Name: light-driven enzymatic decarboxylation
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

Varning: Kontakta alla relevanta säkerhetsdatablad (SDB) före användning. Flera av de kemikalier som används i dessa synteser är akut toxiska och karcinogena. Alla steg som involverar skadliga organiska lösningsmedel, i synnerhet utvinning av reaktionsprodukterna och derivatisering av fettsyrorna måste utföras under ett dragskåp med hjälp av personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, skyddsrock, full längd byxor, slutna tå skor ). All verksamhet som omfattar genetiskt modifierade organismer i detta arbete kräver installationer som är godkända för hantering av genetiskt modifierade organismer säkerhetsnivån S1. 1. Expression av rekombinant Decarboxylase olet JE i E. coli <ol><li> Framställning av produktionsstammen <ol><li> Framställa en syntetisk gen av olet JE från Jeotgalicoccus och klonades in i expressionsvek PASK-IBA37plus såsom beskrivits. 8 </sup&gt; OBS: För att undvika nedbrytning av fettsyror av enzymer från bakteriemetabolismen, E. coli-stam JW5020 från Keio kollektionen med en dysfunktionell väg för fettsyranedbrytning användes. </li></ol></li><li> Odling och induktion av enzymuttryck <ol><li> Förbereda en pre-kultur genom ympning av E. coli JW5020 olet mutant från en LB-platta (innehållande 100 ug ml -1 ampicillin) i två 3 ml LB-medium i provrör. Pipett ampicillin (100 | j, g ml -1) från en förrådslösning i mediet för selektion och inkubera vid 37 ° C under 15 h i en skakinkubator vid 180 rpm. </li><li> Tillsätt 2 ml av pre-kulturer två 200 ml LB-medium, innehållande ampicillin (100 mikrogram ml -1) i 1 L skakflaskor. Inkubation fortgår vid 37 ° C och 180 rpm. </li><li> Övervaka förändringen i OD 600 nm efter inokuleringen. När OD 600 når ett värde mellan 0,6 end 0,8 inducera uttryck genom att tillsätta tetracyklin (0,2 mikrogram ml -1). Inkubera kulturerna i 15 h vid 20 ° C och 180 rpm. OBS: Eftersom olet JE innehåller ett heme kofaktor, är nödvändig tillsats av δ-amino levulinsyra (0,5 mM) före induktion för att ge kulturen med en prekursor för kofaktor syntes. </li></ol></li><li> cellys <ol><li> Utför följande steg på is. Överför kulturer genom dekantering eller pipettering i centrifugrör och använd en skala för att säkerställa jämn fördelning. Centrifugera odlingarna för 20 minuter vid 12.000 xg vid 4 ° C. </li><li> Noggrant kassera supernatanten och resuspendera pelletarna i 50 ml buffert (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) genom att pipettera och överföra suspensionen i ett koniskt centrifugrör. </li><li> Efter centrifugering under 15 min vid 4000 xg vid 4 ° C kassera supernatanten, återsuspendera varje pellet i 3 ml buffert genom pipettering. </li><li> Utföra cellys genom sånicating lösningarna på is (tre cykler x 30 sek) som lämnar en 1 min paus mellan cyklerna. Centrifugera lösningar för 20 minuter vid 15.000 xg vid 4 ° C för att avlägsna celldebris och överför supernatanten in i ett koniskt centrifugrör utan att störa pelleten genom pipettering. Kassera pellet. OBS: En lösningsmedelsfraktion kommer att användas direkt för biokatalys efter små molekyler avlägsnas. Den andra fraktionen kommer att användas för rening av His-märkt olet JE. </li></ol></li><li> Borttagning av små molekyler av cellextrakt <ol><li> Före användning av det råa extraktet i biokatalys avlägsna små molekyler som skulle kunna interferera med väteperoxid bildning eller elektronöverföring genom pipettering 3 ml cellfritt extrakt i en centrifug filterenhet med en kDa membran och centrifugera 10 vid 4000 xg vid 4 ° C. Resuspendera den återstående proteinet i 3 ml Tris-HCl-buffert. </li></ol></li><li> Rening av olet </strong&gt; <ol><li> Applicera 3 ml i den andra cellextraktet till sina Pur Ni-NTA spinnkolonner, vilka har ekvilibrerats tidigare med jämviktsbuffert (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM). </li><li> Försegla kolonnerna med de nedre pluggar och övre skruvlock och skaka dem lätt tills hartset fördelas lika med det cellfria extraktet. Inkubera de inlästa kolumnerna för 30 min i en överliggande skakare vid 4 ° C. </li><li> Tvätta kolonnerna med 1 ml tvättbuffert (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,4) genom centrifugering vid 700 xg under 2 min. Upprepa detta steg två gånger. </li><li> Placera kolonnerna i ett nytt koniskt centrifugrör och tillsätt 1 ml elueringsbuffert (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7,4) olet JE. Centrifugera vid 700 xg under 2 minuter och upprepa detta steg två gånger. OBS: Imidazol kommer att binda till nickel och därmed ta bort olet JE från kolonnen. </li><li> Överföra elueringen till en centrifug filterenhet (10 kDa membrane) och centrifugera vid 4000 xg vid 4 ° C för att avlägsna imidazol. </li><li> Kontrollera renheten av enzymet genom en SDS-PAGE (15%). 9 Blanda 3 | il av eluering med en SDS-buffert (slutlig koncentration 1 x) och inkubera lösningen vid 95 ° C under 5 min för denaturering. Därefter gäller det totala beloppet på en SDS-PAGE. Kör gelen vid 35 mA med ett kommersiellt proteinstandard. Identifiera proteinet vid 50 kDa. </li><li> För att bestämma proteinkoncentrationen använda ett kommersiellt tillgängligt BSA-kit. Pipettera 50 | il av utspädda proteinprover (1: 100, 1: 200, 1: 500) och BSA-standard (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml -1) i en platta med 96 brunnar . Tillsätt 200 pl Bradford reagens, mät absorbansen vid 595 nm efter 15 minuter med en fluorimeter och beräkna koncentrationerna med hjälp av standardkurvan. </li></ol></li></ol> 2. Ljuskatalyserade Biotransformation <ol><li> Biokatalytiska reaktioner utan väteperoxid tillsats<ol><li> Bered en 10 ml stamlösning av 10 mM stearinsyra (M r 284,5 g mol -1) genom tillsats av 10% (vol / vol) Tergitol och 0,0284 g stearinsyra till destillerat vatten. Värm lösningen i ett värmeskåp till 60 ° C till dess fettsyra är helt upplöst. </li><li> Biokatalys och provtagning <ol><li> Förbered två 2 ml reaktionsblandningar innehållande 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM stearinsyra i Tris-HCl-buffert. Lägga till en magnetisk omrörarstav för tillräcklig syretillförsel och placera glasrören i ett vattenbad, upphettades till 25 ° C. </li><li> Tillsätt 200 | j, g ml -1 av renat enzym eller 10% (vol / vol) cellfritt extrakt till var och en av reaktionsblandningarna och belysa dem med ett klart glas glödlampa (120 W) i 15 cm avstånd av reaktionsrören. </li><li> Ta 200 mikroliter prover vid specifika tidpunkter (0, 10, 30, 60 och 120 min och över natten) stoppa reaktionen med 20 pl 37% HCI. Tillsätt 5 l myristinsyra (10 mM lager sålution) som intern standard. </li></ol></li></ol></li><li> Analys av reaktionsprodukter <ol><li> För extraktion Tillsätt 500 l etylacetat till proverna två gånger, invertera rören och centrifugera i 1 minut vid 13.000 x g. </li><li> Ta bort 400 pl av supernatanten och låt lösningsmedlet fullständigt avdunsta. </li><li> Derivatisera karboxylsyrorna i trimethylsilylcarboxylic syra genom att tillsätta 200 pl N-metyl-N - (trimetylsilyl) trifluoro acetamid (MSTFA). Inkubera lösningen vid 60 ° C under 30 min för att omvandla hydroxylgrupper till trimetylsilyletrar. </li><li> Bestämning av omvandlingen av GC / FID OBS: Bestäm bildningen av en-heptadecen (RT: 8,34 min), α- och β-hydroxistearinsyra (RT: 12,05 och 12,1 min) och minskning av substratet (RT: 11,15 min) med användning GC / FID. <ol><li> Ställa in temperaturprofilen beskrivs nedan Set injektionstemperaturen till 340 ° C. Hållden initiala ugnstemperaturen är vid 90 ° C under 3,5 min och ökar därefter med 45 ° C min -1. Vid 220 ° C, håll temperaturen under 2 min. Efter en upprepad ökning med 45 ° C min -1, håll temperaturen vid 280 ° C under 2 min och sedan öka med 60 ° C min -1. OBS: Högsta temperatur på 330 ° C hålls under 1,44 minuter. </li><li> Injicera 4 pl av provet med en delad förhållande av 5 att få en snabb förångning och homogen blandning med bärargasen helium. OBSERVERA: I beroende på ökande temperatur substratet och produkterna kommer in i gasfasen. Substanserna detekteras av GC / FID-detektor efter att ha passerat kolonnen vid specifika retentionstider och visas som topparna på skärmen. Observera toppbildning på monitorn. </li><li> Beräkna koncentrationen av bildad produkt med följande formel: <img alt="ekvation 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; OBS: Kalibreringsfaktorn har bestämts specifikt för denna kolumn för varje substrat och produkt genom att beräkna standardkurvan från kända mängder av derivatiserade ämnena och deras motsvarande topparea. </li></ol></li><li> Identifiera olefin och p-hydroxi-syra toppar med GC / MS. <ol><li> Identifiera olefin och p-hydroxi-syra toppar med GC / MS. Ställ in temperaturprofilen. Ställa in injektionstemperatur till 250 ° C. Hålla ugnstemperaturen vid 100 ° C under 5 min och därefter öka med 20 ° C min -1. OBS: Högsta temperatur hålls under 7,5 minuter. </li><li> Ställa masspektrometern detektortemperatur till 250 ° C och scanna vid 50 till 500 m / z i elektronstöt läge. OBS: Elektron stötjonisering avlägsnar en enda elektron som resulterar i bildningen av en radikal katjon, som kommer att föras vidare framåt för massanalys. På grund av de höga intramolar energi kovalenta bindningar inommolekyl paus skapar fragment med lägre m / z. Dessa fragment bildar ett fingeravtryck som är specifik för ett ämne. </li><li> Injicera 1 pl av provet. Detect 1-heptadecen efter 11,4 min retentionstid med motsvarande fingeravtryck (Figur 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kourist, R., Dom&#236;nguez de Mar&#236;a, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments.">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li><li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taming+of+oxygen:+biocatalytic+oxyfunctionalisations.">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li><li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions.">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li><li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis:+Nonconventional+Regeneration+Methods.">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li><li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases.">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li><li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts.">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).</li><li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+olefin+(1-alkene)+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species.">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li><li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis.">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-independent+production+of+&#945;-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase.">Hydrogen peroxide-independent production of &#945;-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).</li><li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions.">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ljusdriven generation av väteperoxid kan användas för en rad redox transformationer, inklusive peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 och P450 monooxygenases 5. Det är ett enkelt och praktiskt tillvägagångssätt. På lång sikt, användning av synligt ljus öppnar perspektivet att utnyttja solljus under kemiska transformationer, som är ett hållbart alternativ för energirika reaktioner. Metoden kan användas med renat enzym eller med cellfritt extrakt. Medan den senare kräver mindre kostnader och arbete, bör det noteras att små molekyler i råextraktet kan störa ljuset katalyserade omvandlingen. En praktiskt tillvägagångssätt är att ta bort dessa små komponenter med en mikromembran (dvs genom centrifugering i en centrifugal filterenhet eller genom dialys). Koncentrationen av det ljus-skörd molekyl FMN bestämmer koncentrationen av väteperoxiden. Beroende på Affinity av oxidoreduktas, är denna koncentration avgörande för den enzymatiska aktiviteten. En annan viktig faktor är koncentrationen av offerelektrondonator EDTA. Den viktigaste parametern är emellertid den operativa stabiliteten och aktiviteten av enzymet. Den olefinization av fettsyror är en elegant reaktion för omvandling av biobaserade fettsyror i olefiner som hör till de stora råvaror för kemisk industri. Ljusdriven biokatalytisk dekarboxylering kan utföras vid rumstemperatur och vid neutralt pH, vilket ger tydliga fördelar när det gäller hållbarhet. Våra resultat visar att in situ-alstring av väteperoxid är en strategi för att tillföra kofaktorn utan att försämra enzymstabilitet, vilket leder till en hög omvandling. Nuvarande metoder för kofaktor regenerering använda jordbruksprodukter eller bensinbaserade kemikalier. Ljusdriven reaktioner framstår som förnybart alternativ. Framtidaforskning kommer att ägnas åt metoder för substitution av offerreagens EDTA av billigare molekyler och för att minska mängden av ljus skörd molekyl FMN.

Klimatförändringen och överskådlig utarmning av förnybara resurser utgör ett allvarligt hot mot vårt samhälle. I detta sammanhang representerar enzymkatalys en ännu inte utnyttjas fullt ut potential för utveckling av hållbar och &quot;grönare&quot; kemi 1. Oxidoreduktaser har förmågan att katalysera införande och ändring av funktionella grupper under milda reaktionsbetingelser och tillhör de viktigaste biokatalysatorer 2. Flesta redox transformationer kräver tillförseln av externt av kofaktorer såsom NAD (P) H. Metoder för kofaktor regenerering har använts i industriell skala. Men de fortfarande resultera i höga processkostnader, vilket begränsar deras tillämpning främst till högvärdiga produkter. Intressant nog flera peroxidaser 3,4 och P450 monooxygenases 5 acceptera elektroner från väteperoxid via den så kallade peroxid shunten. Medan H2O 2 är en billig samreagens, är det enligt uppgift harmful för många enzymer. En stadig in situ-bildning av låga koncentrationer av väteperoxid är en framkomlig väg för att driva reaktionen utan att försämra den operativa stabiliteten hos enzymet. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Figur 1. Experimentell uppställning av photobiocatalytic dekarboxylering av fettsyror genom olet JE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Användningen av ljus som energikälla för kemiska och biologiska processer har fått ökad uppmärksamhet under de senaste åren 6. Ljusdriven generation av väteperoxid har visat sig vara en enkel och robust metod för att tillföra väteperoxid för redox transformationer (Figur 1). En fotokatalysator såsom flavin-adenin-månonucleotide (FMN) möjliggör reduktion av molekylärt syre till väteperoxid, som sedan används som kofaktor för den enzymatiska oxyfunctionalization reaktionen. Möjliga elektrondonatorer är etylendiamintetraättiksyra (EDTA), askorbat eller den billiga formiat. Metoden är allmänt tillämpbar för H2O 2 -beroende enzymer, inklusive peroxidaser 3,4 och P450 monooxygenases 5. Vi har nyligen undersökt tillämpningen av en ny bakterie dekarboxylas 7 för omvandling av naturliga fetter i olefiner 8. Detta skulle vara en hållbar väg för syntes av vanligt förekommande plattformskemikalier från en biobaserad källa. Dekarboxylas olet JE från den grampositiva bakterien Jeotgalicoccus sp. katalyserar den oxidativa dekarboxyleringen av fettsyror och bildar 1-alkener som produkter. Olet JE är nära besläktad med bakteriella P450 monooxygenases och behöver elektroner from väteperoxid för reaktionen. Tyvärr, tillsats av H2O 2 till en lösning av substrat och enzym resulterade i låga omvandlingar och en dålig reproducerbarhet av resultaten, förmodligen på grund av en skadlig effekt av väteperoxid på stabiliteten hos olet JE. Generering av ett fusionsprotein med NADPH-reduktas RhFred gjort en NADPH-beroende dekarboxylering möjlig. 9 Trots det höga priset på NADPH och den nuvarande begränsade möjligheter till en kostnadseffektiv regenerering fick oss att undersöka billigare elektrondonatorer. Inspirerad av likheten mellan olet JE med P450 monooxygenases använde vi den ljuskatalyserade generation H2O 2. Vi var glada att få höga omvandlingar (upp till&gt; 95%) med hjälp av cellfria extrakt eller renade enzymlösningar. Med exempel på fettsyra dekarboxylering, presenterar vi en allmän protokoll för ljusdrivna enzymATIC redox transformationer använder FMN som fotokatalysator och väteperoxid som kofaktor. De presenterade metoder innefattar produktionen av enzymet i rekombinant cell av E. coli, rening av enzymet, ansökan för syntes av 1-alkener och analys av reaktionsprodukterna.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Chemicals</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bradford reagent</td>
			<td style="width:131px;">Roth</td>
			<td style="width:173px;">K015.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">BSA</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>90604-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:195px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:173px;">141-78-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:131px;">Roth</td>
			<td style="width:173px;">8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;width:195px;">Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">130-40-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochlorid acid 37%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">7722-84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">&#948;-Amino levulinic acid</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>5451-09-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:61px;width:195px;">N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">24589-78-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Myristic acid &#62;99%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">208-875-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">288-32-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:173px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Stearic acid &#62;99%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">57-11-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">60-54-8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tergitol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">MFCD01779855&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Device</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:195px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:131px;">G-25CK</td>
			<td style="width:173px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">Ecotron</td>
			<td style="width:173px;">Infors HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centrifugation</td>
			<td style="width:131px;">Labofuge 400R</td>
			<td style="width:173px;">Heraeus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">RC 5B Plus</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">Fresco 17</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centrifugation rotors</td>
			<td style="width:131px;">SS34</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">SLA</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Clean bench</td>
			<td style="width:131px;">Envirco</td>
			<td style="width:173px;">Ceag Schirp Reinraum technik</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Column GC-FID&#160;</td>
			<td style="width:131px;">CP-Sil 5CB (30 m x 0.25 mmx 0.25 &#181;m)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Column GC-MS</td>
			<td style="width:131px;">FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Varian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GC-FID</td>
			<td style="width:131px;">GC-2010 plus</td>
			<td style="width:173px;">Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GC-MS</td>
			<td style="width:131px;">IST-40</td>
			<td style="width:173px;">Varian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:131px;">RCT classic</td>
			<td style="width:173px;">IKA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:131px;">SevenEasy</td>
			<td style="width:173px;">Mettler toledo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sonicator</td>
			<td style="width:131px;">Branson Sonifier 250</td>
			<td style="width:173px;">Branson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Spectral photometer</td>
			<td style="width:131px;">FLUOstar Omega</td>
			<td style="width:173px;">BMG Labtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Equipment</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Affinity chromatography column</td>
			<td style="width:131px;">His Pur Ni-NTA spin column</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centricon</td>
			<td style="width:131px;">Vivaspin turbo 15</td>
			<td style="width:173px;">VWR International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Microtiter plates</td>
			<td style="width:131px;">96 Well Multiply&#174;PCR Plates</td>
			<td style="width:173px;">Sarstedt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-driven enzymatic decarboxylation

Oxidoreduktaser tillhör de mest tillämpade industriella enzymer. Ändå måste de externa elektroner vars försörjning är ofta kostsamt och utmanande. Återvinning av den elektrondonatorer NADH eller NADPH kräver användning av ytterligare enzymer och offersubstrat. Intressant, flera oxidoreduktaser accepterar väteperoxid som elektrondonator. Samtidigt som den är billig, reducerar denna reagens ofta stabiliteten hos enzymer. En lösning på detta problem är in situ-genereringen av kofaktorn. Den kontinuerliga tillförseln av kofaktorn vid låg koncentration driver reaktionen utan att försämra enzymstabilitet. Detta papper demonstrerar en metod för den ljuskatalyse alstring in situ av väteperoxid med exemplet av heme-beroende fettsyra dekarboxylas olet JE. Fettsyra dekarboxylas olet JE upptäcktes på grund av sin unika förmåga att producera långkedjiga 1-alkener från fettsyror, en hittills okänd enzymatiskreaktion. 1-alkener används allmänt tillsatser för mjukningsmedel och smörjmedel. Olet JE har visat att acceptera elektroner från väteperoxid för oxidativ dekarboxylering. Medan tillsats av väteperoxid skadar enzymet och resulterar i låga utbyten, alstring in situ av kofaktorn kringgår detta problem. Den photobiocatalytic systemet visar tydliga fördelar vad gäller enzymaktivitet och utbyte, vilket resulterar i ett enkelt och effektivt system för fettsyra dekarboxylering.

Medan tillsatsen av väteperoxid till reaktionsblandningen resulterade i låg till måttlig omvandlingar (&lt;10%), in situ-alstring av väteperoxid ökade omvandlingen upp till 80% omvandling. Analys med GC / MS visar bildningen av olefiner från fettsyror (figur 2). <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> Figur 2. (A) Temperaturprofil för GC / MS-mätningar. (B) Fingerprint av 1-heptadecen eluerande efter 11,4 minuter. (C) Karaktäristiska sekundära CnH2n-en fragmentjoner av terminal olefiner exemplariskt visas för en-heptadecen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> E. coli. En renad enzymlösning visade ett klart samband mellan enzymkoncentration och omvandling. Ökning av koncentrationen av det ljus-skörd molekyl FMN leder till högre omvandlingar. Men att öka den koncentration över 10 mM inte ytterligare påskynda reaktionerna, vilket indikerar att mängden väteperoxid som är tillräckligt tillgängliga och inte längre den begränsande faktorn. Utöver den dekarboxylering av fettsyror, olet JE katalyserar också en hydroxylering i β-position. I omvandlingen av stearinsyra, är dekarboxylering ungefär tre gånger snabbare än hydroxylering. I ett typiskt experiment med användning av en lösning av 0,5 mM stearinsyra och 10 pM FMN, var 99% av substratet omvandlas till en blandning av 1-heptadeken och 2-hydroxistearinsyra med ett förhållande av3,3: 1 (Figur 3) 8. En undersökning av substratet spektrumet för den ljusdrivna biokatalys visade att för fettsyror med längre acylkedjor, olet JE katalyserar preferentiellt dekarboxylering, medan den relativa mängden av hydroxyl-fettsyror i produktblandningen ökade med kortare kedjelängd. Fettsyror kortare än myristinsyra (C14) inte genomgår dekarboxylering. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Figur 3. Gaskromatografisk analys av olet JE -medierad dekarboxylering av stearinsyra (11,15 min) till en-heptadecen (8,4 min), α-hydroxistearinsyra (12,04 min) β-hydroxistearinsyra (12,1 min). Förändringen av toppareor från prover tagna under en tidsförlopp av 2 timmar visas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att tävla</a>wa större version av denna siffra. Överraskande, den omättade syror oleinsyra (C18: 1d9 cis) och linolsyra (C18: 2d9d12) inte accepteras som substrat, vilket indikerar att den vridna konfiguration av cis-dubbelbindningar inte kan inrymmas i en produktiv bindningssätt i enzymet. Tillsats av oljesyra (10%) förhindrade också omvandlingen av stearinsyra. Intressant, stearinsyra: var (C18 1d9 trans) omvandlas av olet JE, men med något lägre aktivitet då stearinsyra.

Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Vi beskriver ett protokoll för ljuskatalyserade generation av väteperoxid - en kofaktor för oxidativa omvandlingar.

Ljusdriven Enzymatisk Dekarboxylering

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Carboxylic Acids

SCIENTISTS IN ACTION

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Hot biologisk katalys: Isotermiska Titrering Calorimetry för att karaktärisera enzymatiska reaktioner

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Upplösning Dynamic Nuclear Polarisering Instrument för Realtids enzymatisk reaktion Rate Mätningar av NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Kemo-enzymatisk syntes av N- glycans för Array utveckling och HIV-antikroppar profilering

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Enzymatisk Cascade reaktioner för syntesen av kirala Amino alkoholer från L-lysin

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Ljus-driven molekylära motorer på ytor för enstaka molekylär avbildning

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Enzymatisk syntes av Epoxidiserade metaboliter av Dokosahexaenoic, Eikosapentaenoic och Arakidonsyror

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Decoding Transient Absorption - Processing, Fitting, and Interpreting Data

An Introduction to Processing, Fitting, and Interpreting Transient Absorption Data

Author Spotlight: Exploring Light-Driven Chemical Reactions and Energy-Harnessing Devices in Photochemical Research

Transient absorption (TA) spectroscopy is a powerful time-resolved spectroscopic method used to track the evolution of excited-state processes through ...