Name: transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice at JoVE.com

يعترف واضعو التمويل من خلال مركز الطفل للمناعة واللقاحات وجائزة مبتكر جديد المعاهد الوطنية للصحة (1DP2AI112242-01) منحت لتريسي J. الحمل. أشكر الكتاب أيضا ناتاليا P. Degtyareva للمساهمة سخية من rad1 س. الخباز.

1. الأشعة فوق البنفسجية الطفرات لتوليد العوز الغذائي سلالات الخميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد منحنيات البقاء على قيد الحياة لتحديد الجرعات المطلوبة من الأشعة فوق البنفسجية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد YPD (خلاصة...

<ol>
	<li>Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+physiological+characterization+of+Saccharomyces+boulardii,+the+probiotic+strain+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).</li><li>Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Heterologous+Protein+Expression+by+Genetically+Engineered+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii.">Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii.</a> PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).</li><li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , (1991).</li><li>DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+with+PCR+products+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 158, 113-117 (1995).</li><li>Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Uracil+Auxotroph+Strain+of+the+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii+as+a+Host+for+the+Recombinant+Protein+Production.">Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).</li><li>Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast.">Transformation of yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).</li><li>Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+transformation+of+intact+yeast+cells+by+electroinjection+of+plasmid+DNA.">A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).</li><li>Becker, D., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+yeast+by+electroporation.">High-efficiency transformation of yeast by electroporation.</a> Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 182-187 (1991).</li><li>Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+yeast+transformation+method+for+the+generation+of+very+large+human+antibody+libraries.">An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries.</a> Protein engineering, design &amp; selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).</li><li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations.">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).</li><li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi:+methods+and+possible+underlying+mechanism.">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li><li>Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+transformation+process+studied+by+fluorescence+labeling+technique.">Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique.</a> Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+yeast.">Genetic transformation of yeast.</a> BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ELISA+Method.+.">The ELISA Method. .</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2015).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).</li><li>Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Can't+Rodents+Vomit?+A+Comparative+Behavioral,+Anatomical,+and+Physiological+Study.">Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li><li>Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spoonful+of+sugar+helps+the+medicine+go+down:+a+novel+technique+to+improve+oral+gavage+in+mice.">A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).</li><li>Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat.">The rat.</a> Animal Models in Toxicology. , 50-193 (2006).</li><li>Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+produced+by+gavage+administration+in+the+rat.">Stress produced by gavage administration in the rat.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).</li><li>Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+diseases+of+mice.">Biology and diseases of mice.</a> Laboratory animal medicine. , 35-133 (2002).</li><li>Schulz, O., Pabst, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+sampling+in+the+small+intestine.">Antigen sampling in the small intestine.</a> Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).</li><li>McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103++dendritic+cells+in+the+small+intestine.">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li><li>Farache, J., Koren, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+bacteria+recruit+CD103++dendritic+cells+into+the+intestinal+epithelium+to+sample+bacterial+antigens+for+presentation.">Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation.</a> Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).</li><li>Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2000).</li><li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast:+5-fluoro-orotic+acid+resistance.">A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Molecular &amp; general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).</li><li>Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+lys2+mutants+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+the+utilization+of+alpha-aminoadipate.">Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate.</a> Genetics. 93, 51-65 (1979).</li><li>Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson, ., Hollis, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+counterselection+for+the+tryptophan+pathway+in+yeast:+5-fluoroanthranilic+acid+resistance.">A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance.</a> Yeast. 16 (6), 553-560 (2000).</li><li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiological+characterization+of+met15+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae:+a+selective+system+for+forward+and+reverse+mutations.">Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations.</a> Genetics. 81, 75-97 (1975).</li><li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+relationships+of+mercury+resistant+mutants+and+methionine+auxotrophs+of+yeast.">Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).</li><li>McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+DNA+binding+to+cell-surfaces+by+flow+cytometry.">Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Zhang, Z., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+stability+in+recombinant+saccharomyces+cerevisiae.">Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 14 (4), 401-435 (1996).</li><li>Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Fluorescent+Protein+Is+Lighting+Up+Fungal+Biology.">Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).</li><li>Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+the+preparation+of+yeast+cells+for+transformation+by+electroporation.">An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation.</a> Yeast. 14, 565-571 (1998).</li><li>Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavage-related+reflux+in+rats:+identification,+pathogenesis,+and+toxicological+implications+(review).">Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review).</a> Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).</li><li>Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+uptake+of+biodegradable+nanoparticles:+effect+of+particle+size.">Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size.</a> Pharma. 13 (12), (1994).</li><li>Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+uptake+by+Peyer's+patches:+a+pathway+for+drug+and+vaccine+delivery.">Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery.</a> Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).</li><li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function,+interactions,+and+post-translational+modifications.">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).</li><li>Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Auxotrophic+Mutants+of+Diploid+Industrial+Yeast+Strains+after+UV+Mutagenesis.">Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis.</a> Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).</li></ol>

معا، وبروتوكولات تصف الوثيقة الخطوات الأساسية اللازمة لتطوير واختبار بعامل نمائي سلالات الخميرة بروبيوتيك للتسليم من البروتين العلاجي مغاير إلى الأمعاء. هذا التلاعب واختبار الخميرة بروبيوتيك المؤتلف يتطلب تقنيات والموارد التي أي مختبر الفردية حاليا قد لا تكون مأ...

الكائنات الحية الدقيقة بروبيوتيك وسيلة للفضول المحتملة للبكفاءة واقتصاديا تقديم البروتينات مغاير إلى الجهاز الهضمي. هذه الكائنات قادرة على قيد الحياة المرور عبر الجهاز الهضمي بعد لا استعمار النتيجة 1، مما الجرعات التي تسيطر عليها والحد من التعرض للدواء أعربت. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على مهندس بسهولة هذه الكائنات لإنتاج البروتين مغاير على نطاق واسع يجعل لهم بديل اقتصادي لجزيئات تسليم الاصطناعية. ومع ذلك، وضع مثل هذا النهج، كما ثبت مؤخرا باستخدام سلالة العوز الغذائي في خميرة بروبيوتيك boulardii 2، يتطلب معرفة التقنيات المخبرية لا جنبا إلى جنب تقليديا ضمن دراسة معينة، بدءا من الخميرة وعلم الأحياء الجزيئي لتقنيات التعامل مع الحيوانات وأساليب المناعية. وهكذا على الرغم من أن الإجراءات الفردية صفها هنا ليست في حد ذاتها جديدةبروتوكولات المختبر، والهدف من هذا المخطوط هو تقديم مقدمة موحد لالتقنيات اللازمة للاختبار التجريبي من الخميرة بروبيوتيك بوصفها وسائل إيصال المخدرات إلى الجهاز الهضمي الفئران. تقدم هو عبارة عن تجميع من بروتوكولات أساسية ل: 1) توليد سلالات متحولة بعامل نمائي من الخميرة التي يمكن بسهولة التلاعب بها وراثيا. 2) التحول من الثقافات الخميرة للتعبير عن بروتين مغاير. 3) إدارة الخميرة المؤتلف إلى الأمعاء من خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم. و4) استعادة قابلة للحياة الخميرة بروبيوتيك المؤتلف من الأمعاء الفئران وتقييم بروتين تعبير مغاير لها. أولا، على الرغم من أن العديد من الأساليب الإيجابية والسلبية اختيار جود للتلاعب أنواع من الخميرة، واختيار السلبية مثل من خلال استخدام علامات بعامل نمائي يزيد كلا من الكفاءة والسهولة التي الخميرة يمكن أن تتحول ومختارة. اختيار الإيجابية للtransformants باستخدام المضادات الحيوية، بالتعاونntrast، ويزيد بشكل كبير من تكلفة الخميرة التلاعب. وعلاوة على ذلك، يمكن اختيار من الخميرة على وسائل الاعلام الصلبة التي تحتوي على المضادات الحيوية تسمح لزيادة نمو المستعمرات الخلفية هو دون تغيير النسبية لاختيار من الخميرة بعامل نمائي على انخفاض الاصطناعية من وسائل الاعلام الصلبة (الملاحظات غير منشورة). الخميرة العوز الغذائي لسلالات التي تفتقر إلى الانزيمات الهامة لتركيب الأحماض الأمينية الأساسية أو اليوراسيل. هذه الخميرة يمكن أن تنمو إلا إذا استكملت مع الأيض في عداد المفقودين أو الجينات الأيض، مما يمكن اختيار السلبية عند مطلي الخميرة على انخفاض الاصطناعية من وسائل الإعلام التي تفتقر إلى التمثيل الأيضي الأساسي. العديد من خميرة تستخدم عادة سلالات مختبر الخباز هي في الواقع بالفعل طفرات العوز الغذائي 3. الصناعية والسريرية، وسلالات الخميرة بروبيوتيك، ومع ذلك، وعادة ما تكون بدئية الاغتذاء مع القدرة على تجميع كل العناصر الغذائية اللازمة. لتمكين التلاعب الجيني أكثر كفاءة هذه الخميرة، الجينات بعامل نمائي يمكن استهداف انتقائيلتوليد سلالات التي يمكن اختيارها دون المضادات الحيوية. استهداف معين من الجينات علامة بعامل نمائي يمكن أن يتحقق من خلال تعطيل الجينات بوساطة PCR-الاعتماد على إعادة التركيب مثلي أو أكثر في الآونة الأخيرة من خلال كريسبر / Cas9 تستهدف 4-6. بدلا من ذلك، يمكن أن الطفرات الأشعة فوق البنفسجية تولد بسرعة طفرات العوز الغذائي حتى في سلالات الخميرة التي تحول مع البلازميدات متعددة يصعب من الناحية الفنية 7. في حين وصفت PCR استهداف وكريسبر / Cas9 على نطاق واسع في أماكن أخرى، قدم في جزء واحد من هذا المخطوط هو بروتوكول مفصلة وصف نهج الطفرات الأشعة فوق البنفسجية لخلق سلالات بعامل نمائي من شأنها أن تسمح لاختيار السلبية بدلا من اختيار المضادات الحيوية الإيجابية من transformants الخميرة. الخطوة الضرورية التالية في استخدام هذه السلالات بعامل نمائي للتسليم عن طريق الفم من بروتين مغاير هي خميرة التحول مع البلازميد. منذ التحول الناجح الأول من عمريspheroplasts ر ذكرت لخميرة الخباز في عام 1978 8، تم التعرف على العديد من التعديلات لزيادة الكفاءة والسهولة التي أنواع من الخميرة يمكن تعديلها وراثيا. استخدام Electroporation للللتحول الناجح من الحمض النووي في س. ووصف الخباز لأول مرة في عام 1985 (9) ومنذ ذلك الحين تم تحسينها من خلال إضافة حضانة 1 M السوربيتول إلى خلايا الدعم osmotically 10. وقد تبين كفاءة Electroporation للوعلاوة على ذلك تعتمد على أنواع من الخميرة والتوتر، عدد الخلايا ومرحلة النمو، وحجم Electroporation لل، والقوة الميدانية، ومخازن محددة 11. الليثيوم خلات (LiOAc) التحول، ووصف في الأصل من قبل إيتو وآخرون 12، من بين بروتوكولات التحول الأكثر شيوعا كما أنه لا يتطلب أي معدات خاصة. وأظهرت التحليلات الإضافية أن كفاءة LiOAc التحول الخميرة يزيد كثيرا عندما يتم جمع الخلايا في منتصف سجل مرحلةالنمو والحرارة صدمة في وجود البولي ايثيلين جلايكول (PEG) والحمض النووي في 42 ° C 12. حضانة من الخميرة سليمة كاملة مع PEG أمر ضروري للتحول كفاءة، ربما من خلال تحسين مرفق من الحمض النووي لغشاء الخلية وكذلك عن طريق التأثيرات الأخرى على الغشاء 13. كما الليثيوم نفسه يزيد من نفاذية خلايا سليمة (14). على الرغم من أن معظم المختبرات س. يمكن بسهولة سلالات الخباز أن تتحول باستخدام LiOAc التحول 3، أنواع الخميرة الأخرى قد تحولت بشكل أكثر كفاءة باستخدام بروتوكولات بديلة. Pichia pastoris، على سبيل المثال، هو الأكثر حولت بكفاءة عن طريق Electroporation للبدلا من LiOAc تحول 13. ومن الأهمية بمكان، بالتالي، لاختبار متعددة طرق التحول ولتحسين فترات الحضانة وتركيزات كاشف عند محاولة تعديل وراثيا سلالة الخميرة uncharacterized. وبالتالي هذا المخطوط يصف كل من LiOAc آرansformation و electroporation عن تقنيات لتحويل متحولة العوز الغذائي والنوع البري س. boulardii. وتوجه القراء المهتمين إلى الاستعراضات التي جرت مؤخرا لتوصيف دقيق لتطور خميرة التحول، بروتوكولات بديلة، وإجراء المزيد من المناقشات آليات العمل الممكنة 13،15. التحول من الخميرة مع ترميز البلازميد بروتين كشفها بسهولة ضروري علاوة على ذلك لاختبار المصب من أجل ضمان التعبير السليم وظيفة البروتين مغاير. يمكن اختيار البروتينات المختلفة لا تعد ولا تحصى تبعا للغرض النهائي للدراسة العلاجية والأجسام المضادة المتاحة للكشف عن البروتين immunoblotting، ELISA، وغيرها من التقنيات. بروتوكولات لهذه التقنيات قد تم وصفها بدقة في أي مكان آخر 16،17، ويمكن استخدامها لتحديد مستويات الإنتاج البروتين مغاير من الخميرة تتحول بالمقارنة مع منحنيات القياسية. لأغراض التظاهر ولاظهارإنتاج الناجح لبروتين يستخدم جدا عادة في الأحياء الخميرة، تقدم هذه المخطوطة التحول مع البروتين ترميز البلازميد فلوري الأخضر (GFP)، والذي يسمح للكشف لاحقا باستخدام المجهر مضان. نفس القدر من الأهمية لإنتاج الكائنات الحية بروبيوتيك التي تعبر عن بروتين مغاير هو الإدارة السليمة والكشف عن هذه الكائنات الدقيقة داخل أنسجة الجهاز الهضمي، كما هو موضح في الأجزاء الثلاثة والأربعة. إدارة الخميرة المؤتلف من خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم تسمح لتوريد كميات رقابة من الخميرة مباشرة إلى المعدة، والتي من C57BL / 6 الفئران غير قادرين على التقيؤ 18 بشكل طبيعي. ومع ذلك، غير لائق التعامل مع الحيوانات وأنبوب تغذية يمكن أن يؤدي إلى تلف المريء وثقب، انثقاب المعدة، وإدارة القصبة الهوائية، والالتهاب الرئوي التنفسي 19،20. تقنية الفقراء والخبرة يمكن أن تزيد علاوة على ذلك التباين في الاستجابات المناعية الفئران ودورة الفتشوب التجريبيةLTS، التي نسبت إلى إجهاد الحيوان على أنبوب تغذية عن طريق الفم 21،22. الممارسة في الأسلوب السليم يمكن أن يخفف بالتالي ليس فقط عدم الراحة الحيوان، ولكن يمكن أيضا زيادة دقة النتائج التجريبية. توضح هذه المخطوطة وتوضح التعامل مع الحيوانات وأنبوب تغذية عن طريق الفم لإعطاء جرعات تسيطر عليها من الخميرة المؤتلف. وأخيرا، من المهم جدا لتأكيد التسليم الناجح الخميرة المؤتلف من خلال تحليل الأنسجة اللمفاوية وجود الخميرة والبروتينات مغاير. الأنسجة المناعية الجهاز الهضمي التي يمكن أن معظم بسهولة ومتوقع أن تدرس لوجود الخميرة هي البقع باير ل. بقع باير هي الأجهزة اللمفاوية الثانوية على طول الأمعاء الدقيقة التي هي المواقع الرئيسية من الاستجابة المناعية المخاطية تحريض 23. يتم نقل مولدات المضادات من التجويف transcellularly من خلال microfold (M) الخلايا في البشرة ويتم إطلاقها في البقع باير، وبالتالي فضح أرفقد مستضد الخلايا المعوية محتويات اللمعية. على الرغم من امتصاص الجسيمات عبر الظهارة المعوية يمكن أيضا أن يتحقق من الخلايا الكأسية، وقد ثبت أن هذه الخلايا أن تأخذ فقط حتى الجسيمات أقل من 0.02 ميكرون في القطر 24. تمديد التشعبات بطريق الظهارة من CD103 + الخلايا الجذعية (DC) أيضا تناول جزيئات صغيرة من الأمعاء التجويف 25. ومع ذلك، هناك حاليا أي تقارير التي تبين أن CD103 + البلدان النامية يستغرق جزيئات أكبر من البكتيريا. وهكذا، الخميرة بروبيوتيك سليمة، من الحجم المتوسط ​​بين 3-6 ميكرون في القطر، من المرجح أن يتم تناولها من قبل الخلايا M وتحويلها إلى بقع على باير ل. وصفت هنا هو بروتوكول لجمع وفحص بقع باير لالخميرة المؤتلف قابلة للحياة، على الرغم من أن هذا الإجراء يمكن أيضا أن تتكيف بسهولة لتقييم امتصاص البكتيريا بروبيوتيك. وباختصار، تقييم الخميرة بروبيوتيك المؤتلف للتسليمالبروتينات rapeutic إلى الأمعاء تتطلب إجادة في التقنيات المخبرية التي تمتد البيولوجيا الجزيئية إلى التعامل مع الحيوان وعلم المناعة. المقدمة هنا هي بروتوكولات ل1) توليد وفحص سلالات الخميرة بعامل نمائي والتي يمكن بسهولة اختيار سلبا بدون المضادات الحيوية، 2) بروتوكولات بديلة لتحويل الخميرة ويمكن التعبير عن بروتين مغاير، 3) مظاهرات تقنيات التعامل مع الحيوانات السليمة وأنبوب تغذية عن طريق الفم ل تسليم المعدي من الخميرة المؤتلف، و4) بروتوكولات لتشريح التصحيح باير والكشف عن الخميرة المؤتلف قابلة للحياة والبروتين مغاير وظيفية. جنبا إلى جنب، وهذه البروتوكولات يسمح لتوليد واختبار الخميرة سلالة الكائنات الحية المجهرية قادرة على تقديم البروتين العلاجي مغاير إلى الجهاز الهضمي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:107px;">170-2501</td>
			<td style="width:275px;">Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">New Brunswick Roller Drum</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">M1053-4004</td>
			<td style="width:275px;">Example of roller drum for yeast culture incubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV Stratalinker 2400</td>
			<td style="width:107px;">Stratagene</td>
			<td style="width:107px;">400075-03</td>
			<td style="width:275px;">Example stratalinker</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stuart Colony Counter SC6PLUS</td>
			<td style="width:107px;">11983044</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scienceware Colony Counter&#160;</td>
			<td style="width:107px;">F378620002</td>
			<td style="width:107px;">Bel-Art Scienceware</td>
			<td style="width:275px;">Hand held colony counter pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica plating device</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td>09-718-1</td>
			<td rowspan="2" style="width:275px;">Example of replica plating stand and pads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen squares</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td>09-718-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;L shaped sterile cell spreaders&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:107px;">14665230</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">D7656-1ML</td>
			<td style="width:275px;">Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Gavage needles</td>
			<td style="width:107px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:107px;">N-PK&#160;002</td>
			<td style="width:275px;">For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:107px;">BD 309659</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7&#34; (178 mm) serrated tip, broad grip forceps</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">77937-28</td>
			<td style="width:275px;">Example of blunt forceps needed for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Straight and curved dissection scissors&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:107px;">72966-02 and 72966-03</td>
			<td style="width:275px;">Examples of scissors needed for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">IMDM</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:107px;">12440053</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

جيل من منحنى البقاء على قيد الحياة بعد اشعة فوق البنفسجية يتطلب الطلاء من خلايا الخميرة المخفف بحيث مستعمرة مميزة (كفو) قادرة على تشكيل. كل عينة 500 ميكرولتر التي تم جمعها على النحو المبين أعلاه يحتوي على حوالي 5 × 10 6 خلايا. ومع ذلك، أكثر من 100 الم?...

Watch this Scientific Journal Video about Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice at JoVE.com

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

المقدمة هنا هو وصف موحد من التقنيات التي يمكن استخدامها لتطوير وتحويل وإدارة، واختبار بروتين تعبير مغاير للخميرة الخباز بروبيوتيك boulardii.

التحول من الخميرة بروبيوتيك وشفائهم من الجهاز الهضمي المناعي الأنسجة بعد بالتزقيم عن طريق الفم في الفئران

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

النقل الشفوي لل<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في الفئران عن طريق ابتلاع الطعام الملوث

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

تحريض الفئران المعوية التهاب عن طريق نقل بالتبني من المستجيب CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; عالية</sup&gt; خلايا T في الفئران العوز المناعي

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

الكشف الموضعي من البكتيريا داخل أنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ من استخدام المسمى الديجوكسين DNA التحقيق استهداف 16S الريباسي

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

عزل وتوصيف والفحص الوظيفي لشبكة خلية اللثة المناعي

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

تحريض التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ في الفئران وتقييم توزيع الأمراض التي تعتمد على خلايا المناعة في الأنسجة المختلفة

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

الحماية فعالية والرئوي الاستجابة المناعية بعد تحت الجلد والطريق الأنفي BCG الإدارة في الفئران

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Probiotic Studies in Neonatal Mice Using Gavage

دراسات الكائنات الحية المجهرية في الفئران حديثي الولادة باستخدام تزقيمية

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult ...