Name: light-driven enzymatic decarboxylation
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

זהירות: יש להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. כמה כימיקלים המשמשים סינתזות אלה בחריפות רעילים ומסרטנים. כל הצעדים מעורבים ממיסים אורגניים מזיקים, במיוחד החילוץ של תוצרי התגובה ואת derivatization של חומצות שומן חייב להתבצע תחת במנדף שימוש בציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות ). כל הפעולות הכרוכות אורגניזמים מהונדסים גנטית בעבודה זו דורשת התקנות שאושרו לטיפול של אורגניזמים מהונדסים גנטית של S1 בטיחות ברמה. 1. הביטוי של JE רקומביננטי decarboxylase OleT ב E. coli <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של זן הייצור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן גן סינתטי של OleT JE מ Jeotgalicoccus ו משובטים לתוך וקטור ביטוי Pask-IBA37plus כמתואר. 8 </sup&gt; הערה: כדי למנוע השפלה של חומצות שומן על ידי אנזימים מן מטבוליזם בקטריאלי, E. coli זן JW5020 מאוסף Keio עם מסלול מתפקד שפלת חומצות שומן היה בשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפוח ואינדוקצית ביטוי אנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן-תרבות מראש על ידי לחסן את E. coli JW5020 OleT מוטציה מהצלחת LB-(המכיל 100 מיקרוגרם מ&quot;ל -1 אמפיצילין) בשני 3 מ&quot;ל LB-בינוני במבחנות. אמפיצילין פיפטה (100 מיקרוגרם מ&quot;ל -1) מפתרון המניות לתוך המדיום לבחירה לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות בתוך חממה רועד ב 180 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של תרבויות-מראש לשני 200 מ&quot;ל LB-בינוני, אמפיצילין המכיל (100 מיקרוגרם מ&quot;ל -1), צלוחיות שייק 1 L. הדגירה ממשיכה ב 37 מעלות צלזיוס, 180 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על שינוי 600nm OD לאחר החיסון. כאשר OD 600 מגיע לערך בין 0.6ד 0.8 להשרות את הביטוי על ידי הוספת טטרציקלין (0.2 מיקרוגרם מ&quot;ל -1). דגירת התרבויות במשך 15 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, 180 סל&quot;ד. הערה: מאז OleT JE מכיל פקטור heme, תוספת של δ-אמינו חומצה levulinic (0.5 מ&quot;מ) לפני אינדוקציה שצריך כדי לספק תרבות עם מבשר לסינתזה פקטור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמוגה Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הפעולות הבאות על קרח. מעביר את התרבויות באמצעות אחסון או pipetting לתוך צינורות צנטריפוגות ולהשתמש סולם כדי להבטיח חלוקה שווה. צנטריפוגה התרבויות במשך 20 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להתעלמות supernatant ו resuspend את כדורי ב 50 מ&quot;ל חיץ (טריס 50 מ&quot;מ, 200 מ&quot;מ NaCl, pH 7.5) על ידי pipetting ולהעביר את ההשעיה בתוך שפופרת צנטריפוגות חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 4000 XG ב 4 ° C וזורקים supernatant, resuspend כל גלולה ב 3 מ&quot;ל חיץ ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע תמוגה התא על ידי כךnicating פתרונות על קרח (שלושה המחזורים x 30 שניות) עוזבים הפסקת דקות 1 בין המחזורים. צנטריפוגה הפתרונות במשך 20 דקות ב 15,000 XG ב 4 ° C כדי להסיר פסולת התא ולהעביר את supernatant לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי מבלי להפריע גלולה ידי pipetting. וזורק את הכדור. הערה: חלק ממס אחת ישמש ישירות Biocatalysis לאחר מולקולות קטנות יוסרו. השבר השני ישמש טיהור של JE OleT שלו מתויג. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת מולקולות קטנות של תמציות תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש בתמצית הגולמית Biocatalysis להסיר מולקולות קטנות אשר עלול להפריע לתהליך היווצרות מי חמצן או העברת אלקטרונים על ידי pipetting 3 מיליליטר של תמצית תא ללא ליחידת מסנן צנטריפוגות עם קרום צנטריפוגות 10 kDa ב 4000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. Resuspend החלבון שנותרו 3 מ&quot;ל טריס-HCl חיץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור OleT </strong&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 3 מ&quot;ל של תמצית התא השני לעמודות ספין Ni-נ.ת.ע פור שלו, אשר כבר equilibrated לפני עם חיץ איזון (טריס 20 מ&quot;מ, NaCl 300 מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ imidazole). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את העמודות עם האטם התחתון וכובעים-בורג עליונים ולנער אותם קל עד השרף מחולק באופן שווה עם תמצית התא ללא. דגירת העמודות נטענות במשך 30 דקות בתוך שייקר תקורה ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את העמודות עם 1 מ&quot;ל של חיץ כביסה (טריס 20 מ&quot;מ, NaCl 300 מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ imidazole, pH 7.4) על ידי צנטריפוגה ב XG 700 במשך 2 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עמודות לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי טרי ולהוסיף 1 מ&quot;ל של חיץ elution (טריס 20 מ&quot;מ, NaCl 300 מ&quot;מ, 250 מ&quot;מ imidazole, pH 7.4) OleT י&quot;א. צנטריפוגה ב XG 700 במשך 2 דקות וחזור על שלב זה פעמיים. הערה: Imidazole יהיה לאגד ניקל ובכך להסיר OleT JE מהעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את elution ליחידה מסנן צנטריפוגות (10 ממ kDaטאי טען כי) ו צנטריפוגות ב 4000 XG ב 4 ° C כדי להסיר imidazole. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הטוהר של האנזים על ידי SDS-PAGE (15%). 9 מערבבים 3 μl של elution עם (1x הריכוז הסופי) SDS-חיץ דגירה הפתרון על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עבור denaturation. בהמשך להחיל את הסכום הכולל על SDS-PAGE. הפעל את הג&#39;ל על 35 מילי-אמפר שימוש בתקן חלבון מסחרי. זיהוי החלבון ב 50 kDa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את ריכוז החלבון להשתמש-kit BSA מסחרי זמין. פיפטה 50 μl של דגימות חלבון מדולל (1: 100, 1: 200, 1: 500) ורמת BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 מ&quot;ג מ&quot;ל -1) בצלחת 96-היטב . הוסף 200 μl של מגיב ברדפורד, למדוד את הספיגה ב 595 ננומטר לאחר 15 דקות עם fluorimeter ולחשב ריכוזים באמצעות עקומת הסטנדרט. </li></ol></li></ol> 2. biotransformation אור-catalyzed <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובות biocatalytic ללא תוספת מי חמצן<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון 10 מיליליטר מלאה של 10 מ&quot;מ חומצה סטארית (M r 284.5 גרם mol -1) על ידי הוספת 10% (v / v) tergitol וחומצת 0.0284 גרם סטארית למים מזוקקים. מחמם את הפתרון בתא חימום עד 60 מעלות צלזיוס עד חומצת השומן נמסה לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biocatalysis ודגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו שתי 2 מ&quot;ל תערובות התגובה המכיל 50 mM EDTA, 0.01 מ&quot;מ FMN, 0.5 חומצה סטארית מ&quot;מ טריס-HCl חיץ. הוספת בר בחישה מגנטית לאספקת חמצן מספיק והמקום צינורות זכוכית באמבט מים, מחומם ל -25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 מיקרוגרם מ&quot;ל -1 של האנזים מטוהרים או 10% (v / v) תמצית התא ללא כל של תערובות התגובה ולהאיר אותם עם נורת זכוכית שקופה (120 W) במרחק 15 ס&quot;מ של צינורות התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 200 דגימות μl בנקודות זמן מסוימות (0, 10, 30, 60 ו -120 דקות ושוב ללילה) לעצור את התגובה עם 20 μl 37% HCl. הוסף 5 μl חומצה myristic (המניה 10 מ&quot;מ כךlution) כסטנדרט פנימי. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של תוצרי התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקת להוסיף אתיל אצטט 500 μl על דגימות פעמיים, להפוך את הצינורות צנטריפוגות דקות 1 ב 13,000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוריד 400 μl של supernatant ולתת ממס להתאדות לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Derivatize חומצות קרבוקסיליות לחומצה trimethylsilylcarboxylic על ידי הוספת 200 μl N -methyl- N - (trimethylsilyl) trifluoro acetamide (MSTFA). דגירת הפתרון על 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להמיר קבוצות הידרוקסיל כדי trimethylsilyl אתרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ההמרה על ידי GC / FID הערה: בדוק את היווצרות של 1-heptadecene (RT: 8.34 דק &#39;), חומצה סטארית α- ו β-הידרוקסי (RT: 12.05 ו 12.1 דקות) וירידה של המצע (RT: 11.15 דק&#39;) באמצעות GC / FID. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פרופיל הטמפרטורה מתואר להלן להגדיר את טמפרטורת ההזרקה 340 מעלות צלזיוס. לְהַחזִיקאת טמפרטורת התנור הראשונית היא ב -90 מעלות צלזיוס במשך 3.5 דקות ולאחר מכן להגדיל עם 45 מעלות צלזיוס דקות -1. ב 220 מעלות צלזיוס, להחזיק את הטמפרטורה במשך 2 דקות. לאחר עלייה חוזרת של 45 ° C דקות -1, להחזיק את הטמפרטורה ב 280 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחר מכן להגדיל עם 60 מעלות צלזיוס דקות -1. הערה: טמפרטורה מרבית של 330 ° C הוא מוחזק 1.44 min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 4 μl של המדגם, עם יחס הפיצול של 5 כדי לקבל volatilization מהירה ערבוב הומוגני עם הליום גז המוביל. הערה: תלות טמפרטורת הגדלת המצע והמוצרים ייכנסו שלב הגז. החומרים מזוהים על ידי גלאי GC / FID לאחר שעבר את הטור פעמי שמירה ספציפיות מוצגים כמו פסגות על המסך. לצפות את היווצרות שיא בצג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הריכוז של המוצר שנוצר על פי הנוסחה הבאה: <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; הערה: הגורם הכיול נקבע במיוחד עבור עמודה זו עבור כל מצע מוצר על ידי חישוב עקום הסטנדרט מן לסכומים ידועים של חומרי derivatized ואזור השיא המקביל שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות פסגות חומצה אולפינים ו β-הידרוקסי ידי GC / MS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות פסגות חומצה אולפינים ו β-הידרוקסי ידי GC / MS. הגדר את פרופיל הטמפרטורה. הגדר את הטמפרטורה הזרקת 250 מעלות צלזיוס. החזק את הטמפרטורה בתנור ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן להגדיל עם 20 מעלות צלזיוס דקות -1. הערה: טמפרטורה מרבית מוחזק עבור 7.5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה גלאי ספקטרומטר מסה עד 250 ° C ו לסרוק 50 עד 500 מ &#39;/ z במצב השפעה אלקטרונים. הערה: יינון השפעה אלקטרונים מסירה אלקטרון בודד וכתוצאה מכך היווצרות של קטיון רדיקלי אשר יועברו קדימה לניתוח המוני. בשל קשרי קוולנטיים אנרגית intramolar גבוהים בתוךהפסקת מולקולת יצירה שברי m / z הנמוך. שברים אלה יוצרים טביעת אצבע ספציפית חומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 1 μl של המדגם. זיהוי 1-Heptadecene לאחר זמן שמירה 11.4 דקות על ידי טביעת האצבע המקבילה (איור 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kourist, R., Dom&#236;nguez de Mar&#236;a, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments.">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li><li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taming+of+oxygen:+biocatalytic+oxyfunctionalisations.">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li><li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions.">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li><li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis:+Nonconventional+Regeneration+Methods.">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li><li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases.">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li><li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts.">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).</li><li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+olefin+(1-alkene)+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species.">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li><li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis.">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-independent+production+of+&#945;-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase.">Hydrogen peroxide-independent production of &#945;-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).</li><li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions.">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

דור מונחים-האור של מי חמצן יכול להיות מיושם עבור טרנספורמציות חיזור טווח, כולל peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 ו P450 monooxygenases 5. זוהי גישה קלה מבחינה מעשית. בטווח הארוך, את השימוש של אור הנראה פותח המבט לנצל את אור שמש טרנספורמציות כימיות, המהווה חלופה בת קיימא לתגובות אנרגיה עשירה. השיטה ישימה עם אנזים מטוהר או עם תמצית תא ללא. בעוד שהאחרון דורש פחות עלות ועבודה, יש לציין כי מולקולות קטנות בקטע הגולמי עלולות להפריע המרה היה זרז האור. גישה מעשית היא להסיר רכיבים קטנים אלה עם micromembrane (כלומר, על ידי צנטריפוגה ביחידה מסננת צנטריפוגלי או על ידי דיאליזה). ריכוז של המולקולה אור-קציר FMN קובע את הריכוז של מי חמצן. בהתאם affinity של oxidoreductase, ריכוז זה יש משקל מכריע הפעילות האנזימטית. גורם חשוב נוסף הוא הריכוז של EDTA תורם אלקטרון ההקרבה. הפרמטר החשוב ביותר, לעומת זאת, הוא היציבות התפעולית הפעילות של האנזים. Olefinization של חומצות שומן הוא תגובה אלגנטית עבור ההמרה של חומצות שומן ביו המבוסס לתוך אולפינים ששייכים הסחורות הגדולות לתעשייה הכימית. Decarboxylation biocatalytic מונחה האור יכול להתבצע בטמפרטורת החדר ב- pH נייטרלי, אשר מציעה יתרונות ברורים במונחים של אחריות סביבתית. התוצאות שלנו מראות כי בדור באתרו של מי חמצן היא אסטרטגיה לספק את הפקטור מבלי לפגוע ביציבות אנזים, אשר מוביל להמרה גבוהה. שיטות הווה להתחדשות פקטור להשתמש במוצרים חקלאיים או כימיקלים מבוססי נפט. אור מונע תגובות הם מתעוררים כמו אלטרנטיבה מתחדשת. עתידמחקר יוקדש שיטות ההחלפה של EDTA מגיב ההקרבה ידי מולקולות זולות כדי להפחית את הכמות של FMN המולקולה-קציר אור.

השינוי באקלים ואת הדלדול הנראה לעין של משאבים מתחדשים מהווים איום רציני על החברה שלנו. בהקשר זה, קטליזה אנזים מייצג פוטנציאל עדיין לא מנוצל במלואו לפיתוח בר קיימא &quot;ירוקה&quot; כימית 1. Oxidoreductases יש את היכולת לזרז את כניסתה ושינוי של קבוצות פונקציונליות בתנאי תגובות עדינים שייכים biocatalysts החשוב ביותר 2. רוב טרנספורמציות החיזור דורשות האספקה ​​החיצונית של קו-פקטורים כגון NAD (P) H. שיטות התחדשות פקטור יושמו בקנה מידה תעשייתי. עם זאת, הם עדיין לגרום עלויות גבוהות תהליך, אשר מגבילות את בקשתם בעיקר למוצרים בעלי ערך גבוה. מעניין, כמה peroxidases 3,4 ו monooxygenases P450 5 לקבל אלקטרונים מן מי חמצן דרך המחלף מי שנקרא. בעוד H 2 O 2 הוא שיתוף מגיב זול, זה הוא מדווח harmful עבור אנזימים רבים. יציב במבנה באתרו ריכוזים נמוכים של של מי חמצן הוא גישה מעשית לנהוג התגובה מבלי לפגוע היציבות התפעולית של אנזים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> איור 1. ניסיוני הגדרה של decarboxylation photobiocatalytic חומצות שומן על ידי OleT JE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> השימוש באור כמקור אנרגיה עבור תהליכים כימיים וביולוגיים כבר מושך תשומת לב גוברת בשנים האחרונות 6. אור מונחה הדור של מי חמצן התפתח שיטה קלה חזקה כדי לספק חמצן עבור טרנספורמציות חיזור (איור 1). Photocatalyst כגון פלבין אדנין mononucleotide (FMN) מאפשרת הסרה של חמצן מולקולרי למי חמצן, אשר לאחר מכן משמש פקטור עבור התגובה oxyfunctionalization האנזימטית. תורם אלקטרונים אפשריים הם חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), ascorbate או formiate הזול. השיטה ישימה בדרך כלל H 2 O 2 אנזימים תלויים, כולל peroxidases 3,4 ו P450 monooxygenases 5. חקרנו לאחרונה היישום של decarboxylase חיידקי הרומן 7 עבור הטרנספורמציה של שומנים טבעיים לתוך אולפינים 8. זה יהיה מסלול קיימא לסינתזה של כימיקלי פלטפורמה בשימוש נרחב ממקור ביו מבוסס. Decarboxylase OleT JE מן sp Jeotgalicoccus חיידק חיובי גרם. מזרז את חמצוני decarboxylation של חומצות שומן ויוצר 1-אלקנים כמוצרים. OleT JE קשורה קשר הדוק monooxygenases P450 חיידקים ועליו אלקטרוני from מי חמצן עבור התגובה. למרבה הצער, תוספת של H 2 O 2 פתרון של מצע אנזים שהסתיימה בהמרות נמוכות שחזור עניים של התוצאות, ככל הנראה עקב השפעה מזיקה של מי חמצן על יציבות OleT י&quot;א. דור של חלבון היתוך עם רדוקטאז NADPH RhFred עשה NADPH התלוי decarboxylation אפשרי. 9 עם זאת, המחיר הגבוה של NADPH והאפשרויות המוגבלות עבור התחדשות וחסכונית מתבקשים לנו לחקור תורמי אלקטרונים זולים. בהשראת הדמיון של OleT JE עם monooxygenases P450, השתמשנו דור אור היה הזרז של H 2 O 2. שמחנו לקבל המרות גבוהות (עד&gt; 95%) באמצעות תמציות תא חינם או פתרונות אנזים מטוהרים. עם הדוגמא של decarboxylation חומצות שומן, אנו מציגים פרוטוקול כללי enzym מונחים-אורטרנספורמציות חיזור atic באמצעות FMN כמו מי photocatalyst ומימן כמו-פקטור. השיטות שהוצגו כוללים את הייצור של האנזים בתא רקומביננטי של E. coli, טיהור של האנזים, היישום לסינתזה של 1-אלקנים ועל הניתוח של תוצרי התגובה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Chemicals</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bradford reagent</td>
			<td style="width:131px;">Roth</td>
			<td style="width:173px;">K015.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">BSA</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>90604-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:195px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:173px;">141-78-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:131px;">Roth</td>
			<td style="width:173px;">8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;width:195px;">Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">130-40-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochlorid acid 37%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">7722-84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">&#948;-Amino levulinic acid</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>5451-09-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:61px;width:195px;">N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">24589-78-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Myristic acid &#62;99%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">208-875-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">288-32-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:173px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Stearic acid &#62;99%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">57-11-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">60-54-8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tergitol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">MFCD01779855&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Device</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:195px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:131px;">G-25CK</td>
			<td style="width:173px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">Ecotron</td>
			<td style="width:173px;">Infors HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centrifugation</td>
			<td style="width:131px;">Labofuge 400R</td>
			<td style="width:173px;">Heraeus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">RC 5B Plus</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">Fresco 17</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centrifugation rotors</td>
			<td style="width:131px;">SS34</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">SLA</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Clean bench</td>
			<td style="width:131px;">Envirco</td>
			<td style="width:173px;">Ceag Schirp Reinraum technik</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Column GC-FID&#160;</td>
			<td style="width:131px;">CP-Sil 5CB (30 m x 0.25 mmx 0.25 &#181;m)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Column GC-MS</td>
			<td style="width:131px;">FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Varian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GC-FID</td>
			<td style="width:131px;">GC-2010 plus</td>
			<td style="width:173px;">Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GC-MS</td>
			<td style="width:131px;">IST-40</td>
			<td style="width:173px;">Varian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:131px;">RCT classic</td>
			<td style="width:173px;">IKA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:131px;">SevenEasy</td>
			<td style="width:173px;">Mettler toledo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sonicator</td>
			<td style="width:131px;">Branson Sonifier 250</td>
			<td style="width:173px;">Branson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Spectral photometer</td>
			<td style="width:131px;">FLUOstar Omega</td>
			<td style="width:173px;">BMG Labtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Equipment</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Affinity chromatography column</td>
			<td style="width:131px;">His Pur Ni-NTA spin column</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centricon</td>
			<td style="width:131px;">Vivaspin turbo 15</td>
			<td style="width:173px;">VWR International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Microtiter plates</td>
			<td style="width:131px;">96 Well Multiply&#174;PCR Plates</td>
			<td style="width:173px;">Sarstedt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-driven enzymatic decarboxylation

Oxidoreductases שייך האנזימים התעשייתיים ביותר להחיל. אף על פי כן, הם צריכים אלקטרונים חיצוניים אשר מספק בדרך כלל יקר ומאתגר. מחזור של NADH תורם אלקטרונים או NADPH מחייב השימוש של אנזימים נוספים מצעי הקרבה. מעניין, כמה oxidoreductases לקבל חמצן כתורם אלקטרונים. בעת היותו זול, מגיב זה לעתים קרובות מקטין את היציבות של אנזימים. פתרון לבעיה זו הוא הדור באתרו של הפקטור. האספקה ​​הרציפה של הפקטור בריכוז נמוך שמניעה את התגובה מבלי לפגוע ביציבות אנזים. מסמך זה מדגים שיטה לייצור האור-catalyzed באתרו של מי חמצן עם הדוגמא של decarboxylase חומצת שומן תלוי heme OleT י&quot;א. Decarboxylase חומצות שומן OleT JE התגלה בשל היכולת הייחודית שלנו להפיק 1-אלקנים ארוכי שרשרת מחומצות שומן, אנזימטי עד כה לא ידועתְגוּבָה. 1-אלקנים משמשים תוספים נרחבים plasticizers וחומרי סיכה. OleT JE הוכח לקבל אלקטרונים מן מי חמצן עבור decarboxylation חמצוני. בעוד תוספת של נזקים מי חמצן האנזים וכתוצאה מכך תשואות נמוכות, בדור באתרו של פקטור עוקף את הבעיה הזאת. מערכת photobiocatalytic תערוכות יתרונות ברורים לגבי פעילות אנזים ואת התשואה, וכתוצאה מכך מערכת פשוטה ויעילה עבור decarboxylation חומצות שומן.

<html> בעוד התוספת של מי חמצן לתערובת התגובה הביאה נמוך עד בינוני מרות (&lt;10%), בדור באתרו של מי חמצן מוגבר ההמרה עד מרת 80%. ניתוח על פי GC / MS מציג את ההיווצרות של אולפינים מחומצות שומן (איור 2). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> איור 2. (א) פרופיל טמפרטורה למדידות GC / MS. (ב) טביעות אצבע של משחררי 1-heptadecene אחרי 11.4 דקות. (C) יונים שבר מאפיין משני C n H 2n-1 של למופת אולפינים מסוף המוצגים עבור 1-heptadecene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> -together.within-page = &quot;1&quot;&gt; תגובת האור-catalyzed השיגה המרות גבוהות עם תמציות ללא תאים של E. coli. פתרון אנזים מטוהר הראה מתאם ברור בין ריכוז אנזים ומר. הגדלת הריכוז של עופרת FMN מולקולת אור-קציר להמרות גבוהה. עם זאת, להגדיל את הריכוז מעל 10 מ&quot;מ לא נוספת להאיץ את התגובות, המציין את כמות מי חמצן זמין מספיק כבר לא הגורם המגביל. בנוסף decarboxylation של חומצות שומן, OleT JE גם מזרז hydroxylation in-העמדה β. המרה של חומצה סטארית, את decarboxylation הוא מהיר בערך פי שלושה מאשר hydroxylation. בניסוי טיפוסי באמצעות פתרון של חומצה סטארית 0.5 מ&quot;מ ו 10 מיקרומטר FMN, 99% של המצע הוסבו תערובת של 1-heptadecene וחומצה 2-hydroxystearic עם יחס של3.3: 1 (איור 3) 8. מבדיקה של הספקטרום המצע של Biocatalysis מונחי-האור הראו כי חומצות שומן עם שרשראות acyl עוד, OleT JE מועדף מזרז את decarboxylation, בעוד הכמות היחסית של חומצות שומן הידרוקסיל בתערובת המוצר גדל עם אורך שרשרת קצר. חומצות שומן קצרות יותר חומצת myristic (C14) שלא עברו decarboxylation. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> איור 3. ניתוח chromatographic גז של OleT JE בתיווך decarboxylation של חומצה סטארית (11.15 דק &#39;) לתוך 1-heptadecene (8.4 דק&#39;), חומצה סטארית-הידרוקסי α (12.04 דק &#39;) חומצה סטארית β-הידרוקסי (12.1 דק&#39;). השינוי של אזורי השיא ממדגמים השתלטו קורס פעמי של 2 hr מוצג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן vie</a>ווה גרסה גדולה יותר של דמות זו. באופן מפתיע, חומצה אולאית בלתי רוויות חומצות (C18: 1d9 cis) וחומצה לינולאית (C18: 2d9d12) לא נתקבלו כמו מצעים, המציין כי תצורת המעוות של קשרים כפולים ציס לא ניתן לאכלס מצב מחייב פרודוקטיבי האנזים. תוספת של חומצה אולאית (10%) גם מנעה את ההמרה של חומצה סטארית. מעניין, חומצה סטארית (C18: 1d9 טרנס) הוסב על ידי OleT JE, עדיין עם פעילות נמוכה מעט ואז חומצה סטארית.

Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

אנו מתארים פרוטוקול עבור דור האור היה זרז של מי חמצן - גורם-שותף עבור טרנספורמציות חמצונים.

אור מונחה אנזימתי Decarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Carboxylic Acids

SCIENTISTS IN ACTION

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

הביולוגי קטליזה חמה: Isothermal טיטרציה Calorimetry לאפיין תגובות אנזימטיות

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

פירוק דינמי גרעיני קיטוב Instrumentation מדידות קצב התגובה האנזימטית בזמן אמת על ידי התמ&quot;ג

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

תגובות אנזימטיות אשד לסינתזה של כהלים אמינו כיראלי מ L-ליזין

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

מונחי-אור המנועים המולקולריים על משטחים עבור יחיד הדמיה מולקולרית

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

סינתזה אנזימטית של אפוקסי מטבוליטים של דוקוסקסהקאקאנוק, אייאיסאופנטנואית וחומצות ארכידונית

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Decoding Transient Absorption - Processing, Fitting, and Interpreting Data

An Introduction to Processing, Fitting, and Interpreting Transient Absorption Data

Author Spotlight: Exploring Light-Driven Chemical Reactions and Energy-Harnessing Devices in Photochemical Research

Transient absorption (TA) spectroscopy is a powerful time-resolved spectroscopic method used to track the evolution of excited-state processes through ...