Name: transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice at JoVE.com

המחברים מודים מימון דרך של מרכז ילדים לאימונולוגיה חיסונים וכן פרס ממציא ניו NIH (1DP2AI112242-01) הוענק טרייסי ג &#39;למב. המחברים מודים גם נטליה פ Degtyareva על התרומה הנדיבה של rad1 ס cerevisiae.

1. mutagenesis UV כדי ליצור זני שמרים Auxotrophic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עקומות הישרדות לקבוע המנות הדרושות של קרינה UV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן YPD (דקסטרוז peptone תמצית שמרים) תקשורת ריאגנטים אחרים המפורטים בטבלה <stron...

<ol>
	<li>Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+physiological+characterization+of+Saccharomyces+boulardii,+the+probiotic+strain+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).</li><li>Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Heterologous+Protein+Expression+by+Genetically+Engineered+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii.">Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii.</a> PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).</li><li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , (1991).</li><li>DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+with+PCR+products+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 158, 113-117 (1995).</li><li>Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Uracil+Auxotroph+Strain+of+the+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii+as+a+Host+for+the+Recombinant+Protein+Production.">Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).</li><li>Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast.">Transformation of yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).</li><li>Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+transformation+of+intact+yeast+cells+by+electroinjection+of+plasmid+DNA.">A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).</li><li>Becker, D., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+yeast+by+electroporation.">High-efficiency transformation of yeast by electroporation.</a> Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 182-187 (1991).</li><li>Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+yeast+transformation+method+for+the+generation+of+very+large+human+antibody+libraries.">An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries.</a> Protein engineering, design &amp; selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).</li><li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations.">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).</li><li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi:+methods+and+possible+underlying+mechanism.">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li><li>Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+transformation+process+studied+by+fluorescence+labeling+technique.">Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique.</a> Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+yeast.">Genetic transformation of yeast.</a> BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ELISA+Method.+.">The ELISA Method. .</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2015).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).</li><li>Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Can't+Rodents+Vomit?+A+Comparative+Behavioral,+Anatomical,+and+Physiological+Study.">Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li><li>Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spoonful+of+sugar+helps+the+medicine+go+down:+a+novel+technique+to+improve+oral+gavage+in+mice.">A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).</li><li>Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat.">The rat.</a> Animal Models in Toxicology. , 50-193 (2006).</li><li>Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+produced+by+gavage+administration+in+the+rat.">Stress produced by gavage administration in the rat.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).</li><li>Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+diseases+of+mice.">Biology and diseases of mice.</a> Laboratory animal medicine. , 35-133 (2002).</li><li>Schulz, O., Pabst, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+sampling+in+the+small+intestine.">Antigen sampling in the small intestine.</a> Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).</li><li>McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103++dendritic+cells+in+the+small+intestine.">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li><li>Farache, J., Koren, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+bacteria+recruit+CD103++dendritic+cells+into+the+intestinal+epithelium+to+sample+bacterial+antigens+for+presentation.">Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation.</a> Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).</li><li>Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2000).</li><li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast:+5-fluoro-orotic+acid+resistance.">A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Molecular &amp; general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).</li><li>Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+lys2+mutants+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+the+utilization+of+alpha-aminoadipate.">Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate.</a> Genetics. 93, 51-65 (1979).</li><li>Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson, ., Hollis, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+counterselection+for+the+tryptophan+pathway+in+yeast:+5-fluoroanthranilic+acid+resistance.">A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance.</a> Yeast. 16 (6), 553-560 (2000).</li><li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiological+characterization+of+met15+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae:+a+selective+system+for+forward+and+reverse+mutations.">Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations.</a> Genetics. 81, 75-97 (1975).</li><li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+relationships+of+mercury+resistant+mutants+and+methionine+auxotrophs+of+yeast.">Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).</li><li>McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+DNA+binding+to+cell-surfaces+by+flow+cytometry.">Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Zhang, Z., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+stability+in+recombinant+saccharomyces+cerevisiae.">Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 14 (4), 401-435 (1996).</li><li>Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Fluorescent+Protein+Is+Lighting+Up+Fungal+Biology.">Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).</li><li>Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+the+preparation+of+yeast+cells+for+transformation+by+electroporation.">An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation.</a> Yeast. 14, 565-571 (1998).</li><li>Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavage-related+reflux+in+rats:+identification,+pathogenesis,+and+toxicological+implications+(review).">Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review).</a> Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).</li><li>Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+uptake+of+biodegradable+nanoparticles:+effect+of+particle+size.">Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size.</a> Pharma. 13 (12), (1994).</li><li>Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+uptake+by+Peyer's+patches:+a+pathway+for+drug+and+vaccine+delivery.">Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery.</a> Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).</li><li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function,+interactions,+and+post-translational+modifications.">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).</li><li>Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Auxotrophic+Mutants+of+Diploid+Industrial+Yeast+Strains+after+UV+Mutagenesis.">Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis.</a> Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).</li></ol>

יחד, הפרוטוקולים בזאת לתאר את הצעדים החיוניים הדרושים לפיתוח ובדיקה של זני שמרים פרוביוטיים auxotrophic למסירה של החלבון התרופתי Heterologous אל המעי. מניפולציה ובדיקה זו של שמרי פרוביוטיים רקומביננטי דורשים טכניקות ומשאבים שבה כל מעבדת פרט לא יכול כרגע להיות מוכרות. לכן, למרו...

מיקרואורגניזמים פרוביוטיים הם אמצעי פוטנציאל מסקרן של יעיל וחסכוני ומספק חלבונים Heterologous בבני האדם במערכת העיכול. אורגניזמים אלה מסוגלים לשרוד מעבר דרך מערכת העיכול עדיין לא ליישב אותו 1, מה שמאפשר מינון מבוקר הגבלת החשיפה לתרופה לידי ביטוי. יתר על כן, את היכולת להנדס אלה אורגניזמים בקלות לייצר חלבון Heterologous בקנה מידה גדול הופך אותם חלופה חסכונית חלקיקי משלוח סינטטיים. עם זאת, פיתוח של גישה כזו, כפי שהודגם לאחרונה באמצעות זן auxotrophic של Saccharomyces שמרים פרוביוטיים 2 boulardii, דורש ידע של טכניקות מעבדה לא משולבים באופן מסורתי בתוך מחקר נתון, החל שמרים וביולוגיה מולקולרית לטכניקות טיפול בבעלי חיים ושיטות אימונולוגיות. לכן למרות נהלי הפרט המתוארים כאן אינם כשלעצמם רומןפרוטוקולי מעבדה, מטרה של כתב היד הזה הוא להציג הקדמה מאוחדת לטכניקות דרושי בדיקה ניסיונית של שמרי פרוביוטיים כרכב תרופה ניתנת מערכת עיכול Murine. מסופק הוא אוסף של פרוטוקולים חיוניים: 1) הפקה של זנים מוטנטים auxotrophic של שמרים שיכולים בקלות להיות מניפולציות גנטיות; 2) שינוי של תרביות שמרים להביע חלבון Heterologous; 3) הממשל של שמרים רקומביננטי למעי gavage דרך הפה; ו -4) התאוששות של שמרים פרוביוטיים קיימא רקומביננטי מהמעי murine והערכה של ביטוי חלבון Heterologous שלהם. ראשית, אם כי שיטות בחירה חיובית ושלילית רבות קיימות עבור המניפולציה של מיני שמרים, סלקציה שלילית כגון באמצעות סמני auxotrophic מגבירה היא את היעילות ואת הקלות שבה שהמרים ניתן להפוך נבחר. סלקציה חיובית של transformants באמצעות אנטיביוטיקה, בשיתוףntrast, מגביר באופן משמעותי את העלות של מניפולציה שמרים. יתר על כן, בחירה של שמרים על תקשורת מוצקה המכילה אנטיביוטיקה יכולה לאפשר צמיחה מוגברת של מושבות רקע untransformed ביחס בחירה של שמרי auxotrophic על ירידה סינטתית החוצה תקשורת מוצקה (תצפיות לא פורסם). שמרי Auxotrophic הם זנים אשר חסרים אנזימים קריטיים לסינתזה של חומצות או אורציל האמינו חיוניות. כזה שמרים יכולים לגדול רק אם השלים עם המטבוליט החסר או גני מטבוליים, ובכך לאפשר סלקציה שלילית כאשר שמרים מצופית על ירידה סינטתית החוצה תקשורת כי חסרה את המטבוליט החיוני. רבים נפוצים זני מעבדת שמר אפייה הם למעשה כבר auxotrophic מוטנטים 3. תעשייתי, קליני, ואת זני שמרים פרוביוטיים, לעומת זאת, הם בדרך כלל prototrophic עם היכולת לסנתז את כל החומרים המזינים הנדרשים. כדי לאפשר מניפולציה גנטית יעילה יותר של שמרים כאלה, גני auxotrophic ניתן לכוון באופן סלקטיביכדי ליצור זנים שיכולים להיבחר ללא אנטיביוטיקה. מיקוד ספציפי של גני סמן auxotrophic יכול להיות מושג באמצעות שיבוש גנטי בתיווך PCR להסתמך על רקומבינציה הומולוגי או ולאחרונה דרך CRISPR / Cas9 מיקוד 4 - 6. לחלופין, mutagenesis UV יכול במהירות ליצור מוטציות auxotrophic אפילו זני שמרים עבורו טרנספורמציה עם פלסמידים מרובים מבחינה טכנית קשה 7. למרות שהמיקוד PCR ו CRISPR / Cas9 תוארו בהרחבה במקומות אחרים, המופיעים בחלק אחד של כתב היד הזה הוא פרוטוקול מפורט המתאר גישה mutagenesis UV כדי ליצור זנים auxotrophic שיאפשרו סלקציה שלילית ולא חיובית מבחר אנטיביוטי של transformants שמרים. הצעד הכרחי הבא בשימוש זנים auxotrophic כזה למסירה אוראלי של חלבון Heterologous הוא טרנספורמציה שמרים עם DNA פלסמיד. מאז השינוי המוצלח הראשון של עצירהspheroplasts t ודווח שמר האפייה בשנת 1978 8, שינויים רבים מתאפיינים כדי להגביר את היעילות ואת הקלות שבה מינים שמרים יכולים להיות מהונדסים גנטית. השימוש electroporation עבור טרנספורמציה מוצלחת של ה- DNA לתוך ס cerevisiae תואר לראשונה בשנת 1985 9 ומאז שופר באמצעות התוספת של 1 M דגירת סורביטול לתאי התמיכה אוסמוטי 10. יעילות Electroporation יתר הוכח תלוי מינים שמרים ומתח, מספר תא בשלב של צמיחה, נפח electroporation, עוצמת שדה, או מאגר ספציפי 11. הטרנספורמציה יצטט ליתיום (LiOAc), תארה במקור על ידי איטו et al. 12, היא בין פרוטוקולי השינוי הנפוצים ביותר כפי שהוא דורש שום ציוד מיוחד. ניתוחים נוספים הראו כי יעילות הטרנספורמציה שמרים LiOAc מגדיל מאוד כאשר התאים נאספים בשלב אמצע יומןהצמיחה וחום מזדעזעים בנוכחות פוליאתילן גליקול (PEG) ו- DNA על 42 מעלות צלזיוס 12. דגירה של שמרים שלמים ללא רבב עם PEG חיונית שינוי יעיל, ואולי באמצעות שיפור מצורף של DNA על קרום תא, כמו גם באמצעות אפקטים אחרים על הממברנה 13. ליתיום עצמו גם מעלה את החדירות של תאים שלמים 14. למרות שרוב המעבדה ס זני cerevisiae ניתן להפוך בקלות באמצעות LiOAc טרנספורמציה 3, מיני שמרים אחרים עשויים להשתנות בצורה יעילה יותר תוך שימוש בפרוטוקולים חלופי. pastoris Pichia, למשל, הוא הכי טרנספורמציה ביעילות דרך electroporation ולא טרנספורמציה LiOAc 13. זה חיוני, אפוא, לבדוק מספר שיטות של שינוי וכדי לייעל תקופות דגירה וריכוזיות מגיב כאשר מנסים לשנות גנטי זן שמרי uncharacterized. כתב יד זה וכך מתאר הוא LiOAc transformation ו electroporation כמו טכניקות הטרנספורמציה של מוטציה auxotrophic וסוג בר ס boulardii. קוראים מעוניינים מופנים סקירות אחרונות לתיאורים יסודיים של האבולוציה של טרנספורמציה שמרים, פרוטוקולים חלופיים, ודיונים נוספים של מנגנוני פעולה אפשריים 13,15. טרנספורמציה של שמרים עם קידוד פלסמיד חלבון שניתן לזיהוי בקלות הוא יתר חיוני לבדיקה במורד הזרם כדי להבטיח ביטוי הולם ותפקוד של חלבון Heterologous. חלבונים השונים מיריאד ניתן לבחור בהתאם את המטרה הסופית של המחקר הטיפולי ואת הנוגדנים זמינים לגילוי חלבון על ידי immunoblotting, ELISA, וטכניקות אחרות. פרוטוקולים עבור טכניקות אלו תוארו ביסודיות במקום אחר 16,17, והוא יכול לשמש כדי לקבוע רמות של ייצור חלבון Heterologous משמרים טרנספורמציה בהשוואת עקומות סטנדרטיות. להדגמה ולהראותייצור מוצלח של חלבון מאוד נפוץ בביולוגיה שמרים, כתב היד הזה מציג טרנספורמציה עם חלבון פלואורסצנטי ירוק קידוד פלסמיד (GFP), אשר מאפשר זיהוי שלאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לא פחות חשוב בייצור של אורגניזמים פרוביוטיים המבטאים חלבון Heterologous הוא המנהל תקין זיהוי של מיקרואורגניזמים אלה בתוך רקמות עיכול, כמתואר חלק שלושה וארבעה. מנהל של שמרי רקומביננטי gavage דרך הפה מאפשר אספקה ​​של כמויות מבוקרות של שמרים ישירות לקיבה, שממנו C57BL / 6 עכברים אינן מסוגלות באופן טבעי של הקאות 18. עם זאת, טיפול בבעלי חיים פסולים gavage עלולים להביא לניזק ושט ניקוב, ניקוב קיבה, ממשל קנה נשימה, ושאיפת דלקת ריאות 19,20. טכניקה וחוסר ניסיון מסכנה יתר יכולים להגדיל השתנות בתגובות murine חיסוניות resu הניסיוןLTS, אשר יוחס מתח חיה על gavage פי 21,22. עיסוק בטכניקה הנכונה ולכן לא יכול רק להחליש חוסר נוחות לבעל חיים, אלא גם יכול להגדיל את הדיוק של תוצאות ניסוי. כתב יד זה מתאר ומדגים טיפול בבעלי חיים ו gavage הפה עבור הממשל של מינונים מבוקרים של שמרים רקומביננטי. לבסוף, הוא חיוני, כדי לאשר מסירה מוצלחת של שמרי רקומביננטי ידי ניתוח רקמות הלימפה לנוכחות שמרים וחלבון Heterologous. הרקמות החיסוניות העיכול שיכול בקלות על וכצפוי להיבדק לנוכחות של שמרים הן הטלאים של Peyer. טלאים של Peyer הם איברים הלימפה משני לאורך המעי הדק כי הם אתרים מרכזיים של אינדוקציה התגובה החיסונית ברירית 23. אנטיגנים מן לומן מועברים transcellularly דרך microfold (M) תאי האפיתל ומשתחררים לתוך טלאים של Peyer, ובכך חושפים הקףאנטיגן ד הצגה לתאי מעי תוכן לומינל. למרות ספיגת חלקיקים על פני האפיתל במעי יכול גם להיות מושגת על ידי תאי גביע, תאים אלה הוכחו חלקיקים תופסים רק פחות מ 0.02 מיקרומטר בקוטר 24. דנדריטים Transepithelial הוארכו מ CD103 + תאים דנדריטים (DC) גם תופס חלקיקים קטנים מן המעי לומן 25; עם זאת, אין כיום דיווחים הוכחת כי CD103 + DCs תופס חלקיקים גדולים יותר מאשר חיידקים. לכן, ללא שינוי שמרים פרוביוטיים, בגודל ממוצע בין 3-6 מיקרומטר קוטר, הם הסיכוי הטוב ביותר להיות נלקח על ידי תאים M והועבר טלאים של Peyer. מתואר כאן הוא פרוטוקול לאיסוף והקרנת הטלאים של Peyer עבור שמרי רקומביננטי קיימא, למרות ההליך זה יכול גם להיות מותאם בקלות להערכת ספיגה של חיידקים פרוביוטיים. לסיכום, להערכת שמרים פרוביוטיים רקומביננטי עבור משלוח שלחלבונים rapeutic למעי דורש מיומנות בטכניקות מעבדה פורש ביולוגיה מולקולרית כדי טיפול ואימונולוגיה חיה. הפרוטוקולים שהוצגו כאן הם עבור 1) הדור והקרנת זני שמרים auxotrophic אשר ניתן לבחור באופן שלילי בקלות ללא אנטיביוטיקה, 2) פרוטוקולים חלופיים להפוך שמרים ולאפשר ביטוי חלבון Heterologous, 3) הפגנות של טכניקות טיפול בבעלי חיים נאותה gavage אוראלי משלוח intragastric של שמרים רקומביננטי, ופרוטוקולים 4) לנתיחה תיקון של Peyer וסינון עבור שמרים רקומביננטי קיימא וחלבון Heterologous פונקציונלי. בשילוב, פרוטוקולים אלה יאפשרו לדור ובדיקה של זן שמרים פרוביוטיים מסוגל לספק החלבון התרופתי Heterologous בבני האדם במערכת העיכול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:107px;">170-2501</td>
			<td style="width:275px;">Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">New Brunswick Roller Drum</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">M1053-4004</td>
			<td style="width:275px;">Example of roller drum for yeast culture incubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV Stratalinker 2400</td>
			<td style="width:107px;">Stratagene</td>
			<td style="width:107px;">400075-03</td>
			<td style="width:275px;">Example stratalinker</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stuart Colony Counter SC6PLUS</td>
			<td style="width:107px;">11983044</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scienceware Colony Counter&#160;</td>
			<td style="width:107px;">F378620002</td>
			<td style="width:107px;">Bel-Art Scienceware</td>
			<td style="width:275px;">Hand held colony counter pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica plating device</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td>09-718-1</td>
			<td rowspan="2" style="width:275px;">Example of replica plating stand and pads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen squares</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td>09-718-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;L shaped sterile cell spreaders&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:107px;">14665230</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">D7656-1ML</td>
			<td style="width:275px;">Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Gavage needles</td>
			<td style="width:107px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:107px;">N-PK&#160;002</td>
			<td style="width:275px;">For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:107px;">BD 309659</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7&#34; (178 mm) serrated tip, broad grip forceps</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">77937-28</td>
			<td style="width:275px;">Example of blunt forceps needed for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Straight and curved dissection scissors&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:107px;">72966-02 and 72966-03</td>
			<td style="width:275px;">Examples of scissors needed for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">IMDM</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:107px;">12440053</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

דור של עקומת הישרדות בעקבות הקרינה UV דורש ציפוי של תאי שמרים מדוללים כך להרכיב יחידות מושבה ברורות (CFU) מסוגלות ליצור. כל דגימה 500 μl שנאספו כמתואר לעיל מכיל כ 5 x 10 6 תאים; עם זאת, יותר מ -100 מושבות בכל צלחת שקשה להבחין במדויק. ציפוי מדגם חי וכן דילול?...

Watch this Scientific Journal Video about Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice at JoVE.com

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

אנו מציגים כאן תיאור אחיד של טכניקות שיכולות לשמש לפיתוח, לשנות, לנהל, ולבדוק ביטוי חלבון Heterologous של boulardii Saccharomyces שמרים פרוביוטיים.

טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

הילוכים אוראלי של<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בעכברים באמצעות בליעה של מזון מזוהם

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

באתרו איתור של חיידקים בתוך רקמות מוטבעות-פרפין באמצעות DNA בדיקה שכותרת Digoxin מיקוד 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

אינדוקציה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis עכברים וההערכה של הפצת מחלות התלויה של תאים חיסוניים ברקמות שונות

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

מגן היעילות ריאתי החיסונית בתגובה תת עורי ואת אפי BCG מינהל עכברים

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Probiotic Studies in Neonatal Mice Using Gavage

פרוביוטיקה מחקרים בעכברים Neonatal באמצעות Gavage

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult ...