Name: light-driven enzymatic decarboxylation
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

Forsiktig: Sjå alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Flere av kjemikaliene som brukes i disse syntesene er akutt giftige og kreftfremkallende. Alle trinn involverer skadelige organiske løsemidler, særlig utvinning av reaksjonsproduktene og derivatisering av fettsyrer må utføres under en avtrekkshette ved hjelp av personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, frakk, full-lengde bukser, lukket-toe sko ). Alle operasjoner som involverer genmodifiserte organismer i dette arbeidet krever installasjoner som er godkjent for håndtering av genmodifiserte organismer av sikkerhetsnivået S1. 1. Uttrykk av rekombinant Decarboxylase Olet JE i E. coli <ol><li> Fremstilling av produksjonsstammen <ol><li> Fremstille et syntetisk gen av olet JE fra Jeotgalicoccus og klonet inn i ekspresjonsvektoren påsk-IBA37plus som beskrevet. 8 </sup&gt; MERK: For å unngå nedbrytning av fettsyrer av enzymer fra bakteriell metabolisme, E. coli stamme JW5020 fra Keio samlingen med en dysfunksjonell vei for fettsyre degradering ble brukt. </li></ol></li><li> Dyrking og induksjon av enzymet uttrykk <ol><li> Forbered en pre-kultur ved inokulering E. coli JW5020 Olet mutant fra en LB-plate (som inneholder 100 mikrogram ml -1 ampicillin) i to 3 ml LB-medium i reagensglass. Pipetter ampicillin (100 ug ml -1) fra en stamløsning i mediet for seleksjon og inkuber ved 37 ° C i 15 timer i en rysteinkubator ved 180 rpm. </li><li> Tilsett 2 ml av pre-kulturene til to 200 ml LB-medium, som inneholder ampicillin (100 ug ml -1), i 1 L risteflasker. Inkubering foregår ved 37 ° C og 180 rpm. </li><li> Overvåk endringen i OD 600nm etter vaksinasjonen. Når OD 600 når en verdi mellom 0,6 end 0,8 indusere uttrykk ved å legge tetracyklin (0,2 mikrogram ml -1). Inkuber kulturene i 15 timer ved 20 ° C og 180 rpm. Merk Fordi olet JE inneholder en heme kofaktor, er tilsetningen av δ-amino levulinsyre (0,5 mM) før induksjon nødvendig for å gi den kultur med en forløper for kofaktor syntese. </li></ol></li><li> cellelyse <ol><li> Utfør følgende trinn på is. Overfør kulturene ved dekantering eller pipettering til sentrifugerør og bruk en skala for å sikre lik fordeling. Sentrifuger kulturer i 20 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C. </li><li> forkaste nøye supernatanten og resuspender pelleten i 50 ml buffer (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) ved pipettering og overfører suspensjonen i et konisk sentrifugerør. </li><li> Etter sentrifugering i 15 minutter ved 4000 xg ved 4 ° C kast supernatanten, resuspender hver pellet i 3 ml buffer ved pipettering. </li><li> Utfør cellelyse av såsom kommuniserer løsningene på is (tre sykluser x 30 sek) forlater en 1 min pause mellom sykluser. Sentrifuger løsninger for 20 min ved 15.000 xg ved 4 ° C for å fjerne celleavfall og supernatanten overføres til et konisk rør sentrifugering uten å forstyrre pelleten ved pipettering. Kast pelleten. MERK: En løsningsmiddelfraksjon skal benyttes direkte for biocatalysis etter små molekyler er fjernet. Den andre fraksjonen vil bli brukt for rensing av His-merket olet JE. </li></ol></li><li> Fjerning av små molekyler av celle-ekstrakter <ol><li> Før bruk av råekstraktet i biocatalysis fjerne små molekyler som kan interferere med hydrogenperoksyd dannelse eller elektronoverføring ved å pipettere 3 ml cellefritt ekstrakt inn i en sentrifuge filterenhet med en 10 kDa membran og sentrifuger ved 4000 xg ved 4 ° C. Resuspender den gjenværende protein i 3 ml Tris-HCl-buffer. </li></ol></li><li> Rensing av olet </strong&gt; <ol><li> Anvende 3 ml av andre celleekstrakt til sine Pur Ni-NTA sentrifugekolonner, som har blitt ekvilibrert før med ekvilibreringsbuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, 10 mM imidazol). </li><li> Forsegl kolonner med den nedre plugg og øvre skruelokk og riste dem lett inntil harpiksen fordeles likt med den cellefrie ekstrakt. Inkuber fylte kolonner i 30 min i en overhead-risteapparat ved 4 ° C. </li><li> Vask kolonne med 1 ml vaskebuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,4) ved sentrifugering ved 700 xg i 2 min. Gjenta dette trinnet to ganger. </li><li> Plasser kolonnene inn i en ny sentrifugering konisk rør og tilsett 1 ml elueringsbuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, 250 mM imidazol, pH 7,4) olet JE. Sentrifuger ved 700 xg i 2 min og gjenta dette trinnet to ganger. MERK: Imidazole vil binde seg til nikkel og således fjerne olet JE fra kolonnen. </li><li> Overfør eluering til en sentrifuge filterenhet (10 kDa membrane) og sentrifuger ved 4000 xg ved 4 ° C for å fjerne imidazol. </li><li> Sjekke renheten til enzymet ved hjelp av en SDS-PAGE (15%). 9. Blanding 3 ul av elueringsoppløsningen med en SDS-buffer (sluttkonsentrasjon 1x) og inkubere oppløsningen ved 95 ° C i 5 minutter for denaturering. Deretter gjelder det totale beløpet på en SDS-Page. Kjør gelen ved 35 mA ved anvendelse av en kommersiell proteinstandard. Påvise proteinet på 50 kDa. </li><li> For å bestemme proteinkonsentrasjonen bruke et kommersielt tilgjengelig BSA-kit. Pipetter 50 ul fortynnede proteinprøver (1: 100, 1: 200, 1: 500) og BSA-standard (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml-1) i en 96-brønns plate . Tilsett 200 ul av Bradford-reagens, måle absorbansen ved 595 nm etter 15 minutter med et fluorimeter og beregne konsentrasjoner ved hjelp av standardkurven. </li></ol></li></ol> 2. Lys-katalysert Biotransformasjon <ol><li> Biokatalytiske reaksjoner uten hydrogenperoksyd tilsetning<ol><li> Fremstille en 10 ml stamløsning av 10 mM stearinsyre (M r 284,5 g mol -1) ved tilsetning av 10% (v / v) -tergitol og 0,0284 g stearinsyre til destillert vann. Varm løsningen i et varmekammer til 60 ° C inntil fettsyren er fullstendig oppløst. </li><li> Biocatalysis og prøvetaking <ol><li> Fremstille to 2 ml reaksjonsblandinger inneholdende 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM stearinsyre i Tris-HCl-buffer. Legg til en magnetisk rørestav for tilstrekkelig oksygentilførsel og plassere glassrørene i et vannbad oppvarmet til 25 ° C. </li><li> Legg 200 ug ml -1 renset enzym eller 10% (v / v) cellefritt ekstrakt til hver av reaksjonsblandingene og belyse dem med et klart glass lyspære (120 W) i 15 cm avstand fra reaksjonsrørene. </li><li> Ta 200 ul prøver på bestemte tidspunkter (0, 10, 30, 60 og 120 min og over natt) stopping av reaksjonen med 20 mL 37% HCl. Tilsett 5 ul myristinsyre (10 mM stam såning) som intern standard. </li></ol></li></ol></li><li> Analyse av reaksjonsproduktene <ol><li> For ekstraksjon tilsett 500 mL etylacetat til prøvene to ganger, snu rørene og sentrifuger i 1 min ved 13 000 x g. </li><li> Ta av 400 mL av supernatant og la løsemiddelet helt fordampe. </li><li> Derivatisere karboksylsyrene til trimethylsilylcarboxylic syre ved tilsetning av 200 ul N-metyl-N - (trimetylsilyl) trifluor acetamid (MSTFA). Inkuber løsningen ved 60 ° C i 30 minutter for å omdanne hydroksylgruppene til trimetylsilyl-etere. </li><li> Fastsettelse av konvertering av GC / FID MERK: Bestem dannelse av 1-heptadecen (RT: 8,34 min), α- og β-hydroksy-stearinsyre (RT: 12,05 og 12,1 min) og reduksjon av substratet (RT: 11,15 min) ved å bruke GC / FID. <ol><li> Still temperaturprofilen beskrevet nedenfor Set injeksjons temperaturen til 340 ° C. Holdeden innledende ovn har en temperatur på 90 ° C i 3,5 minutter og stiger deretter til 45 ° C min -1. Ved 220 ° C, holde temperaturen i 2 min. Etter en gjentatt økning på 45 ° C min -1, holde temperaturen ved 280 ° C i 2 minutter og deretter øker med 60 ° C min -1. MERK: Maksimumstemperatur på 330 ° C holdes for 1,44 min. </li><li> Injiser 4 pl av prøven, med et deleforhold på 5 for å få rask fordampning og homogen blanding med bæregassen helium. MERK: I avhengighet av den økende temperatur substratet og produktene kommer inn i gassfasen. Stoffene blir detektert av GC / FID detektor etter å ha passert kolonnen ved bestemte retensjonstider og vises som topper på skjermen. Observer topp formasjon på skjermen. </li><li> Beregne konsentrasjonen av produkt dannet ved den følgende formel: <img alt="ligning 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; MERK: Kalibreringsfaktoren har blitt bestemt spesifikt på dette kolonne for hvert substrat og produkt ved å beregne standardkurven fra kjente mengder av de derivatiserte stoffer og deres tilhørende toppområdet. </li></ol></li><li> Identifisere olefin og p-hydroxy-syretopper ved GC / MS. <ol><li> Identifisere olefin og p-hydroxy-syretopper ved GC / MS. Still temperaturprofilen. Sett injeksjonstemperaturen til 250 ° C. Hold temperaturen i ovnen ved 100 ° C i 5 minutter og stiger deretter til 20 ° C min -1. MERK: Maksimum temperatur holdes i 7,5 min. </li><li> Still massespektrometer detektortemperatur på 250 ° C og skann ved 50 til 500 m / z i elektronstøt-modus. MERK: elektronstøt ionisering fjerner et enkelt elektron som resulterer i dannelsen av et radikal-kation som vil bli ført fremover for masseanalyse. På grunn av de høye intramolar energi kovalente bindinger innenformolekyl pause skape fragmenter av lavere m / z. Disse fragmentene utgjør et fingeravtrykk som er spesifikt for et stoff. </li><li> Injiser 1 mL av prøven. Detektere 1-heptadecen etter 11,4 minutter oppholdstid ved den tilsvarende fingeravtrykk (figur 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kourist, R., Dom&#236;nguez de Mar&#236;a, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments.">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li><li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taming+of+oxygen:+biocatalytic+oxyfunctionalisations.">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li><li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions.">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li><li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis:+Nonconventional+Regeneration+Methods.">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li><li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases.">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li><li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts.">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).</li><li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+olefin+(1-alkene)+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species.">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li><li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis.">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-independent+production+of+&#945;-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase.">Hydrogen peroxide-independent production of &#945;-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).</li><li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions.">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Lyset drevet generasjon av hydrogen peroxide kan brukes for en rekke redoks transformasjoner, inkludert peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 og P450 monooxygenases 5. Det er en enkel og praktisk tilnærming. På lang sikt, åpnes ved bruk av synlig lys opp i perspektiv for å utnytte sollyset for kjemiske omdannelser, som er et bærekraftig alternativ for energirike reaksjoner. Fremgangsmåten er anvendelig med renset enzym eller med cellefritt ekstrakt. Mens den sistnevnte krever mindre kostnad og arbeid, bør det bemerkes at små molekyler i råekstraktet kan interferere med lys katalyserte konvertering. En praktisk fremgangsmåte er å fjerne disse små komponenter med en micromembrane (dvs. ved sentrifugering i en sentrifugal filterenhet eller ved dialyse). Konsentrasjonen av den lette innhøsting molekyl FMN bestemmer konsentrasjonen av hydrogenperoksydet. Avhengig av Affinity av oksidoreduktase, er denne konsentrasjonen avgjørende for den enzymatiske aktivitet. En annen viktig faktor er den konsentrasjonen av offerelektrondonor EDTA. Den viktigste parameter, er imidlertid den operative stabilitet og aktivitet av enzymet. Den olefinization av fettsyrer er en elegant reaksjon for konvertering av biobaserte fettsyrer i olefiner som tilhører de store varer for den kjemiske industrien. Lyset-drevet biokatalytisk dekarboksylering kan utføres ved romtemperatur og ved nøytral pH, og har klare fordeler når det gjelder bærekraft. Våre resultater viser at in situ dannelse av hydrogenperoksyd er en strategi for å forsyne kofaktor uten å svekke enzymstabilitet, noe som fører til en høy omdannelse. Presentere metoder for kofaktor regenerering bruke landbruksprodukter eller bensinbaserte kjemikalier. Lys-drevet reaksjoner er fremstår som fornybar alternativ. Framtidforskning vil være dedikert til metoder for substitusjon av offer reagens EDTA ved billigere molekyler og for å redusere mengden av den lette innhøsting molekyl FMN.

Den klimaendringer og overskuelig uttømming av fornybare ressurser utgjør en alvorlig trussel mot vårt samfunn. I denne sammenheng representerer enzymkatalyse en fortsatt ikke fullt utnyttet potensial for utvikling av bærekraftige og &quot;grønnere&quot; kjemi 1. Oksidoreduktaser har kapasitet til å katalysere innføring og modifisering av funksjonelle grupper under milde reaksjonsbetingelsene og hører til de viktigste biokatalysatorer 2. De fleste redoks transformasjoner krever tilførsel av ytre av kofaktorer så som NAD (P) H. Metoder for kofaktor regenerering har blitt brukt i industriell skala. Men de fortsatt resultere i høye prosesskostnader, som begrenser deres søknad meste til høyverdige produkter. Interessant, flere peroxidases 3,4 og P450 monooxygenases 5 akseptere elektroner fra hydrogen peroxide via den såkalte peroxide shunt. Mens H 2 O 2 er et billig co-reagens, er det angivelig harmful for mange enzymer. En jevn in situ dannelse av lave konsentrasjoner av hydrogenperoksyd er en levedyktig metode for å drive reaksjonen uten å forringe driftsstabilitet av enzymet. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Figur 1. Eksperimentell oppsett av photobiocatalytic dekarboksylering av fettsyrer av olet JE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> Bruken av lys som energikilde for kjemiske og biologiske prosesser har fått økt oppmerksomhet de siste årene 6. Lys-drevet generering av hydrogenperoksyd har dukket opp som en enkel og robust metode for å forsyne hydrogenperoksyd for redox-transformasjoner (figur 1). En fotokatalysator som flavin adenin manonucleotide (FMN) kan reduksjonen av molekylært oksygen til hydrogenperoksid, som deretter anvendes som kofaktor for den enzymatiske oxyfunctionalization reaksjonen. Mulige elektrondonorer er etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), askorbat eller billig formiat. Metoden er som gjelder generelt for H 2 O 2 -avhengige enzymer, inkludert peroxidases 3,4 og P450 monooxygenases 5. Vi har nylig undersøkt anvendelsen av en ny bakteriell dekarboksylase 7 for transformasjonen av naturlig fett til olefiner 8. Dette ville være en bærekraftig rute for syntese av mest brukte plattform kjemikalier fra et biobasert kilde. Den decarboxylase olet JE fra den gram-positive bakterie Jeotgalicoccus sp. katalyserer den oksydative dekarboksylering av fettsyrer og danner 1-alkener som produkter. Olet JE er nært knyttet til bakterielle P450 monooxygenases og trenger elektroner from hydrogenperoksyd for reaksjonen. Dessverre, tilsetning av H 2 O 2 til en løsning av substrat og enzym resultert i lave omsettinger og en dårlig reproduserbarhet av resultatene, antagelig på grunn av en skadelig virkning av hydrogenperoksyd på stabiliteten av olet JE. Generering av et fusjonsprotein med NADPH-reduktase RhFred laget en NADPH-avhengig dekarboksylering mulig. 9 Likevel den høye prisen på NADPH og dagens begrensede muligheter for en kostnadseffektiv regenerering bedt oss om å undersøke billigere elektrondonorer. Inspirert av likheten av olet JE med P450 monooxygenases, brukte vi lys-katalysert generasjon av H 2 O 2. Vi var glade for å oppnå høye konverteringer (opp til&gt; 95%) ved hjelp av cellefrie ekstrakter eller rensede enzymløsninger. Med eksempel på fettsyre dekarboksylering, gir vi en generell protokoll for lys-drevet enzymtiske redoks transformasjoner ved hjelp FMN som photocatalyst og hydrogen peroxide som kofaktor. De presenterte fremgangsmåter omfatter fremstilling av enzymet i rekombinant celle av E. coli, rensing av enzymet, anvendelse for syntese av 1-alkener, og analyse av reaksjonsproduktene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Chemicals</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bradford reagent</td>
			<td style="width:131px;">Roth</td>
			<td style="width:173px;">K015.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">BSA</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>90604-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:195px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:173px;">141-78-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:131px;">Roth</td>
			<td style="width:173px;">8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;width:195px;">Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">130-40-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochlorid acid 37%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">7722-84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">&#948;-Amino levulinic acid</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>5451-09-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:61px;width:195px;">N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">24589-78-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Myristic acid &#62;99%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">208-875-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">288-32-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:173px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Stearic acid &#62;99%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">57-11-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">60-54-8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tergitol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">MFCD01779855&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Device</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:195px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:131px;">G-25CK</td>
			<td style="width:173px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">Ecotron</td>
			<td style="width:173px;">Infors HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centrifugation</td>
			<td style="width:131px;">Labofuge 400R</td>
			<td style="width:173px;">Heraeus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">RC 5B Plus</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">Fresco 17</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centrifugation rotors</td>
			<td style="width:131px;">SS34</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">SLA</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Clean bench</td>
			<td style="width:131px;">Envirco</td>
			<td style="width:173px;">Ceag Schirp Reinraum technik</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Column GC-FID&#160;</td>
			<td style="width:131px;">CP-Sil 5CB (30 m x 0.25 mmx 0.25 &#181;m)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Column GC-MS</td>
			<td style="width:131px;">FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Varian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GC-FID</td>
			<td style="width:131px;">GC-2010 plus</td>
			<td style="width:173px;">Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GC-MS</td>
			<td style="width:131px;">IST-40</td>
			<td style="width:173px;">Varian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:131px;">RCT classic</td>
			<td style="width:173px;">IKA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:131px;">SevenEasy</td>
			<td style="width:173px;">Mettler toledo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sonicator</td>
			<td style="width:131px;">Branson Sonifier 250</td>
			<td style="width:173px;">Branson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Spectral photometer</td>
			<td style="width:131px;">FLUOstar Omega</td>
			<td style="width:173px;">BMG Labtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Equipment</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Affinity chromatography column</td>
			<td style="width:131px;">His Pur Ni-NTA spin column</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centricon</td>
			<td style="width:131px;">Vivaspin turbo 15</td>
			<td style="width:173px;">VWR International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Microtiter plates</td>
			<td style="width:131px;">96 Well Multiply&#174;PCR Plates</td>
			<td style="width:173px;">Sarstedt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-driven enzymatic decarboxylation

Oxidoreductases tilhører de mest anvendte industrielle enzymer. Likevel må de ytre elektroner hvis tilførsel er ofte kostbart og vanskelig. Resirkulering av den elektrondonorer NADH eller NADPH som krever bruk av ytterligere enzymer og offer substrater. Interessant nok flere oxidoreductases godta hydrogenperoksyd som elektrondonor. Mens den er billig, denne reagensen reduserer ofte stabiliteten av enzymene. En løsning på dette problemet er in situ dannelse av kofaktor. Den kontinuerlige tilførsel av kofaktor ved lav konsentrasjon driver reaksjonen uten å redusere enzymstabilitet. Dette papir demonstrerer en fremgangsmåte for lys-katalysert in situ dannelse av hydrogenperoksyd med eksempelet av heme-avhengige fettsyre decarboxylase olet JE. Fettsyre decarboxylase olet JE ble oppdaget på grunn av dens enestående evne til å produsere langkjedede 1-alkener fra fettsyrer, et hittil ukjent enzymatiskreaksjon. 1-alkener er mye brukt additiver for myknere og smøremidler. Olet JE har vist seg å akseptere elektroner fra hydrogenperoksyd for den oksydative dekarboksylering. Mens tilsetning av hydrogenperoksyd skader enzym og resulterer i lave utbytter, in situ-genereringen av kofaktor omgår dette problem. Den photobiocatalytic Systemet viser klare fordeler med hensyn til enzymaktivitet og utbytte, noe som resulterer i et enkelt og effektivt system for fettsyre dekarboksylering.

Mens tilsetningen av hydrogenperoksyd til reaksjonsblandingen resulterte i lave til moderate konverteringer (&lt;10%), in situ dannelse av hydrogenperoksyd økt omdannelse opp til 80% omdannelse. Analyse ved GC / MS viser dannelsen av olefiner fra fettsyrer (figur 2). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> Figur 2 (A) Temperaturprofil for GC / MS-målinger. (B) Fingeravtrykks av 1-heptadecen utdrivning etter 11,4 min. (C) Karakteristiske sekundære C n H 2n-1 fragmentioner av terminal olefiner eksemplarisk vist for en-heptadecen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> E. coli. En renset enzym løsning viste en klar sammenheng mellom enzymkonsentrasjon og konvertering. Øke konsentrasjonen av lys for innhøsting molekyl FMN føre til høyere konverteringer. En økning av konsentrasjonen over 10 mM ikke ytterligere å akselerere reaksjonene, noe som indikerer at mengden av hydrogenperoksyd er tilstrekkelig tilgjengelig og ikke lenger er den begrensende faktor. I tillegg til den dekarboksylering av fettsyrer, olet JE katalyserer også en hydroksylering i β-stilling. I omdannelsen av stearinsyre, er de dekarboksylering omtrent tre ganger hurtigere enn den hydroksylering. I et typisk eksperiment ved bruk av en oppløsning på 0,5 mM stearinsyre og 10 mM FMN, ble 99% av substratet omdannet til en blanding av 1-heptadecen og 2-hydroxystearinsyre med et forhold av3.3: 1 (figur 3) 8. En undersøkelse av substratet spektrum av lys-drevet biocatalysis viste at for fettsyrer med lengre acylkjeder, olet JE fortrinnsvis katalyserer dekarboksylering, mens den relative mengde av hydroksyl-fettsyrer i produktblandingen økes med kortere kjedelengde. Fettsyrer kortere enn myristinsyre (C14) ikke gjennom dekarboksylering. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Figur 3. Gasskromatografisk analyse av olet JE-formidlet dekarboksylering av stearinsyre (11,15 min) i 1-heptadecen (8,4 min), α-hydroksy stearinsyre (12,04 min) β-hydroksy stearinsyre (12,1 min). Endringen av de travleste områdene fra prøver tatt over en tids løpet av to timer vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å vie</a>wa større versjon av dette tallet. Overraskende, umettede syrene oljesyre (C18: 1d9 cis) og linolsyre (C18: 2d9d12) ble ikke aksepteres som substrater, noe som indikerer at vridd konfigurasjon av cis-dobbeltbindinger ikke kan innlemmes i en produktiv bindende modus i enzymet. Tilsetning av oljesyre (10%) også hindret omdannelse av stearinsyre. Interessant, stearinsyre: ble (C18 1d9 trans) omdannes ved Olet JE, men med noe lavere aktivitet da stearinsyre.

Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Vi beskriver en protokoll for lys-katalysert generering av hydrogenperoksyd - en kofaktor for oksidative transformasjoner.

Lys-drevet Enzymatisk dekarboksylering

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Carboxylic Acids

SCIENTISTS IN ACTION

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Hot Biological Katalyse: Isotermisk Titrering Calorimetry å karakter enzymatiske reaksjoner

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Oppløsning Dynamic Nuclear Polarisering Instrumentering for Real-time enzymatiske reaksjonen rate målinger av NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatisk syntese av N- glykaner for matrisen utvikling og HIV antistoff profilering

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Enzymatisk Cascade reaksjoner for syntese av Chiral Amino alkoholer fra L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Lys-drevet molekylær motorer på overflater for enkelt molekylær Imaging

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Enzymatisk syntese av Epoxidized metabolitter av dokosaheksaensyre, eikosapentaensyre, og arachidonic syrer

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Decoding Transient Absorption - Processing, Fitting, and Interpreting Data

An Introduction to Processing, Fitting, and Interpreting Transient Absorption Data

Author Spotlight: Exploring Light-Driven Chemical Reactions and Energy-Harnessing Devices in Photochemical Research

Transient absorption (TA) spectroscopy is a powerful time-resolved spectroscopic method used to track the evolution of excited-state processes through ...