Name: light-driven enzymatic decarboxylation
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

Forsigtig: Se venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Flere af de kemikalier, der anvendes i disse synteser er akut giftige og kræftfremkaldende. Alle trin, der involverer skadelige organiske opløsningsmidler, især udvinding af reaktionsprodukter og derivatisering af fedtsyrer skal udføres under en emhætte bruger personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, kittel, fuld længde bukser, lukkede toe sko ). Alle transaktioner vedrørende genetisk modificerede organismer i dette arbejde kræver anlæg, der er godkendt til håndtering af genetisk modificerede organismer i sikkerhedsniveauet S1. 1. Ekspression af de rekombinante Decarboxylase Olet JE i E. coli <ol><li> Fremstilling af produktionsstammen <ol><li> Forbered et syntetisk gen af Olet JE fra Jeotgalicoccus og klonet ind i ekspressionsvektoren pASK-IBA37plus som beskrevet. 8 </sup&gt; BEMÆRK: For at undgå nedbrydning af fedtsyrer af enzymer fra den bakterielle metabolisme, E. coli-stamme JW5020 fra Keio samling med en dysfunktionel vej for fedtsyre-nedbrydning blev anvendt. </li></ol></li><li> Dyrkning og induktion af enzymekspression <ol><li> Forbered en forkultur ved inokulering af E. coli JW5020 Olet mutant fra en LB-plade (indeholdende 100 mg ml -1 ampicillin) i to 3 ml LB-medium i reagensglas. Pipette ampicillin (100 ug ml-1) ud fra en stamopløsning i mediet for udvælgelse og inkuberes ved 37 ° C i 15 timer i en rysteinkubator ved 180 rpm. </li><li> Tilsæt 2 ml af for-kulturer til to 200 ml LB-medium indeholdende ampicillin (100 ug ml-1), i 1 L rystekolber. Inkubation fortsætter ved 37 ° C og 180 rpm. </li><li> Overvåg ændringen i OD 600 nm efter inokuleringen. Når OD600 når en værdi mellem 0,6 end 0,8 inducere ekspressionen ved tilsætning tetracyclin (0,2 ug ml-1). Inkuber kulturerne i 15 timer ved 20 ° C og 180 rpm. BEMÆRK: Da Olet JE indeholder et hæm cofaktor, er tilsætning af δ-Amino levulinsyre (0,5 mM) før induktion nødvendig for at give kulturen med en precursor for cofaktor-syntese. </li></ol></li><li> cellelyse <ol><li> Udfør følgende trin på is. Overfør kulturerne ved dekantering eller pipettering centrifugerør og bruge en skala til at sikre lige fordeling. Centrifugeres kulturerne i 20 min ved 12.000 xg ved 4 ° C. </li><li> kassere omhyggeligt supernatanten og resuspender pellets i 50 ml puffer (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) ved pipettering og overfør suspensionen i en konisk centrifugerør. </li><li> Efter centrifugering i 15 minutter ved 4.000 xg ved 4 ° C kasseres supernatanten, resuspender hver pellet i 3 ml puffer ved pipettering. </li><li> Udføre cellelyse af sånicating løsningerne på is (tre cyklusser x 30 sek) forlader en 1 min pause i mellem cyklusser. Centrifuger løsninger for 20 min ved 15.000 xg ved 4 ° C for at fjerne cellerester og overføre supernatanten i en konisk centrifugerør uden at forstyrre pellet ved pipettering. Kassér pelleten. BEMÆRK: En fraktion af opløsningsmidler anvendes direkte til biokatalyse efter små molekyler er fjernet. Den anden fraktion vil blive anvendt til oprensning af det His-mærket Olet JE. </li></ol></li><li> Fjernelse af små molekyler af cellepositioner ekstrakter <ol><li> Før brug af den rå ekstrakt i biokatalyse fjerne små molekyler, som kan interferere med brintoverilte dannelse eller elektronoverførsel ved pipettering 3 ml cellefri ekstrakt i en centrifuge filterenhed med en 10 kDa-membran og der centrifugeres ved 4.000 xg ved 4 ° C. Resuspender resterende protein i 3 ml Tris-HCl-buffer. </li></ol></li><li> Oprensning af Olet </strong&gt; <ol><li> Anvendelse 3 ml af den anden celleekstrakt til sine Pur Ni-NTA spin-søjler, som er blevet ækvilibreret før med ækvilibreringspuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM). </li><li> Forsegl kolonner med de nederste stik og øverste skrue-caps og ryst dem let indtil harpiksen er fordelt ligeligt med cellefri ekstrakt. Inkuber de indlæste kolonner i 30 minutter i en overhead rysteapparat ved 4 ° C. </li><li> Vask søjlerne med 1 ml vaskebuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,4) ved centrifugering ved 700 xg i 2 min. Gentag dette trin to gange. </li><li> Placer kolonnerne i et frisk konisk centrifugerør, og der tilsættes 1 ml af elueringsbuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7,4) Olet JE. Centrifuger ved 700 xg i 2 min og gentage dette trin to gange. BEMÆRK: Imidazol vil binde til nikkel og dermed fjerne Olet JE fra søjlen. </li><li> Overfør elueringen til en centrifuge filterenhed (10 kDa membran) og centrifugeres ved 4000 xg ved 4 ° C til fjernelse imidazol. </li><li> Kontrollér renheden af enzymet ved en SDS-PAGE (15%). 9 Mix 3 pi af eluering med en SDS-puffer (slutkoncentration 1x) og inkuber opløsningen ved 95 ° C i 5 min til denaturering. Efterfølgende anvende det samlede beløb på en SDS-Page. Kør gelen ved 35 mA under anvendelse af et kommercielt protein standard. Detektere proteinet ved 50 kDa. </li><li> For at bestemme proteinkoncentration bruge et kommercielt tilgængeligt BSA-kit. Pipetter 50 pi fortyndede proteinprøver (1: 100, 1: 200, 1: 500) og BSA standard (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml-1) i en plade med 96 brønde . Tilsæt 200 pi Bradford reagens, måles absorbansen ved 595 nm efter 15 min med et fluorimeter og beregne koncentrationerne under anvendelse af standardkurven. </li></ol></li></ol> 2. Light-katalyseret Biotransformation <ol><li> Biokatalytiske reaktioner uden hydrogenperoxid tilsætning<ol><li> Der fremstilles en 10 ml stamopløsning af 10 mM stearinsyre (Mr 284,5 g mol-1) ved tilsætning af 10% (v / v) Tergitol og 0,0284 g stearinsyre til destilleret vand. Opvarm opløsningen i et varmekammer til 60 ° C, indtil fedtsyren er fuldstændigt opløst. </li><li> Biokatalyse og prøveudtagning <ol><li> Forbered to 2 ml reaktionsblandinger indeholdende 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM stearinsyre i Tris-HCl-buffer. Tilføj en magnetisk omrører for tilstrækkelig ilttilførsel og placere glasrør i vandbad, opvarmet til 25 ° C. </li><li> Tilsæt 200 ug ml -1 af oprenset enzym eller 10% (v / v) cellefri ekstrakt til hver af reaktionsblandingerne og belyse dem med et klart glas pære (120 W) i 15 cm afstand af reaktionsrørene. </li><li> Tag 200 pi prøver ved specifikke tidspunkter (0, 10, 30, 60 og 120 min og over nat) standsning af reaktionen med 20 pi 37% HCI. Tilsæt 5 pi myristinsyre (10 mM lager sålution) som intern standard. </li></ol></li></ol></li><li> Analyse af reaktionsprodukter <ol><li> Til ekstraktion tilsættes 500 pi ethylacetat til prøverne to gange, vendes rørene og centrifugeres i 1 min ved 13.000 x g. </li><li> Tag 400 ul af supernatanten og lad opløsningsmidlet fuldstændigt fordampe. </li><li> Derivatisere carboxylsyrerne til trimethylsilylcarboxylic syre ved tilsætning af 200 pi N-methyl-N - (trimethylsilyl) trifluor- acetamid (MSTFA). Inkuber opløsningen ved 60 ° C i 30 minutter for at omdanne hydroxylgrupper til trimethylsilylethere. </li><li> Bestemmelse af omdannelse ved GC / FID BEMÆRK: Bestem dannelsen af ​​1-heptadecen (RT: 8,34 min), α- og β-hydroxy stearinsyre (RT: 12,05 og 12,1 min) og formindskelse af substratet (RT: 11,15 min) under anvendelse af GC / FID. <ol><li> Indstil temperaturen profil beskrevet nedenfor Indstil injektion temperaturen til 340 ° C. Holdeden indledende ovntemperaturen er ved 90 ° C i 3,5 min og derefter stige med 45 ° C min-1. Ved 220 ° C, holde temperaturen i 2 min. Efter en gentaget stigning på 45 ° C min -1, holde temperaturen ved 280 ° C i 2 minutter og derefter stige med 60 ° C min-1. BEMÆRK: Maksimal temperatur på 330 ° C er holdt i 1,44 min. </li><li> Injicer 4 pi af prøven, med en split forhold på 5 til at få hurtig forflygtigelse og homogen blanding med bæregas helium den. BEMÆRK: I afhængighed af den stigende temperatur substratet og produkterne vil komme ind i gasfasen. Stofferne er opdaget af GC / FID-detektor efter at have passeret kolonnen på bestemte retentionstider og vises som toppe på skærmen. Overhold peak formation på skærmen. </li><li> Beregning af koncentrationen af ​​dannet produkt af følgende formel: <img alt="ligning 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; BEMÆRK: Kalibreringsfaktoren er bestemt specifikt for denne kolonne for hvert substrat og produkt ved at beregne standardkurven fra kendte mængder af de deriverede stoffer og deres tilsvarende top område. </li></ol></li><li> Identificer olefin og p-hydroxy acid toppe ved GC / MS. <ol><li> Identificer olefin og p-hydroxy acid toppe ved GC / MS. Indstil temperaturen profil. Indstil injektion temperaturen til 250 ° C. Hold ovntemperaturen til 100 ° C i 5 minutter og derefter stige med 20 ° C min-1. BEMÆRK: Maksimal temperatur holdes i 7,5 min. </li><li> Indstil massespektrometri temperatur til 250 ° C og scanne ved 50 til 500 m / z i elektronanslag tilstand. BEMÆRK: electron impact ionisering fjerner en enkelt elektron resulterer i dannelsen af ​​en radikal kation, som vil blive væltet fremad for masseanalyse. På grund af de høje intramolar energi kovalente bindinger inden formolekyle pause skabe fragmenter af lavere m / z. Disse fragmenter danner et fingeraftryk specifik for et stof. </li><li> Injicer 1 ml af prøven. Detect 1-heptadecen efter 11,4 minutters retentionstid med den tilsvarende fingeraftryk (figur 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kourist, R., Dom&#236;nguez de Mar&#236;a, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments.">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li><li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taming+of+oxygen:+biocatalytic+oxyfunctionalisations.">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li><li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions.">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li><li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis:+Nonconventional+Regeneration+Methods.">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li><li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases.">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li><li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts.">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).</li><li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+olefin+(1-alkene)+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species.">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li><li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis.">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-independent+production+of+&#945;-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase.">Hydrogen peroxide-independent production of &#945;-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).</li><li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions.">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Lyset-drevne generation af hydrogenperoxid kan anvendes til en række redox transformationer, herunder peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 og P450 monooxygenaser 5. Det er en nem og praktisk tilgang. På lang sigt, brugen af ​​synligt lys åbner perspektivet til at udnytte sollyset til kemiske omdannelser, som er et bæredygtigt alternativ til energirige reaktioner. Metoden er anvendelig med oprenset enzym eller med cellefri ekstrakt. Mens sidstnævnte kræver mindre omkostninger og arbejde, skal det bemærkes, at små molekyler i den rå ekstrakt kan interferere med lys katalyseret konvertering. En praktisk fremgangsmåde er at fjerne disse små komponenter med en Mikromembran (dvs. ved centrifugering i en centrifugalfilterenhed eller ved dialyse). Koncentrationen af ​​lyset høst molekyle FMN bestemmer koncentrationen af ​​hydrogenperoxid. Afhængigt af Affinity af oxidoreduktase, denne koncentration er afgørende for den enzymatiske aktivitet. En anden vigtig faktor er koncentrationen af ​​den opofrende elektrondonor EDTA. Den vigtigste parameter er imidlertid den operationelle stabilitet og aktivitet af enzymet. Den olefinization af fedtsyrer er en elegant reaktion til omdannelse af biobaserede fedtsyrer til olefiner, der hører til de store råvarer til den kemiske industri. Lyset-drevne biokatalytisk decarboxylering kan udføres ved stuetemperatur og ved neutral pH, hvilket giver klare fordele med hensyn til bæredygtighed. Vores resultater viser, at in situ-dannelse af hydrogenperoxid er en strategi til at levere cofaktoren uden at svække enzymstabilitet, hvilket fører til en høj omdannelse. Nuværende metoder til cofaktor regenerering bruger landbrugsprodukter eller benzin-baserede kemikalier. Light-drevne reaktioner dukker op som vedvarende alternativ. Fremtidforskning vil være dedikeret til fremgangsmåder til substitution af det hellige reagens EDTA af billigere molekyler og at reducere mængden af ​​lys-høst molekyle FMN.

Den klimaforandringer og den forventede udtømning af vedvarende ressourcer udgør en alvorlig trussel mod vores samfund. I denne sammenhæng enzym katalyse repræsenterer en endnu ikke fuldt udnyttet potentiale for udvikling af bæredygtig og grønnere kemi 1. Oxidoreduktaser har kapacitet til at katalysere indførelse og ændring af funktionelle grupper under milde reaktionsbetingelser og tilhører de vigtigste biokatalysatorer 2. De fleste redox transformationer kræver levering af ekstern af cofaktorer såsom NAD (P) H. Metoder til cofaktor regenerering er blevet anvendt i industriel skala. Men de stadig resultere i høje procesomkostninger, hvilket begrænser deres anvendelse meste til højværdiprodukter. Interessant flere peroxidaser 3,4 og P450 monooxygenases 5 acceptere elektroner fra hydrogenperoxid via den såkaldte peroxid shunt. Mens H 2 O 2 er en billig co-reagens, er det angiveligt harmful for mange enzymer. En støt in situ-dannelse af lave koncentrationer af hydrogenperoxid er en brugbar fremgangsmåde til at drive reaktionen uden at forringe driftsstabilitet enzym. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Figur 1. Eksperimentel opsætning af photobiocatalytic decarboxylering af fedtsyrer ved Olet JE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> Brugen af lys som energikilde til kemiske og biologiske processer har modtaget stigende opmærksomhed i de seneste år 6. Light-driven generation af hydrogenperoxid har vist sig som en let og robust metode til at levere hydrogenperoxid til redox transformationer (figur 1). En fotokatalysator såsom flavin adenin mononucleotide (FMN) tillader reduktion af molekylært oxygen til hydrogenperoxid, som derefter anvendes som cofaktor for den enzymatiske oxyfunctionalization reaktion. Mulige elektrondonorer er ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), ascorbat eller billig formiat. Fremgangsmåden er generelt anvendelig til H2O 2 -afhængige enzymer, herunder peroxidaser 3,4 og P450 monooxygenases 5. Vi har for nylig undersøgt anvendelsen af en ny bakteriel decarboxylase 7 for omdannelsen af naturlige fedtstoffer i olefiner 8. Dette ville være en bæredygtig vej til syntese af udbredte platform kemikalier fra en biobaseret kilde. Den decarboxylase Olet JE fra den gram-positive bakterie Jeotgalicoccus sp. katalyserer oxidativ decarboxylering af fedtsyrer og danner 1-alkener som produkter. Olet JE er nært beslægtet med bakterielle P450 monooxygenaser og behov elektroner from hydrogenperoxid til reaktionen. Desværre, tilsætning af H 2 O 2 til en opløsning af substrat og enzym resulterede i lave konverteringer og en dårlig reproducerbarhed af resultaterne, antageligt på grund af en skadelig virkning af hydrogenperoxid på stabiliteten af Olet JE. Generering af et fusionsprotein med NADPH-reduktase RhFred gjort en NADPH-afhængig decarboxylering muligt. 9. Ikke desto mindre er den høje pris på NADPH og de ​​nuværende begrænsede muligheder for en omkostningseffektiv regenerering fik os til at undersøge billigere elektrondonorer. Inspireret af ligheden mellem Olet JE med P450 monooxygenaser, brugte vi lys-katalyseret generation af H 2 O 2. Vi var glade for at opnå høje konverteringer (op til&gt; 95%) ved hjælp af cellefrie ekstrakter eller oprensede enzym løsninger. Med eksemplet med fedtsyre decarboxylering præsenterer vi en generel protokol for lys-drevne enzymatiske redox transformationer hjælp FMN som fotokatalysator og hydrogenperoxid som cofaktor. De præsenterede fremgangsmåder indbefatter produktion af enzymet i rekombinant celle af E. coli, oprensning af enzymet, ansøgningen til syntese af 1-alkener og analyse af reaktionsprodukterne.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Chemicals</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bradford reagent</td>
			<td style="width:131px;">Roth</td>
			<td style="width:173px;">K015.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">BSA</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>90604-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:195px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:173px;">141-78-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:131px;">Roth</td>
			<td style="width:173px;">8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;width:195px;">Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">130-40-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochlorid acid 37%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">7722-84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">&#948;-Amino levulinic acid</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>5451-09-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:61px;width:195px;">N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">24589-78-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Myristic acid &#62;99%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">208-875-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">288-32-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:173px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Stearic acid &#62;99%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">57-11-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">60-54-8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tergitol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">MFCD01779855&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Device</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:195px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:131px;">G-25CK</td>
			<td style="width:173px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">Ecotron</td>
			<td style="width:173px;">Infors HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centrifugation</td>
			<td style="width:131px;">Labofuge 400R</td>
			<td style="width:173px;">Heraeus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">RC 5B Plus</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">Fresco 17</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centrifugation rotors</td>
			<td style="width:131px;">SS34</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">SLA</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Clean bench</td>
			<td style="width:131px;">Envirco</td>
			<td style="width:173px;">Ceag Schirp Reinraum technik</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Column GC-FID&#160;</td>
			<td style="width:131px;">CP-Sil 5CB (30 m x 0.25 mmx 0.25 &#181;m)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Column GC-MS</td>
			<td style="width:131px;">FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Varian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GC-FID</td>
			<td style="width:131px;">GC-2010 plus</td>
			<td style="width:173px;">Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GC-MS</td>
			<td style="width:131px;">IST-40</td>
			<td style="width:173px;">Varian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:131px;">RCT classic</td>
			<td style="width:173px;">IKA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:131px;">SevenEasy</td>
			<td style="width:173px;">Mettler toledo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sonicator</td>
			<td style="width:131px;">Branson Sonifier 250</td>
			<td style="width:173px;">Branson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Spectral photometer</td>
			<td style="width:131px;">FLUOstar Omega</td>
			<td style="width:173px;">BMG Labtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Equipment</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Affinity chromatography column</td>
			<td style="width:131px;">His Pur Ni-NTA spin column</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centricon</td>
			<td style="width:131px;">Vivaspin turbo 15</td>
			<td style="width:173px;">VWR International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Microtiter plates</td>
			<td style="width:131px;">96 Well Multiply&#174;PCR Plates</td>
			<td style="width:173px;">Sarstedt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-driven enzymatic decarboxylation

Oxidoreduktaser hører til de mest anvendte industrielle enzymer. Ikke desto mindre, de har brug for eksterne elektroner, hvis udbuddet er ofte dyrt og udfordrende. Genanvendelse af elektrondonorer NADH eller NADPH kræver brug af ekstra enzymer og offer substrater. Interessant flere oxidoreduktaser acceptere hydrogenperoxid som elektrondonor. Mens være billig, dette reagens reducerer ofte stabiliteten af ​​enzymer. En løsning på dette problem er den in situ generation af cofaktoren. Den kontinuerlige forsyning af cofaktoren ved lav koncentration driver reaktionen uden at forringe enzymstabilitet. Dette demonstrerer en fremgangsmåde til lys-katalyseret in situ generation af hydrogenperoxid med eksemplet med hæm-afhængige fedtsyre decarboxylase Olet JE. Fedtsyren decarboxylase Olet JE blev opdaget på grund af sin unikke evne til at producere langkædede 1-alkener fra fedtsyrer, en hidtil ukendt enzymatiskreaktion. 1-alkener er meget udbredt tilsætningsstoffer til plastificeringsmidler og smøremidler. Olet JE er blevet vist at acceptere elektroner fra hydrogenperoxid til den oxidative decarboxylering. Mens tilsætning af hydrogenperoxid skader enzym- og resulterer i lave udbytter, in situ generation af cofaktor omgår dette problem. Den photobiocatalytic kan fremvise fordele med hensyn enzymaktivitet og udbytte, hvilket resulterer i et enkelt og effektivt system til fedtsyre decarboxylering.

Mens tilsætningen af hydrogenperoxid til reaktionsblandingen resulterede i lav til moderat konverteringer (&lt;10%), in situ generation af hydrogenperoxid øges omdannelsen op til 80% omdannelse. Analyse ved GC / MS viser dannelsen af olefiner fra fedtsyrer (figur 2). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> Figur 2. (A) Temperatur profil for GC / MS-målinger. (B) Fingerprint af 1-heptadecen eluerende efter 11,4 min. (C) Karakteristiske sekundære CnH2n-1 fragment ioner af terminal olefiner eksemplarisk vist for en-heptadecen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> E. coli. En oprenset enzym løsning viste en klar sammenhæng mellem enzym koncentration og konvertering. Forøgelse af koncentrationen af ​​lyset høst molekyle FMN føre til højere konverteringer. Men forøgelse af koncentrationen over 10 mM ikke yderligere at fremskynde reaktionerne, hvilket indikerer, at mængden af ​​hydrogenperoxid er tilstrækkeligt til rådighed og ikke længere den begrænsende faktor. Ud over den decarboxylering af fedtsyrer, Olet JE katalyserer også en hydroxylering i β-position. I omdannelsen af ​​stearinsyre, decarboxyleringen er omkring tre gange hurtigere end hydroxyleringen. I et typisk forsøg ved anvendelse af en opløsning af 0,5 mM stearinsyre og 10 uM FMN blev 99% af substratet omdannes til en blanding af 1-heptadecen og 2-hydroxystearinsyre med et forhold på3,3: 1 (figur 3) 8. En undersøgelse af substratet spektrum af lys-drevne biokatalyse viste, at for fedtsyrer med længere acylkæder, Olet JE fortrinsvis katalyserer decarboxylering, mens den relative mængde af hydroxylholdige fedtsyrer i produktblandingen øges med kortere kædelængde. Fedtsyrer kortere end myristinsyre (C14) ikke undergår decarboxylering. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Figur 3. gaskromatografisk analyse af Olet JE medieret decarboxylering af stearinsyre (11,15 min) i 1-heptadecen (8,4 min), α-hydroxy stearinsyre (12.04 min) β-hydroxy stearinsyre (12,1 min). Ændringen af toparealerne fra prøver udtaget over en tidsforløbet for 2 timer er vist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at vie</a>wa større version af dette tal. Overraskende, umættede syrer oliesyre (C18: 1d9 cis) og linolsyre (C18: 2d9d12) blev ikke accepteret som substrater, hvilket indikerer, at den snoede konfiguration af cis-dobbeltbindinger ikke kan rummes i en produktiv bindende tilstand i enzymet. Tilsætning af oliesyre (10%) forhindrede også omdannelsen af ​​stearinsyre. Interessant, stearinsyre: blev (C18 1d9 trans) omdannes af Olet JE, men med lidt lavere aktivitet derefter stearinsyre.

Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Vi beskriver en protokol for lys-katalyseret generation af hydrogenperoxid - en cofaktor for oxidative transformationer.

Light-driven Enzymatisk Decarboxylering

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Carboxylic Acids

SCIENTISTS IN ACTION

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Hot Biologisk katalyse: Isothermal Titrering kalorimetri at karakterisere enzymatiske reaktioner

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Opløsning Dynamic Nuclear Polarisering Instrumentation for Real-time enzymatisk reaktion Rate Målinger ved NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Kemo-enzymatisk syntese af N- glycans for arrayet udvikling og HIV antistof profilering

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Enzymatisk Cascade reaktioner til syntese af Chiral Amino alkoholer fra L-lysin

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Lys-drevet molekylære motorer på overflader for enkelt molekylær billeddannelse

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Enzymatisk syntese af Epoxidiserede metabolitter af Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic og arachidonsyre

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Decoding Transient Absorption - Processing, Fitting, and Interpreting Data

An Introduction to Processing, Fitting, and Interpreting Transient Absorption Data

Author Spotlight: Exploring Light-Driven Chemical Reactions and Energy-Harnessing Devices in Photochemical Research

Transient absorption (TA) spectroscopy is a powerful time-resolved spectroscopic method used to track the evolution of excited-state processes through ...