Name: transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice at JoVE.com

Forfatterne anerkender finansiering gennem Børnenes Center for Immunologi og Vacciner og en NIH New Innovator Award (1DP2AI112242-01) tildelt Tracey J. Lamb. Forfatterne også takke Natalya P. Degtyareva for den generøse bidrag rad1 S. cerevisiae.

1. UV mutagenese for at generere Auxotrofe gærstammer <ol><li> Generere overlevelseskurver at bestemme nødvendige doser af UV-bestråling <ol><li> Forbered YPD (gærekstrakt pepton dextrose) medier og andre reagenser anført i tabel 1 ifølge standardprocedurer 26 og inokulere enkelte kolonier i 5-10 ml YPD medium. Inkuberes kulturer på en rulle tromle ved 30 ° CO / N til mætning i mindst 8 timer. </li><li> Bestem cellekoncentration på O / N kulturer under anvendelse af et spektrofoto...

<ol>
	<li>Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+physiological+characterization+of+Saccharomyces+boulardii,+the+probiotic+strain+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).</li><li>Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Heterologous+Protein+Expression+by+Genetically+Engineered+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii.">Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii.</a> PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).</li><li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , (1991).</li><li>DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+with+PCR+products+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 158, 113-117 (1995).</li><li>Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Uracil+Auxotroph+Strain+of+the+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii+as+a+Host+for+the+Recombinant+Protein+Production.">Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).</li><li>Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast.">Transformation of yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).</li><li>Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+transformation+of+intact+yeast+cells+by+electroinjection+of+plasmid+DNA.">A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).</li><li>Becker, D., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+yeast+by+electroporation.">High-efficiency transformation of yeast by electroporation.</a> Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 182-187 (1991).</li><li>Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+yeast+transformation+method+for+the+generation+of+very+large+human+antibody+libraries.">An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries.</a> Protein engineering, design &amp; selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).</li><li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations.">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).</li><li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi:+methods+and+possible+underlying+mechanism.">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li><li>Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+transformation+process+studied+by+fluorescence+labeling+technique.">Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique.</a> Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+yeast.">Genetic transformation of yeast.</a> BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ELISA+Method.+.">The ELISA Method. .</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2015).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).</li><li>Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Can't+Rodents+Vomit?+A+Comparative+Behavioral,+Anatomical,+and+Physiological+Study.">Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li><li>Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spoonful+of+sugar+helps+the+medicine+go+down:+a+novel+technique+to+improve+oral+gavage+in+mice.">A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).</li><li>Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat.">The rat.</a> Animal Models in Toxicology. , 50-193 (2006).</li><li>Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+produced+by+gavage+administration+in+the+rat.">Stress produced by gavage administration in the rat.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).</li><li>Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+diseases+of+mice.">Biology and diseases of mice.</a> Laboratory animal medicine. , 35-133 (2002).</li><li>Schulz, O., Pabst, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+sampling+in+the+small+intestine.">Antigen sampling in the small intestine.</a> Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).</li><li>McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103++dendritic+cells+in+the+small+intestine.">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li><li>Farache, J., Koren, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+bacteria+recruit+CD103++dendritic+cells+into+the+intestinal+epithelium+to+sample+bacterial+antigens+for+presentation.">Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation.</a> Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).</li><li>Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2000).</li><li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast:+5-fluoro-orotic+acid+resistance.">A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Molecular &amp; general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).</li><li>Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+lys2+mutants+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+the+utilization+of+alpha-aminoadipate.">Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate.</a> Genetics. 93, 51-65 (1979).</li><li>Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson, ., Hollis, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+counterselection+for+the+tryptophan+pathway+in+yeast:+5-fluoroanthranilic+acid+resistance.">A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance.</a> Yeast. 16 (6), 553-560 (2000).</li><li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiological+characterization+of+met15+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae:+a+selective+system+for+forward+and+reverse+mutations.">Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations.</a> Genetics. 81, 75-97 (1975).</li><li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+relationships+of+mercury+resistant+mutants+and+methionine+auxotrophs+of+yeast.">Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).</li><li>McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+DNA+binding+to+cell-surfaces+by+flow+cytometry.">Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Zhang, Z., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+stability+in+recombinant+saccharomyces+cerevisiae.">Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 14 (4), 401-435 (1996).</li><li>Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Fluorescent+Protein+Is+Lighting+Up+Fungal+Biology.">Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).</li><li>Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+the+preparation+of+yeast+cells+for+transformation+by+electroporation.">An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation.</a> Yeast. 14, 565-571 (1998).</li><li>Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavage-related+reflux+in+rats:+identification,+pathogenesis,+and+toxicological+implications+(review).">Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review).</a> Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).</li><li>Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+uptake+of+biodegradable+nanoparticles:+effect+of+particle+size.">Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size.</a> Pharma. 13 (12), (1994).</li><li>Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+uptake+by+Peyer's+patches:+a+pathway+for+drug+and+vaccine+delivery.">Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery.</a> Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).</li><li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function,+interactions,+and+post-translational+modifications.">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).</li><li>Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Auxotrophic+Mutants+of+Diploid+Industrial+Yeast+Strains+after+UV+Mutagenesis.">Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis.</a> Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).</li></ol>

Sammen protokollerne heri beskriver de væsentlige skridt, der er nødvendige for udvikling og afprøvning af auxotrofiske probiotiske gærstammer til levering af heterolog terapeutisk protein til tarmen. Denne manipulation og afprøvning af rekombinant probiotiske gær kræver teknikker og ressourcer, som enhver person laboratorium kan i øjeblikket ikke være bekendt. selvom mange tidligere undersøgelser har beskrevet ovenstående protokoller for flere gær og musestammer, disse metoder har således ikke til forfatte...

Probiotiske mikroorganismer er en spændende potentielt middel til effektivt og økonomisk at levere heterologe proteiner til mavetarmkanalen. Disse organismer er i stand til at overleve passage gennem mave-tarmkanalen endnu ikke kolonisere det 1, muliggør kontrolleret dosering og begrænse eksponering for lægemidlet udtrykkes. Endvidere mulighed for nemt at konstruere disse organismer til at producere heterologt protein i stor skala gør dem et økonomisk alternativ til syntetiske leveringstid partikler. Men udviklingen af en sådan fremgangsmåde, som for nylig demonstreret ved hjælp en auxotrof stamme af probiotiske gær Saccharomyces boulardii 2, kræver viden om laboratorieteknikker ikke traditionelt kombineret inden for en given undersøgelse, der spænder fra gær og molekylær biologi teknikker håndtering af dyr og immunologiske metoder. Således selv om de enkelte procedurer beskrevet heri, er ikke i sig selv hidtil ukendtlaboratorieprotokoller, målet med dette manuskript er at præsentere en samlet introduktion til teknikker, der er nødvendige for eksperimentel afprøvning af probiotiske gær som lægemiddeltilførselsvehikler til den murine mavetarmkanalen. Forudsat er en samling af væsentlige protokoller for: 1) generation af auxotrofiske mutant stammer af gær, der nemt kan genetisk manipulerede; 2) transformation af gær kulturer til at udtrykke heterolog protein; 3) indgivelse af rekombinant gær til tarmen via oral sondeernæring; og 4) genvinding af levedygtige rekombinant probiotiske gær fra murine tarmen og vurdering af deres heterolog proteinekspression. Første, selv om der findes adskillige positive og negative udvælgelsesmetoder til manipulation af gærarter, negativ selektion såsom gennem anvendelse af auxotrofe markører øger både effektivitet og lethed med hvilken gær kan transformeres og selekteres. Positiv selektion af transformanter ved hjælp af antibiotika, i samarbejdentrast, øger omkostningerne ved gær manipulation betydeligt. Endvidere kan valget af gær på antibiotika-holdige faste medier muliggøre øget vækst af utransformerede baggrund kolonier i forhold til udvælgelse af auxotrof gær på syntetisk frafald faste medier (upublicerede observationer). Auxotrofe gær er stammer, som mangler enzymer kritiske for syntesen af ​​essentielle aminosyrer eller uracil. Sådan gær kan kun vokse hvis suppleret med de manglende metabolit eller metabolisk gen, således at negativ selektion, når gær udplades på syntetisk dropout medier, der mangler den væsentlige metabolit. Mange almindeligt anvendte Saccharomyces cerevisiae laboratoriestammer er faktisk allerede auxotrofe mutanter 3. Industrial, klinisk, og probiotiske gærstammer, er imidlertid typisk prototrofisk med evnen til at syntetisere alle de nødvendige næringsstoffer. At muliggøre en mere effektiv genetisk manipulation af en sådan gær, kan auxotrofe gener selektivt målrettesat generere stammer, der kan vælges uden antibiotika. Specifik målretning af auxotrofe markørgener kan opnås gennem PCR-medieret genafbrydelse afhængige af homolog rekombination eller senere ved CRISPR / Cas9 målretning 4 - 6. Alternativt kan UV-mutagenese hurtigt at generere auxotrofe mutanter selv i gærstammer, for hvilke transformation med multiple plasmider teknisk er vanskeligt 7. Mens PCR målretning og CRISPR / Cas9 er blevet beskrevet udførligt andetsteds, præsenteret i første del af dette manuskript er en detaljeret protokol, der beskriver en UV mutagenese tilgang til at skabe auxotrofiske stammer, der vil give mulighed for negativ selektion snarere end positiv antibiotisk udvalg af gær transformanter. Det næste nødvendigt skridt i anvendelsen af ​​sådanne auxotrofe stammer til oral afgivelse af heterologt protein er gær transformation med plasmid-DNA. Siden den første vellykkede transformation af yeast sfæroplaster rapporteret for Saccharomyces cerevisiae i 1978 8 har talrige modifikationer blevet karakteriseret at øge effektiviteten og lethed med hvilken gærart kan modificeres genetisk. Anvendelse af elektroporation for vellykket transformation af DNA i S. cerevisiae blev første gang beskrevet i 1985 9 og er siden blevet forbedret ved tilsætning af 1 M sorbitol inkubation til osmotisk støtteceller 10. Elektroporation effektivitet har endvidere vist sig at afhænge af gær art og stamme, celle nummer og vækstfase, elektroporation volumen, feltstyrke, og specifikke buffere 11. Lithiumacetat (LiOAc) transformation, oprindeligt beskrevet af Ito et al. 12, er blandt de mest almindeligt anvendte transformationsprotokoller da det kræver ikke særligt udstyr. Yderligere analyser viste, at effektiviteten af ​​LiOAc gær transformation øger når celler opsamles i midten af ​​log-faseaf vækst og for varmechok i nærvær af polyethylenglycol (PEG) og DNA ved 42 ° C 12. Inkubation af hele intakte gær med PEG er væsentlig for effektiv transformation, eventuelt ved at forbedre binding af DNA til cellemembranen samt via andre effekter på membranen 13. Lithium selv øger også permeabiliteten af intakte celler 14. Selv om de fleste laboratorium S. cerevisiae-stammer kan let transformeres under anvendelse LiOAc transformation 3, kan andre gærarter være mere effektivt omdannes ved hjælp af alternative protokoller. Pichia pastoris, for eksempel, er mest effektivt transformeret via elektroporation stedet LiOAc transformation 13. Det er afgørende, således at teste flere metoder til transformation og optimere inkubationsperioder og reagenskoncentrationer når de forsøger at gensplejse en karakteriseret gærstamme. Dette manuskript beskriver således både LiOAc transformation og elektroporation som teknikker til omdannelse af auxotrofe mutant og vildtype S. boulardii. Interesserede læsere er rettet til de seneste anmeldelser for grundige beskrivelser af udviklingen af gær transformation, alternative protokoller, og yderligere drøftelser af mulige virkningsmekanismer 13,15. Transformation af gær med plasmid koder for et let påviseligt protein er desuden afgørende for downstream test for at sikre korrekt udtryk og funktion af heterologt protein. Myriad forskellige proteiner kan vælges afhængigt af det endelige formål med den terapeutiske studier og antistofferne tilgængelige for protein detektion ved immunoblotting, ELISA og andre teknikker. Protokoller for disse teknikker er blevet grundigt beskrevet andetsteds 16,17, og kan anvendes til at bestemme niveauer af heterolog proteinproduktion fra transformeret gær ved sammenligning med standardkurver. Med henblik på demonstration og at visevellykket produktion af et meget almindeligt anvendt protein i gær biologi, dette håndskrift viser transformation med plasmid, der koder grønt fluorescerende protein (GFP), som giver mulighed for efterfølgende påvisning ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Lige så vigtigt for produktionen af ​​probiotiske organismer, som udtrykker heterologe protein er den korrekte administration og påvisning af disse mikroorganismer i gastrointestinale væv, som beskrevet i del tre og fire. Indgivelse af rekombinant gær via oral sondeernæring muliggør levering af styrede mængder af gær direkte i maven, hvorfra C57BL / 6-mus er naturligvis ude af stand opkastning 18. Forkert håndtering af dyr og sonde, kan imidlertid føre til esophageal skader og perforering, gastrisk perforation, tracheal administration, og aspiration lungebetændelse 19,20. Dårlig teknik og erfaring kan desuden øge variationen i murine immunrespons og eksperimenterende results, som er blevet tilskrevet dyr stress på oral sonde 21,22. Praksis i rette teknik kan således ikke blot svække dyret ubehag, men kan også øge præcisionen af ​​eksperimentelle resultater. Dette manuskript beskriver og demonstrerer håndtering af dyr og oral sonde til administration af kontrollerede doser af rekombinant gær. Endelig er det vigtigt at fastslå, vellykket levering af rekombinant gær ved at analysere lymfoide væv for tilstedeværelse af gær og heterologt protein. De gastrointestinale immune væv, som kan lettest og forudsigeligt undersøges for tilstedeværelsen af ​​gær er de Peyerske plaques. Peyerske plaques er sekundære lymfoide organer langs tyndtarmen, der er vigtige steder for mucosal immunreaktion induktion 23. Antigener fra lumen overføres transcellularly gennem microfold (M) celler i epitel og frigives i Peyerske plaques, og derved udsatte vedlægged antigenpræsenterende celler til intestinal lumen indhold. Selvom partikel optagelse over tarmepitelet også kan opnås ved slimceller, er disse celler blevet vist at kun optager partikler mindre end 0,02 um i diameter 24. Transepitelial dendritter udvides fra CD103 + dendritiske celler (DC) også optager små partikler fra tarmlumen 25; men der er i øjeblikket ingen rapporter, som dokumenterer, at CD103 + DC&#39;er tage op partikler end bakterier. Således intakt probiotiske gær, af gennemsnitlige størrelse mellem 3-6 um i diameter, er mest tilbøjelige til at blive taget op af M-celler og overføres til de Peyerske plaques. Beskrevet her er en protokol for indsamling og screening af Peyerske plaques for levedygtig rekombinant gær, selv om denne procedure også kan let tilpasses til evaluering optagelse af probiotiske bakterier. Sammenfattende vurdering rekombinant probiotiske gær for levering afrapeutic proteiner til tarmen kræver færdigheder i laboratorieteknikker spænder molekylærbiologi til håndtering af dyr og immunologi. Præsenteret her er protokoller for 1) genereringen og screeningen af ​​auxotrofe gærstammer som let kan selekteres negativt uden antibiotika, 2) alternative protokoller til transformation gær og muliggøre ekspression af heterologt protein, 3) demonstrationer af korrekt håndtering af dyr teknikker og oral sondeernæring til intragastrisk levering af rekombinant gær, og 4) protokoller for Peyerske plak dissektion og screening for levedygtig rekombinant gær og funktionelt heterologt protein. Tilsammen vil disse protokoller muliggøre generering og testning af en probiotisk gærstamme kan levere heterologt terapeutisk protein til mavetarmkanalen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:107px;">170-2501</td>
			<td style="width:275px;">Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">New Brunswick Roller Drum</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">M1053-4004</td>
			<td style="width:275px;">Example of roller drum for yeast culture incubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV Stratalinker 2400</td>
			<td style="width:107px;">Stratagene</td>
			<td style="width:107px;">400075-03</td>
			<td style="width:275px;">Example stratalinker</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stuart Colony Counter SC6PLUS</td>
			<td style="width:107px;">11983044</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scienceware Colony Counter&#160;</td>
			<td style="width:107px;">F378620002</td>
			<td style="width:107px;">Bel-Art Scienceware</td>
			<td style="width:275px;">Hand held colony counter pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica plating device</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td>09-718-1</td>
			<td rowspan="2" style="width:275px;">Example of replica plating stand and pads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen squares</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td>09-718-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;L shaped sterile cell spreaders&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:107px;">14665230</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">D7656-1ML</td>
			<td style="width:275px;">Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Gavage needles</td>
			<td style="width:107px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:107px;">N-PK&#160;002</td>
			<td style="width:275px;">For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:107px;">BD 309659</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7&#34; (178 mm) serrated tip, broad grip forceps</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">77937-28</td>
			<td style="width:275px;">Example of blunt forceps needed for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Straight and curved dissection scissors&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:107px;">72966-02 and 72966-03</td>
			<td style="width:275px;">Examples of scissors needed for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">IMDM</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:107px;">12440053</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Generering af en overlevelseskurve efter UV-bestråling kræver udpladning af fortyndede gærceller, således at særskilte kolonidannende enheder (CFU) er i stand til at danne. Hver 500 pi prøve opsamles som ovenfor beskrevet indeholder ca. 5 x 10 6 celler; dog større end 100 kolonier per plade er vanskeligt præcist at skelne. Plating ufortyndede prøve samt serielle 1:10 fortyndinger af bestrålede celler sikrer således, at CFU kan opregnes ved hver UV-dosis, som...

Watch this Scientific Journal Video about Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice at JoVE.com

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Præsenteret her er en samlet beskrivelse af teknikker, der kan anvendes til at udvikle, transformere, administrere og teste heterologt protein ekspression af de probiotiske gæren Saccharomyces boulardii.

Transformation af Probiotic Gær og deres Recovery fra Mave Immune væv efter oral sonde i mus

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral transmission af<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I Mus via indtagelse af forurenet mad

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion af murine tarmbetændelse ved adoptiv overførsel af effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høj</sup&gt; T celler i immunsvækkede mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In situ påvisning af bakterier i paraffinindlejrede Væv Brug en Digoxin-mærket DNA Probe Målretning 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolation, karakterisering og funktionelle Undersøgelse af Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induktion af Experimental Autoimmune Encephalomyelitis i mus og evaluering af sygdommen-afhængige Fordeling af immunceller i forskellige væv

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Beskyttende Effekt og Pulmonal immunrespons efter subkutan og Intranasal BCG Administration i mus

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Probiotic Studies in Neonatal Mice Using Gavage

Probiotiske undersøgelser i Neonatal mus ved hjælp af sonde

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult ...