Name: light-driven enzymatic decarboxylation
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

Dikkat: Kullanmadan önce tüm ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. ve bu sentezlerde kullanılan kimyasalların çeşitli akut olarak toksik ve kanserojen. zararlı organik çözücüler, özellikle reaksiyon ürünlerinin çıkarma ve yağ asitlerinin türetme içeren tüm basamaklar kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon, kapalı-toe ayakkabıları kullanarak davlumbaz altında yapılmalıdır ). Bu çalışmada genetiği değiştirilmiş organizmalar içeren tüm işlemler emniyet seviyesi S1 genetiği değiştirilmiş organizmaların işlenmesi için onaylanan tesisler gerektirir. E. Rekombinant Dekarboksilaz olet JE 1. Ekspresyon E. coli <ol><li> Üretim suşunun hazırlanması <ol><li> Jeotgalicoccus gelen Olet JE bir sentetik gen hazırlamak ve sentezleme vektörü pASK-IBA37plus tarif edildiği gibi klonlanmıştır. 8 </sup&gt; NOT: bakteriyel metabolizma, E. enzimlerle yağlı asitlerin bozulmasını önlemek için, yağ asidi bozulması için işlevsiz yolun ile Keio koleksiyonundan coli suşu JW5020 kullanıldı. </li></ol></li><li> Yetiştirme ve enzim ekspresyonunun indüklenmesi <ol><li> E. aşılayarak bir ön kültür hazırlayın Test tüpleri iki 3 mi LB-ortamı içinde (100 ug ml -1 ampisilin ihtiva eden) LB-plaka coli JW5020 olet mutantı. Seçim aracı madde içine bir stok çözeltiden Pipet ampisilin (100 ug ml-1) ve 180 rpm&#39;de bir çalkalama inkübatöründe 15 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1 L&#39;lik çalkalama şişelerinde, iki adet 200 ml&#39;lik LB-ortamı içeren, ampisilin (100 | ig mi-1) ön kültürler 2 ml ilave edilir. Kuluçka 37 ° C&#39;de ve 180 rpm&#39;de devam eder. </li><li> OD 600Nm değişikliği Monitör aşılamadan sonra. OD 600 0.6 Bir arasında bir değere ulaştığındad 0.8 (0.2 ug ml -1) tetrasiklin ekleyerek ifadesini teşvik eder. 20 ° C&#39;de 15 saat ve 180 rpm&#39;de kültürlerin inkübe edin. Not: Olet JE bir hem kofaktör içerdiği, δ-amino levülinik asit (0.5 mM) uyarmadan önce eklenmesi kofaktör sentezi için bir prekürsör ile kültür sağlamak için gereklidir. </li></ol></li><li> Hücre liziz <ol><li> buz üzerinde aşağıdaki adımları uygulayın. santrifüj tüplerine içine şişeden veya pipetleme kültürleri aktarın ve eşit dağılımını sağlamak için bir ölçek kullanın. 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de 20 dakika boyunca kültürler santrifüj. </li><li> Dikkatle süpernatan atılır ve pipetleme 50 ml kadar tampon (50 mM Tris, 200 mM NaCI, pH 7.5) içinde tekrar süspansiyon pelet ve bir konik santrifüj tüpüne süspansiyon aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 4,000 x g&#39;de 15 dakika santrifüje tabi tutulduktan sonra, süpernatant atın pipetleme 3 mi tampon maddesi içinde, her pelletini. </li><li> böylece hücre lizis gerçekleştirinçevrimleri arasında 1 dakika bekleme süresi ayrılan buz üzerinde çözümler (x 30 saniye üç döngü) kurmanın. Santrifüj, 4 ° C&#39;de 15,000 x g&#39;de 20 dakika boyunca çözeltiler hücre debrisini uzaklaştırmak ve pipetleme pelet bozmadan konik santrifüj tüpü içine süpernatant aktarmak için kullanılır. pelet atın. Not: küçük moleküller çıkarıldıktan sonra bir çözücü madde fraksiyon biyokataliz için doğrudan kullanılır. İkinci fraksiyon His ile etiketlenmiş olet JE saflaştırılması için kullanılacaktır. </li></ol></li><li> Hücre ekstrelerinin küçük moleküllerin uzaklaştırılması <ol><li> biyokataliz ham ekstre, 4 ° C&#39;de 4,000 x g&#39;de 10 kDa&#39;lık bir membran ve santrifüj ile santrifüj filtre ünitesine hücresi serbest özütü 3 ml pipetleme hidrojen peroksit oluşumu ya da elektron transfer etkileşebilir küçük molekülleri kaldırma kullanmadan önce. 3 ml Tris-HCl-tamponu içinde geri kalan protein süspanse edin. </li></ol></li><li> Olet saflaştırılması </strong&gt; <ol><li> dengeleme tamponu (Tris, 20 mM NaCl, 300 mM imidazol, 10 mM) ile daha önce dengelenmiş olan His Pur Ni-NTA döner gruplarından ikinci hücre ekstresi 3 ml uygulanır. </li><li> alt fişler ve üst vida kapaklarla sütunlar Seal ve reçine hücre içermeyen ekstresi ile eşit olarak dağıtılır kadar hafifçe sallayın. 4 ° C de bir üst çalkalayıcıda 30 dakika için yerleştirilmiştir sütun inkübe edin. </li><li> 2 dakika boyunca 700 x g&#39;de santrifüj yıkama tamponu 1 ml (Tris, 20 mM NaCl, 300 mM imidazol, 20 mM, pH 7.4) ile sütun yıkayın. İki kez bu adımı yineleyin. </li><li> Taze konik santrifüj tüpü içine sütun yerleştirin ve elüsyon tamponu 1 ml (Tris, 20 mM NaCl, 300 mM imidazol, 250 mM, pH 7.4) olet JE ekleyin. 2 dakika süreyle 700 xg&#39;de Santrifüj ve bu adımı iki kez tekrarlayın. NOT: imidazol nikel bağlanır ve böylece sütundan olet JE kaldıracaktır. </li><li> Bir santrifüj filtre ünitesine elüsyon aktarın (10 kDa memmembran) ve 4 ° C&#39;de 4000 x g&#39;de santrifüj tuzdan arındırılır. </li><li> Bir SDS-PAGE (% 15). 9 karışımı SDS-tamponu (nihai konsantrasyon 1 x) ile elüsyon için 3 ul enzimin saflığı kontrol ve denatürasyon için 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;da, çözelti inkübe edin. Daha sonra bir SDS-Page toplam miktarda uygulayın. ticari bir protein standardı kullanılarak 35 mA jel çalıştırın. 50 kDa protein algılar. </li><li> Protein konsantrasyonu ticari mevcut BSA-kit kullanmak belirlemek. Pipet seyreltildi protein örneklerinin 50 ul (1: 100, 1: 200, 1: 500) ve BSA standardına (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg mi-1), 96 oyuklu bir plaka içerisinde . Bradford reaktifi 200 ul ekleyin bir florimetrede ile 15 dakika sonra 595 nm&#39;de absorbansı ölçmek ve standart eğri kullanılarak konsantrasyonları hesaplayın. </li></ol></li></ol> 2. Işık katalize Biyotransformasyon <ol><li> Hidrojen peroksit ilave edilmeden Biyokatalitik reaksiyonlar<ol><li> Damıtılmış su% 10 (h / h) Tergitol ve 0,0284 g stearik asit eklenerek 10 mM stearik asit (M R 284.5 g mol-1) &#39;in bir 10 ml stok çözelti hazırlayın. yağlı asit tamamen eriyene kadar 60 ° C&#39;ye kadar bir ısıtma odası içinde çözelti ısıtılır. </li><li> Biyokataliz ve örnekleme <ol><li> 50 mM EDTA, 0.01 mM FMN, Tris-HCI tampon içinde 0.5 mM stearik asit ihtiva eden iki adet 2 ml reaksiyon karışımları hazırlayın. oksijen beslemesi için bir manyetik karıştırma çubuğu ilave edin ve 25 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı, bir su banyosu içinde, cam tüpler, yerleştirin. </li><li> Reaksiyon karışımlarının her birine saflaştınlmış enzim, 200 ug ml-1 veya% 10 (h / h) hücresi serbest özütü ilave edin ve reaksiyonu tüpler 15 cm uzakta bir açık cam ampul (120 W) ile aydınlatır. </li><li> 20 ul% 37 HCI ile reaksiyon durdurularak belirli zaman noktalarında (0, 10, 30, 60 ve 120 dakika ve gece boyunca) 200 ul numune alın. 5 ul miristik asit ekleyin (10 mM stok yaniİç standart olarak dökülmesinden). </li></ol></li></ol></li><li> Reaksiyon ürünlerinin analizi <ol><li> Çıkarma için, iki numune, 500 ul etil asetat ilave 13,000 x g&#39;de 1 dakika için tüpler ve santrifüj ters. </li><li> süpernatant 400 ul çıkarın ve solvent tamamen buharlaşması izin verin. </li><li> (Trimetilsilil) trifloro asetamid (MSTFA) - 200 ul K-metil-N eklenerek trimethylsilylcarboxylic asit içine karboksilik asitler türetmek. eterler, trimetilsilile hidroksil grupları dönüştürmek için 30 dakika boyunca 60 ° C&#39;da, çözelti inkübe edin. </li><li> GC / FID ile dönüşüm tayini NOT: / FID GC: substrat: (12.05 ve 12.1 dk RT) ve azalma, α- ve β-hidroksi stearik asit (11.15 dk RT): 1-heptadekenin (8.34 dk RT) oluşumunu belirler. <ol><li> 340 ° C&#39;ye kadar Set altında enjeksiyon sıcaklığı açıklanan sıcaklık profilini ayarlayın. AmbarBaşlangıç ​​fırın sıcaklığı 3.5 dakika boyunca 90 ° C&#39;de ve daha sonra 45 ° C dk-1 ile birlikte artar. 220 ° C &#39;de, 2 dakika süreyle sıcaklık tutun. 45 ° C min -1 bir tekrarlanan artıştan sonra, 2 dakika süreyle 280 ° C sıcaklık tutun ve sonra min -1 60 ° C artar. NOT: 330 ° C maksimum sıcaklık 1.44 dakika tutulur. </li><li> Taşıyıcı gaz: Helyum hızlı bir buharlaşmasını ve homojen bir karışım elde etmek için bir 5 bölme oranı ile, örnek 4 ul enjekte edilir. NOT: artan sıcaklığa bağımlılığı ise substrat ve ürünler gaz aşamasına girecektir. maddeler belirli bir bekleme süreleri de sütun geçtikten sonra GC / FID detektörü ile tespit edilir ve ekranda tepe değerleri halinde gösterildi. monitörde zirve oluşumunu gözlemlemek. </li><li> aşağıdaki formül ile oluşan ürün konsantrasyonu hesaplanır: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; Not: kalibrasyon faktörü türetilmiş maddeler ve bunlara karşılık gelen pik alanı, bilinen miktarlarda standart eğri hesaplama her bir alt-tabaka ve ürün bu sütun için özel olarak tespit edilmiştir. </li></ol></li><li> GC / MS ile olefin ve β-hidroksi asit doruklarına belirleyin. <ol><li> GC / MS ile olefin ve β-hidroksi asit doruklarına belirleyin. sıcaklık profilini ayarlayın. 250 ° C&#39;ye enjeksiyon sıcaklığını ayarlamak. 5 dakika boyunca 100 ° C de fırın sıcaklığı tutun ve daha sonra, 20 ° C dk-1 ile birlikte artar. NOT: Maksimum sıcaklık 7.5 dakika tutulur. </li><li> 250 ° C&#39;ye kadar kütle spektrometresi dedektör sıcaklığını ayarlamak ve elektron darbe modunda 50 500 m / z tarama. Not: Elektron darbeli iyonizasyon kütle analizi ileri geçilecek bir kök katyonu oluşumu ile sonuçlanan tek bir elektron kaldırır. Nedeniyle içindeki yüksek intramolar enerji kovalent bağ ileAlt m / z fragmanları oluşturarak molekül mola. Bu fragmanlar, bir madde için belirli bir parmak izi oluşturmaktadır. </li><li> örnek 1 ul enjekte edilir. Karşılık gelen parmak izi (Şekil 2) ile 11.4 dakika tutma süresinden sonra 1-heptadekenin algılar. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kourist, R., Dom&#236;nguez de Mar&#236;a, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments.">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li><li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taming+of+oxygen:+biocatalytic+oxyfunctionalisations.">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li><li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions.">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li><li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis:+Nonconventional+Regeneration+Methods.">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li><li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases.">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li><li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts.">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).</li><li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+olefin+(1-alkene)+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species.">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li><li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis.">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-independent+production+of+&#945;-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase.">Hydrogen peroxide-independent production of &#945;-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).</li><li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions.">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hidrojen peroksit ışık güdümlü nesil peroxygenases 3 de dahil olmak üzere, bir dizi redoks dönüşümleri için uygulanan 10 kloroperoksidazlar ve P450 5 monooksijenazlar edilebilir. Bu kolay ve uygulanabilir bir yaklaşımdır. Uzun vadede, görünür ışığın kullanımı, enerji zengini reaksiyonlar için sürdürülebilir bir alternatif kimyasal dönüşümler için güneş ışığına, kullanmaya perspektif açıyor. saflaştınlmış enzim veya hücre içermeyen özü ile uygulanabilir. ikincisi daha az maliyet ve çalışma gerektirir ise, ham ekstredeki küçük moleküller hafif katalize dönüşüm müdahale edebilir unutulmamalıdır. Bir pratik bir yaklaşım (a santrifüj filtre ünitesinde veya diyaliz santrifüj ile, örneğin) bir mikromembran bu küçük parçaların kaldırmaktır. ışık hasat molekülü FMN konsantrasyonu hidrojen peroksit konsantrasyonu belirlenir. affini bağlı olarakoksidoredüktazın Ty, bu konsantrasyon, enzimatik aktivitesi için belirleyicidir. Bir diğer önemli faktör gözden çıkarılabilir elektron verici EDTA konsantrasyonudur. En önemli parametre, Bununla birlikte, enzimin işlevsel stabilitesi ve aktivitedir. yağlı asitlerin olefinization kimya endüstrisi için önemli bir mal ait olefinler halinde biyo bazlı yağ asitlerinin dönüştürülmesi için zarif bir reaksiyondur. Işık odaklı biyokatalitik dekarboksilasyon, oda sıcaklığında ve sürdürülebilirlik açısından net avantajlar sunmaktadır, nötr pH değerinde gerçekleştirilebilir. Sonuçlarımız, hidrojen peroksit in situ üretimi yüksek bir dönüşüme yol enzim kararlılığını bozmadan kofaktör temini için bir strateji olduğunu göstermektedir. kofaktör rejenerasyonu için mevcut yöntemler tarım ürünleri veya benzin bazlı kimyasal maddeler kullanmayın. Işık odaklı reaksiyonlar yenilenebilir alternatif olarak ortaya çıkmaktadır. gelecekAraştırma ucuz moleküller tarafından kurban reaktif EDTA ikamesi için yöntemler adanmış olacaktır ve hafif hasat molekülü FMN miktarını azaltmak için.

iklim değişikliği ve yenilenebilir kaynakların öngörülebilir tükenmesi bizim toplum için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Bu bağlamda, enzim kataliz sürdürülebilir gelişimi ve &#39;yeşil&#39; kimya 1 için hala tam olarak istismar değil potansiyelini temsil eder. Oksiredüktazlar, hafif tepkiler koşullar altında bir giriş ve fonksiyonel grupların modifikasyonu katalize ve en önemli biyokatalizör 2&#39;ye ait kapasitesine sahiptir. Çoğu redoks dönüşümler gibi NAD (P) H olarak kofaktör dış temini gerektirir. kofaktör rejenerasyonu için yöntemler endüstriyel ölçekte uygulanmıştır. Ancak, yine de değeri yüksek ürünlere çoğunlukla uygulama sınırlar yüksek işlem maliyetleri, yol açar. İlginçtir ki, birkaç peroksidazlar 3,4 ve P450 monooksijenazlar 5 sözde peroksit şant yoluyla hidrojen peroksit elektron kabul eder. H2O 2 ucuz bir ko-reajan iken, bildirildi harmf olduğubirçok enzim için ul. In situ formasyonu istikrarlı hidrojen peroksit, düşük konsantrasyonlarda, enzimin işlevsel stabilitesini bozmadan reaksiyonu için uygun bir yaklaşımdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Şekil Olet JE tarafından yağ asitlerinin photobiocatalytic dekarboksilasyonundan 1. Deneysel kurulum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Kimyasal ve biyolojik süreçler için enerji kaynağı olarak ışık kullanımı son yıllarda 6 artan ilgi görüyordu. Hidrojen peroksit Işık tahrik üretimi redoks dönüşümleri (Şekil 1) hidrojen peroksit kaynağı için kolay ve sağlam bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu adenin mon flavin edilen bir fotokatalizöronucleotide (FMN), sonra enzimatik reaksiyon için oxyfunctionalization kofaktör olarak kullanılan hidrojen peroksit, moleküler oksijenin azaltılması sağlar. Olası elektron vericiler etilendiamintetraasetik asit (EDTA), askorbat ya da ucuz formiat bulunmaktadır. Yöntem peroksidazlar 3,4 ve P450 monooksijenazların 5 olmak üzere 2 O 2 bağımlı enzimler, H genellikle uygulanabilir. Son zamanlarda, olefinlerin 8&#39;e doğal yağların dönüşümü için yeni bir bakteriyel dekarboksilaz 7 uygulanmasını araştırdık. Bu biyo-tabanlı bir kaynaktan gelen yaygın olarak kullanılan bir platform kimyasal sentezi için sürdürülebilir yolu olacaktır. Gram pozitif bir bakteridir Jeotgalicoccus sp dekarboksilaz olet JE. yağ asitlerinin oksidatif dekarboksilasyonunu katalize ve ürün 1-alkenler oluşturur. Olet JE yakından bakteriyel P450 monoksigenazlara ilgili ve f elektronları ihtiyacı varReaksiyon için ROM hidrojen peroksittir. Ne yazık ki, alt tabaka ve enzimin bir çözeltisine, H2O 2 eklenmesi aktivasyonu nedeniyle olet JE stabilitesi üzerinde bir hidrojen peroksit, zararlı etkisi, düşük dönüşüm ve sonuçları bir zayıf bir yeniden üretilebilirlik ile sonuçlanmıştır. NADPH-redüktaz RhFred ile bir füzyon proteini üretilmesi NADPH yüksek fiyat ve düşük maliyetli bir rejenerasyonu için geçerli sınırlı olanakları daha ucuz elektron vericilerini bize araştırmak için istenir, Yine bir NADPH-bağımlı dekarboksilasyonu mümkün. 9 yaptı. P450 monooksijenazların ile olet JE benzerliği esinlenerek, biz H 2 O 2 ışık-katalize nesil kullanılır. Biz hücre içermeyen özleri veya saflaştırılmış enzim çözümlerini kullanarak (&gt;% 95 kadar) yüksek dönüşüm elde etmek için memnun. yağ asidi dekarboksilasyon örnek ile, ışık odaklı enzim için genel bir protokol mevcutkofaktör olarak fotokatalizör ve hidrojen peroksit gibi FMN kullanılarak problemlerle redoks dönüşümler. Sunulan yöntemler E. rekombinant hücrede enzim üretimini içerir E. coli, enzimin saflaştırılması, 1-alkenler sentezi ve reaksiyon ürünlerinin analizi için uygulanması.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Chemicals</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bradford reagent</td>
			<td style="width:131px;">Roth</td>
			<td style="width:173px;">K015.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">BSA</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>90604-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:195px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:173px;">141-78-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:131px;">Roth</td>
			<td style="width:173px;">8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;width:195px;">Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">130-40-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochlorid acid 37%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">7722-84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">&#948;-Amino levulinic acid</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>5451-09-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:61px;width:195px;">N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">24589-78-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Myristic acid &#62;99%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">208-875-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">288-32-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:173px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Stearic acid &#62;99%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">57-11-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">60-54-8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tergitol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">MFCD01779855&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Device</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:195px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:131px;">G-25CK</td>
			<td style="width:173px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">Ecotron</td>
			<td style="width:173px;">Infors HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centrifugation</td>
			<td style="width:131px;">Labofuge 400R</td>
			<td style="width:173px;">Heraeus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">RC 5B Plus</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">Fresco 17</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centrifugation rotors</td>
			<td style="width:131px;">SS34</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">SLA</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Clean bench</td>
			<td style="width:131px;">Envirco</td>
			<td style="width:173px;">Ceag Schirp Reinraum technik</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Column GC-FID&#160;</td>
			<td style="width:131px;">CP-Sil 5CB (30 m x 0.25 mmx 0.25 &#181;m)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Column GC-MS</td>
			<td style="width:131px;">FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Varian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GC-FID</td>
			<td style="width:131px;">GC-2010 plus</td>
			<td style="width:173px;">Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GC-MS</td>
			<td style="width:131px;">IST-40</td>
			<td style="width:173px;">Varian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:131px;">RCT classic</td>
			<td style="width:173px;">IKA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:131px;">SevenEasy</td>
			<td style="width:173px;">Mettler toledo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sonicator</td>
			<td style="width:131px;">Branson Sonifier 250</td>
			<td style="width:173px;">Branson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Spectral photometer</td>
			<td style="width:131px;">FLUOstar Omega</td>
			<td style="width:173px;">BMG Labtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Equipment</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Affinity chromatography column</td>
			<td style="width:131px;">His Pur Ni-NTA spin column</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centricon</td>
			<td style="width:131px;">Vivaspin turbo 15</td>
			<td style="width:173px;">VWR International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Microtiter plates</td>
			<td style="width:131px;">96 Well Multiply&#174;PCR Plates</td>
			<td style="width:173px;">Sarstedt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-driven enzymatic decarboxylation

Oksidoredüktazlar en çok uygulanan sanayi enzimlerin aittir. Yine de, onlar kimin arz genellikle masraflı ve zorlu dış elektronları gerekir. Elektron vericiler NADH veya NADPH geri dönüşümü ilave enzimler ve geçici alt tabakaların kullanımını gerektirir. İlginç bir şekilde, çok sayıda oksidoredüktazlar elektron vericisi olarak hidrojen peroksit kabul eder. ucuz olurken, bu reaktif, genellikle enzim stabilitesini azaltır. Bu soruna bir çözüm kofaktör in situ kuşaktır. Düşük konsantrasyonda kofaktör sürekli besleme enzim kararlılığını bozmadan reaksiyonu tahrik etmektedir. Bu çalışma için bir yöntem gösterir ışık katalize hema &#39;ya bağımlı yağlı asit dekarboksilaz olet JE, örneğin hidrojen peroksit in situ üretimi. Yağlı asit dekarboksilaz olet JE yağlı asitler, şimdiye kadar bilinmeyen bir enzimatik uzun zincirli 1-alkenler üretmek için benzersiz yeteneği nedeniyle keşfedilmiştirReaksiyon. 1-alkenler yaygın yumuşatıcı ve yağlar için katkı kullanılır. Olet JE oksidatif dekarboksilasyon hidrojen peroksit elektronları kabul gösterilmiştir. Hidrojen peroksit zarar kofaktör in situ olarak üretilmeleri, enzim ve düşük verim ile sonuçlanır eklenmesi, bu problemi aşılmaktadır bulunuyor. photobiocatalytic sistemi yağlı asit dekarboksilasyon için basit ve etkili bir sistem ile sonuçlanır enzim aktivitesi ve verimi ile ilgili açık avantajları gösterir.

Reaksiyon karışımına, hidrojen peroksitin ilave dönüşümleri (&lt;% 10) düşük-orta yol açtı, hidrojen peroksit in situ üretimi% 80 dönüşüme kadar dönüşüm yükselmiştir. GC / MS ile analiz yağ asitlerinden olefinler (Şekil 2) göstermektedir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> GC / MS ölçümleri için Şekil 2. (A), sıcaklık profili. 11.4 dakika sonra 1-heptadekeni elüsyon (B) Parmak izi. (C) 1-heptadekenin için gösterilen uç olefinler de örnek karakteristik ikincil CnH2n-1 fragman iyonları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> reaksiyon, E. hücre içermeyen özütler, yüksek dönüşüm elde E. coli. Saflaştırılmış bir enzim çözeltisi enzim konsantrasyonu ve dönüşüm arasında net bir ilişki olduğunu göstermiştir. yüksek dönüşümlere ışık hasat molekülü FMN kurşun konsantrasyonunun artırılması. Ancak, daha fazla hidrojen peroksit miktarı yeterli mevcuttur ve bundan sınırlayıcı bir faktör olduğunu göstermektedir reaksiyonları etmeyi hızlandırmamıştır 10 mM Yukarıdaki konsantrasyonu arttırılmaktadır. Yağlı asitlerin dekarboksilasyonu ek olarak, olet JE da β-konumunda bir hidroksilasyonu katalize eder. stearik asit çevrilmesinde, dekarboksilasyon hidroksilasyon üç kat daha hızlıdır. 0.5 mm&#39;lik bir stearik asit çözeltisi ve 10 uM FMN kullanan tipik bir deneyde, alt-tabakanın% 99 oranında 1-heptadekenin ve 2-hidroksistearik asit karışımına dönüştürüldü3.3: 1 (Şekil 3) 8. Işık tahrik biyokataliz substrat spektrumunun bir araştırma ürün karışımı içindeki hidroksil-yağlı asitlerin nispi miktarı daha kısa zincir uzunluğuna sahip artarken daha asil zincirleri olan yağlı asitler, olet JE, tercihen, dekarboksilasyonu katalize gösterdi. miristik asit (C14) daha kısa yağ asitleri dekarboksilasyonu uygulanmadı. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Olet JE Şekil 3. Gaz kromatografik analizi 1-heptadekenin (8.4 dakika), α-hidroksi stearik asit (12.04 dk) β-hidroksi stearik asit (12.1 dk) içine stearik asit (11.15 dk) dekarboksilasyonunu aracılı. 2 saatlik bir zaman boyunca alınan numunelerden pik alanlarının değişimi gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Vie için tıklayınız</a>Bu rakamın wa daha büyük bir versiyonu. Şaşırtıcı bir şekilde, doymamış asitlerin (C18: 1d9 sis) oleik asit ve linoleik asit (C18: 2d9d12) cis çift bağlarının bükümlü konfigürasyon enzim verimli bir yapışma modu konaklayamayacağını belirten, alt-tabakalar olarak kabul edilmedi. Oleik asit (% 10) eklenmesi, aynı zamanda stearik asit dönüşümü engellemektedir. İlginçtir, stearik asit (C18: 1d9 trans) olet JE tarafından dönüştürülmüş, ancak daha sonra biraz daha düşük aktivite stearik asit ile oldu.

Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

oksidatif dönüşümler için bir kofaktör - Biz hidrojen peroksidin ışık katalize nesil için bir protokol açıklar.

Işık odaklı enzimatik dekarboksilasyonu

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Carboxylic Acids

SCIENTISTS IN ACTION

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Sıcak Biyolojik kataliz: İzotermal Titrasyon Kalorimetre enzimatik reaksiyonların Characterize

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

NMR ile Gerçek zamanlı enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümleri için çözünme Dinamik Nükleer Polarizasyon Aletler

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Enzimatik Cascade reaksiyonlardan L-lizin Amino kiral alkoller sentezi için

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Işık odaklı moleküler motorlar yüzeylerde tek moleküler görüntüleme için

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Dokosahexaenoic, eicosapentaenoic ve Arachidonik asitlerin Epoxilenmiş metabolitlerinin enzimatik sentezini

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Decoding Transient Absorption - Processing, Fitting, and Interpreting Data

An Introduction to Processing, Fitting, and Interpreting Transient Absorption Data

Author Spotlight: Exploring Light-Driven Chemical Reactions and Energy-Harnessing Devices in Photochemical Research

Transient absorption (TA) spectroscopy is a powerful time-resolved spectroscopic method used to track the evolution of excited-state processes through ...