación y de ~ 520 nm máximos de emisión. Nota: Cuando se trabaja con las células no adherentes o si la mala adherencia es una preocupación, el kit de proliferación celular directa se puede utilizar como una alternativa ya que este protocolo no requiere desechar todo medio de ensayo. Sin embargo, este protocolo directa es ligeramente menos sensible en comparación con el protocolo utilizado en este laboratorio. </li></ol></li><li> Después de la medición de la fluorescencia, normalizarel recuento de células en cada pocillo como una relación en la que el recuento de células promedio de todos los pocillos de macrófagos no tratados previamente se ha fijado en 1. Nota: La cuantificación de proteínas (por ejemplo, usando un ensayo de BCA) podría ser utilizado como una forma alternativa para normalizar los recuentos de células. Sin embargo, en nuestras manos este ensayo fue menos sensible en comparación con el kit de ensayo de proliferación celular. </li></ol>

<ol>
	<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41, 14-20 (2014).</li><li>Hoeksema, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN+gamma+Priming+of+Macrophages+Represses+a+Part+of+the+Inflammatory+Program+and+Attenuates+Neutrophil+Recruitment.">IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment.</a> J Immunol. , (2015).</li><li>Vanden Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+Advance+Arginase+1+independent+polyamine+production+stimulates+the+expression+of+IL+4+induced+alternatively+activated+macrophage+markers+while+inhibiting+LPS-induced+expression+of+inflammatory+genes.">Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes.</a> Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).</li><li>Pearce, E. L., Pearce, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathways+in+immune+cell+activation+and+quiescence.">Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence.</a> Immunity. 38, 633-643 (2013).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKM2+regulates+the+Warburg+effect+and+promotes+HMGB1+release+in+sepsis.">PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis.</a> Nature communications. 5, 4436 (2014).</li><li>Freemerman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+macrophages+glucose+transporter+1+(GLUT1)+mediated+glucose+metabolism+drives+a+proinflammatory+phenotype.">Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype.</a> The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).</li><li>Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiles+diverge+during+macrophage+polarization+implications+for+the+interpretation+of+18F+FDG+PET+imaging+of+atherosclerosis.">Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis.</a> J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).</li><li>Vats, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+metabolism+and+PGC+1beta+attenuate+macrophage+mediated+inflammation.">Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation.</a> Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).</li><li>Huang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+intrinsic+lysosomal+lipolysis+is+essential+for+alternative+activation+of+macrophages.">Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages.</a> Nature immunology. 15, 846-855 (2014).</li><li>Tannahill, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Succinate+is+an+inflammatory+signal+that+induces+IL+1beta+through+HIF+1alpha.">Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha.</a> Nature. 496, 238-242 (2013).</li><li>Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+macrophage+polarization+using+bone+marrow+derived+macrophages.">Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Hoeksema, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+Histone+deacetylase+3+stabilizes+atherosclerotic+lesions.">Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions.</a> EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).</li><li>Vanden Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatively+activated+macrophages+engage+in+homotypic+and+heterotypic+interactions+through+IL+4+and+polyamine+induced+E+cadherin+catenin+complexes.">Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes.</a> Blood. 114, 4664-4674 (2009).</li><li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+epigenetic+enzymes+to+improve+atherogenic+macrophage+functions.">Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).</li><li>Galvan Pena, S., O Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprograming+in+macrophage+polarization.">Metabolic reprograming in macrophage polarization.</a> Frontiers in immunology. 5, 420 (2014).</li><li>Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+metabolism+and+macrophage+functional+polarization.">Cellular metabolism and macrophage functional polarization.</a> International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).</li></ol>

El libre acceso a este artículo es patrocinado por Seahorse Bioscience.

El objetivo de nuestro laboratorio es entender cómo la polarización y la función de los macrófagos pueden ser influenciados con el objetivo final de mejorar el resultado de la aterosclerosis y otras enfermedades inflamatorias 12. Para evaluar la polarización de macrófagos, se mide típicamente los LPS (+ IFN) inducida por IL-4 y-inducidos de expresión génica de los genes marcadores M1 y M2 (qPCR), determina IL-6, IL-12, TNF y secreción de NO (por ELISA y Griess reacción) y examina inducida por IL-4 CD71, CD206, CD273 y CD301 expresión en la superficie (por citometría de flujo) y la actividad arginasa 3,13. Adicionalmente, ensayos de apoptosis (por Anexina-V / tinción PI), ensayos de fagocitosis (con perlas fluorescentes de látex y / o pHrodo E. coli) y ensayos de formación de células espumosas (por captación de Dil-oxLDL, la tinción de lípido neutro LipidTOX) se pueden realizar para evaluar la funcionalidad de los macrófagos 14. Además, el análisis de flujo extracelular se puede realizar para medir la bioenergética perfiles de mac polarizadorophages como una lectura funcional nuevo y alternativo. Este manuscrito muestra que la polarización de macrófagos induce la reprogramación metabólica con macrófagos inducida por LPS de conmutación a un aumento de la glucólisis como su fuente de energía. Por el contrario, los macrófagos M2 inducida por IL-4 utilizan la fosforilación oxidativa mitocondrial como la principal fuente de ATP. Es importante destacar que la reprogramación metabólica no sólo proporciona la energía para las necesidades particulares de M1 y M2 macrófagos polarizadas. De hecho, los cambios metabólicos afectan las concentraciones de metabolitos que son reguladores directos del fenotipo de los macrófagos 10,15,16. Por lo tanto, el metabolismo de los macrófagos no sólo es una característica (como se muestra aquí en la Figura 2), sino también un conductor de distintos estados de polarización de macrófagos y este nuevo conocimiento apoya el rápido crecimiento del área de investigación immunometabolism durante el último par de años. Sin embargo, las mediciones robustas de perfiles metabólicos en macrofagos seguido siendo difícil y tenían sus limitaciones. En este estudio, un analizador de flujo extracelular se aplica para medir la firmeza glucólisis, reserva glucolítica, la capacidad glucolítica máxima, la acidificación no glucolítica, basal y la respiración máxima, la producción de ATP, la capacidad respiratoria repuesto, fuga de protones y la respiración no mitocondrial en tiempo real en una cantidad mínima de los macrófagos. Por lo tanto, hemos modificado y mejorado los protocolos del fabricante de la siguiente manera. La Prueba de Estrés Mito estándar (# 103015-100) sugiere el uso de medio con glucosa y piruvato y un protocolo con 3 inyecciones (OM, FCCP, AA / Rot). Optamos para iniciar el ensayo con glucosa / medio-piruvato libre, añadir la glucosa como una primera inyección en el puerto A (como en el glucólisis Estrés Prueba # 103020-100) y añadir piruvato junto con el desacoplador FCCP en el puerto C. De esta manera , todos los parámetros relevantes glucólisis se derivan de las mediciones ECAR 1-9 y toda la información relevante acerca de mitochondrial partir de mediciones de la función OCR 4-15. Tenga en cuenta que es fundamental para inyectar piruvato junto con FCCP para alimentar la respiración máxima sobre desacoplamiento. Antes de utilizar este protocolo combinado, también hay que verificar que 2-desoxi-D-glucosa (2-DG) disminuye los niveles de ECAR después del ensayo a los valores basales (1-3) y que las tasas de ECAR grabadas 4-6 son de hecho debido a la glucólisis. Además, se debe comprender que las concentraciones de los productos y el número de células utilizadas en este manuscrito son válidos para los macrófagos derivados de médula ósea y RAW264.7 líneas celulares de macrófagos y deben ser optimizados para otros tipos de células. Por otra parte, hay que señalar que M-CSF que se usa para generar los macrófagos derivados de médula ósea promueve un fenotipo anti-inflamatoria M2-similares. Los resultados presentados a partir de macrófagos derivados de médula ósea pueden ser, por tanto, no ser totalmente comparables a las mediciones con los macrófagos residentes tejido primario o macrófagos líneas celulares que no requieren M-CSF durante Culturi celularng. En comparación con los métodos existentes, este protocolo requiere cantidades mínimas de los macrófagos y rápidamente ofrece prácticamente todas las características fundamentales de células metabólicas. Esto resulta en suficientes células excedentes para llevar a cabo otros ensayos inmunológicos e incluso las células usadas para la bioenergética de perfiles todavía podría ser utilizado para otros propuesto después del ensayo. Además, el formato de placa de 96 pozo en particular permite la evaluación de múltiples condiciones en tiempo real al mismo tiempo. Sin embargo, la variación entre los pozos individuales puede ser considerable y por lo tanto a menudo se desea el uso de al menos 4 pocillos por condición. Tomado en cuenta esta limitación, el análisis de flujo extracelular descrito todavía permite ejecutar más de 10 condiciones experimentales (n = 6) a la vez, lo que es mucho más que las técnicas tradicionales. En general, este artículo proporciona un ensayo funcional fácil y reproducible que permite medir toda la glucólisis relevante y param mitocondrialetros en subconjuntos de macrófagos polarizadas. Esta técnica puede servir como una aplicación futura para evaluar la función de los macrófagos y para evaluar el efecto de manipulaciones distintas (por ejemplo, genes derribar, nuevos productos farmacéuticos, etc.) en (metabólica) fenotipo de los macrófagos. Como tal, los datos de flujo extracelulares pueden ser utilizados en conjunción con otros ensayos para permitir la caracterización en profundidad de el estado de activación de los macrófagos.

Mientras que los macrófagos juegan un papel central en prácticamente todas las enfermedades, los mecanismos moleculares que regulan su fenotipo todavía no están totalmente desenredado. Los macrófagos muestran gran heterogeneidad y en respuesta a la microambiente adoptan diferentes fenotipos 1. LPS (+ IFN) inducida clásicamente activados M1 o M (LPS) macrófagos promueven la inflamación y protegen al huésped frente a diferentes tipos de amenazas microbianas 2. Otros utilizan IFN solo o en combinación con TNF como estímulos para provocar M1 polarización. IL-4 y / o IL-13 induce la activación de macrófagos alternativa y estos M2 o células M (IL-4) son potentes supresores y reguladores de la respuesta inmune en curso 3. Macrófagos polarizadas muestran una regulación distinta del metabolismo celular con macrófagos M1 activados con LPS de someterse a un cambio metabólico para mejorar la glucólisis 4-6. Oxidación de ácidos grasos contrario, mejorado (FAO) y oxidativ mitocondriale fosforilación (fosforilación oxidativa) proporciona energía sostenida en los macrófagos M2 inducidas por IL-4 7-9. Por lo tanto, el metabolismo alterado no sólo es una característica de los subconjuntos de macrófagos polarizadas, también es un requisito previo para la polarización adecuada y la regulación inflamatoria. Es importante destacar que la inhibición de la glicólisis o la fosforilación oxidativa / FAO se ha demostrado que la activación deteriorar M1 o M2, respectivamente 8,10. Como tal, la identificación de los cambios metabólicos en los macrófagos podrían aplicarse como una herramienta para evaluar su estado de polarización y potencial inflamatorio. Por consiguiente, un ensayo consistente que mide el metabolismo de macrófagos podría ser utilizado para predecir si un fármaco, gen derribar u otro tratamiento afecta a la polarización y la función de los macrófagos. En este video, un analizador de flujo extracelular se utiliza para caracterizar los perfiles bioenergética de ingenuos, M1 y M2 macrófagos. Este manuscrito detalla un protocolo optimizado que permite la mediciónde todos los parámetros relevantes glucólisis (glucólisis, glucólisis máxima y reserva glucolítica) y características de la función mitocondrial (respiración total, la respiración mitocondrial basal, la producción de ATP, de fugas de protones, la respiración máxima y capacidad respiratoria repuesto) en un solo ensayo. El uso de este sistema experimental, bioenergética se pueden comparar entre el control y &#39;alterado&#39; (por ejemplo, gen tumbar, la sobreexpresión transgénica o tratamiento farmacológico) células.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23G and 25G needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#300800 and #300600</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#307736</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#639161</td>
			<td>To culture bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#C7026</td>
			<td>For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#35011</td>
			<td>For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 cell culture microplate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#101085-004</td>
			<td>96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant mouse interleukin-4 (IL-4)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#214-14-B</td>
			<td>Used to induced alternative macrophage activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L2637</td>
			<td>Pro-inflammatory stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Sensor Cartridge&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102416-100</td>
			<td>Contains the probes for pH and O2 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#100840-000</td>
			<td>Needed to hydrate the probes overnight&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102353-100</td>
			<td>Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G8769</td>
			<td>Fuels glycolysis once added to the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#75351</td>
			<td>Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C2920</td>
			<td>Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#BE13-115E</td>
			<td>Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674</td>
			<td>Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674R8875</td>
			<td>Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy Cell Counter</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#05 651 697 001</td>
			<td>Instrument to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#14-0161</td>
			<td>Fc receptor block flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-F4/80-APC-eFluor780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#47-4801</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#11-0112</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic characterization of polarized m1 and m2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Después de terminar el ensayo y la cuantificación de células de flujo extracelular, los datos se pueden normalizar para el recuento de células y se analizaron. Normalmente, esto dará lugar a ECAR y OCR parcelas como se muestra en la Figura 1A y la Figura 1B. Después de la inyección de glucosa (A), el aumento de ECAR representa la tasa de glucólisis. El aumento adicional de la ECAR después de la inhibición ATP sintasa con oligomicina (B) proporciona información acerca de la reserva glicolítica y la capacidad (Figura 1A). Al analizar los valores de OCR, oligomicina inyección (B) permite el cálculo del consumo de oxígeno utilizado para la síntesis de ATP mitocondrial. FCCP (C) desacopla la respiración mitocondrial y las mediciones de OCR correspondientes dió datos sobre la máxima y la capacidad respiratoria de repuesto. Por último, la inyección de rotenona (Rot) y antimicina A (AA) bloquean mitocondrial complejo I y III y el OCR residual representa los contras de oxígeno no mitocondrialesumption (Figura 1B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" /> Figura 1: Parámetros metabólicos derivados de un ensayo de flujo de XF extracelular. (A) A raíz de los parámetros de la glucólisis celular se calcula a partir de los valores ECAR (en MPH / min): glucólisis, la máxima capacidad glucolítica y reserva glucolítica. Mediciones (B) OCR (en pmoles / min) se utilizan para calcular los siguientes parámetros fundamentales de la función mitocondrial: respiración basal, la producción de ATP, la fuga de protones, la respiración y la máxima capacidad respiratoria de repuesto. Gluc = glucosa; OM = oligomicina A; FCCP = cianuro de carbonilo 4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona; AA = antimicina A; Rot = rotenona <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Después de la carrera, ECAR y OCR mediciones 1 till 15 para cada pozo se puede exportar a Excel y los siguientes parámetros glucolíticas puede calcularse a partir de las mediciones ECAR de la siguiente manera: La acidificación no glucolítica = avg. ECAR (1,2,3) La glucólisis = avg. ECAR (4,5,6) - avg. ECAR (1,2,3) Máxima capacidad glucolítica = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (1,2,3) Reserva glucolítica = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (4,5,6) A partir de las tasas de OCR, los próximos características metabólicas se pueden determinar: La respiración para no mitocondrial = avg. OCR (13,14,15) Respiración basal = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (13,14,15) La producción de ATP = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (7,8,9) Protón fuga =avg. OCR (7,8,9) - avg. OCR (13,14,15) Respiración máxima = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (13,14,15) La capacidad respiratoria de repuesto (SRC) = promedio. OCR (10,11,12) - avg. OCR (4,5,6) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" /> Figura 2:. Características metabólicas de naïve (M0), LPS (M1) y la IL-4- (M2) macrófagos polarizadas Para cada medición, la media y el error estándar de la media (SEM) de 8 pocillos individuales se presenta. (A) las tasas de acidificación extracelular (ECAR, en mph / min) y (b) Las tasas de consumo de oxígeno (OCR, en pmoles / min) se miden de manera diferencial polarizado (M1 y M2) y macrófagos ingenuos (M0). Todas las mediciones se normalizaron para el recuento de células (tal como se mide con CyQUANT) y el recuento de células promedio de los macrófagos no tratados previamente se fijó en 1. Eninyección A = glucosa; B = oligomicina; C = FCCP; D = antimicina A + rotenona. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Como se muestra en la Figura 2A, la activación de macrófagos con LPS induce aumento del metabolismo glicolítico. Las diferencias entre LPS y macrófagos tratados con IL-4 son aún más evidente cuando se mira en las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en la Figura 2B. En efecto, mientras que el metabolismo oxidativo máxima es altamente suprimida en M (LPS), IL-4 induce la respiración basal y especialmente máxima en los macrófagos M2. Hay que señalar que el aumento de glicolítica es bastante singular de M (LPS) macrófagos y no es necesariamente una característica de los macrófagos M1 desde M (IFN) macrófagos no se muestran a mejorar la glucólisis. En general, este análisis de flujo extracelular demuestra thainducida IL-4-t macrófagos M2 se caracterizan por el metabolismo oxidativo mejorado y sobre todo una gran capacidad respiratoria repuesto (SRC), mientras que la pantalla LPS-macrófagos activados mejora el metabolismo glucolítico y no posee ninguna capacidad respiratoria de repuesto.

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Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

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