Name: transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00
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著者らは、トレイシーJ.ラムに授与免疫とワクチンおよびNIH新イノベーター賞（1DP2AI112242-01）のための児童センターを通じて資金調達を認めます。著者らはまた、RAD1 Sの寛大な貢献のためナタリアP. Degtyarevaに感謝セレビシエ 。

栄養要求性酵母株を生成する1. UV突然変異誘発<ol><li> UV照射の必要な用量を決定するために、生存曲線を生成します<ol><li>標準的な手順26に従って、表1に記載されたYPD（酵母エキスペプトンデキストロース）メディアおよび他の試薬 ​​を準備し、YPD培地5〜10mlの中に単一コロニーを接種します。少なくとも8時間、飽和するまで30°CO / Nでローラードラム上で培養をイン?...

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P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function,+interactions,+and+post-translational+modifications.">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).</li><li>Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Auxotrophic+Mutants+of+Diploid+Industrial+Yeast+Strains+after+UV+Mutagenesis.">Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis.</a> Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).</li></ol>

一緒に、プロトコルは、本明細書中に腸への異種治療用タンパク質の送達のための栄養要求性プロバイオティクス酵母株の開発とテストのために必要な基本的な手順を説明します。この操作および組換えプロバイオティクス酵母のテストは、個々の研究室では現在、慣れていない可能性があるとの技術とリソースが必要です。多数の以前の研究では、複数の酵母とマウスの株については、上?...

プロバイオティック微生物は、効率的かつ経済的に消化管に異種タンパク質を提供する魅力的な潜在的な手段です。これらの生物は、まだ1コロニーを形成しない消化管通過を存続制御の投与を可能にし、薬物が発現への曝露を制限することが可能です。また、簡単に大規模で異種タンパク質を産生するために、これらの生物を設計する能力は、それらを合成送達粒子への経済的な代替をレンダリングします。しかし、このようなアプローチの開発は、最近2 ブラウディプロバイオティクス酵母サッカロマイセスの栄養要求株を用いて実証されたように、実験技術の知識が伝統的に酵母および分子生物学から動物取扱技術および免疫学的方法に至るまで、与えられた研究の中に結合していない必要があります。したがって、本明細書に記載の個々の手順は、それ自体では小説ではありませんが、実験室プロトコルは、本稿の目的は、マウス消化管への薬物送達ビヒクルとしてプロバイオティクス酵母の実験的試験のために必要な技術と統合された導入を提示することです。提供に不可欠なプロトコルをまとめたものです：簡単に遺伝的に操作することができる酵母の栄養要求性変異株の1）の生成は、酵母培養物の2）の形質転換は、異種タンパク質を発現します。強制経口投与を介して腸への組換え酵母の3）投与;そして4）その異種タンパク質発現のマウス腸及び評価から実行可能な組換えプロバイオティクス酵母の回復を。 多数の正および負の選択方法は、酵母種の操作のために存在するが、まず、このような栄養要求性マーカーの使用を介して負の選択は、酵母を形質転換し、選択することができる効率および容易さの両方を増加させます。共同での抗生物質を使用して形質転換体の正の選択、ntrast、大幅酵母操作のコストを増加させます。また、抗生物質を含む固体培地上での酵母の選択が出て、合成ドロップ固形培地（未発表の観察）での栄養要求性酵母の選択に相対的な形質転換されていないバックグラウンドコロニーの増加成長を可能にすることができます。栄養要求性酵母は、必須アミノ酸またはウラシルの合成のための重要な酵素を欠いている株です。このような酵母は、酵母は不可欠な代謝産物を欠いているメディアアウト合成ドロップ上にめっきされたときにこのように、負の選択を可能にする、不足している代謝物または代謝遺伝子を補充した場合にのみ成長することができます。多くの一般的に使用されるサッカロマイセス・セレビシエ実験室株は、すでに実際には栄養要求性変異株3です。工業、臨床、およびプロバイオティクス酵母株は、しかし、一般的にすべての必要な栄養素を合成する能力を持つ原栄養です。このような酵母のより効率的な遺伝子操作を有効にするには、栄養要求性遺伝子を選択的に標的とすることができます抗生物質を含まない選択することができる株を生成します。 6 -栄養要求性マーカー遺伝子の標的特異的4を標的 CRISPR / Cas9を通してより最近、相同組換えに頼るまたはPCR媒介性の遺伝子破壊を介して達成することができます。また、UV突然変異誘発は、すぐにでも、複数のプラスミドを用いた形質転換は7技術的に困難な酵母株に栄養要求性変異体を生成することができます。 PCRの標的化およびCRISPR / Cas9が広範囲に他の場所に記載されているが、この写本の一つは負の選択ではなく、酵母形質転換体の正の抗生物質の選択を可能にする栄養要求株を作成するために、UV突然変異誘発アプローチを説明する詳細なプロトコルである部分で提示。 異種タンパク質の経口送達のためのそのような栄養要求性株の使用で次の必要なステップでは、プラスミドDNAと酵母の形質転換です。賛否の最初の成功の変換以来1978年8 サッカロミセス・セレビシエについて報告Tスフェロプラストは、多数の変更は、効率を高め、酵母種の遺伝的に改変することができると容易に特徴付けられています。 S.へのDNAの形質転換の成功のためのエレクトロポレーションの使用セレビシエは、最初の 1985年9で説明した、それ以来浸透圧的支持細胞10から1 Mソルビトールインキュベーションの添加によって改善されました。エレクトロポレーションの効率はさらに酵母種および株、細胞数及び増殖の位相、電気容量、電界強度、および特定のバッファ11に依存することが示されています。それは特別な機器を必要としないように元々伊藤ら 12によって記載リチウムアセテート（LiOAc）変換は、最も一般的に使用される形質転換プロトコルの一つです。さらなる分析は、細胞が中期対数期に回収されたときLiOAc酵母形質転換の効率が大幅に増加することを示しました成長及びC 12 42℃でポリエチレングリコール（PEG）及びDNAの存在下で熱ショックを与えています。 PEGと全体無傷の酵母のインキュベーションは、おそらく、細胞膜へのDNAの付着を向上させることを通じて、ならびに膜13上の他の効果を経由して、効率的な形質転換のために不可欠です。リチウム自体も無傷の細胞14の透過性を増大させます。なお、ほとんどの実験室S.セレビシエ株は容易LiOAc変換3を用いて形質転換することができ、他の酵母種は、より効率的に代替プロトコルを用いて形質転換することができる。 ピキア・パストリス 、例えば、最も効率的にエレクトロポレーションではなく、LiOAc変換13を介して変換される。これは、複数のテストするため、重要です遺伝的に特徴づけられていない酵母株を変更しようとすると、インキュベーション期間および試薬濃度を最適化するための形質転換の方法および。この原稿は、このようにLiOAc trの両方を記述栄養要求性変異株と野生型S.の形質転換のための技術としてansformationとエレクトロポレーションブラウディ 。興味のある読者は、酵母形質転換、代替プロトコル、およびアクション13,15の可能なメカニズムのさらなる議論の進化の徹底的な説明については、最近のレビューに向けられています。プラスミドは簡単に検出可能なタンパク質をコードする酵母の形質転換は、異種タンパク質の適切な発現および機能を確保するために、下流のテストのために、さらに不可欠です。無数の異なるタンパク質は、治療研究と、ELISAを免疫ブロッティングによるタンパク質の検出のために利用可能な抗体、および他の技術の最終的な目的に応じて適宜選択することができます。これらの技術のためのプロトコルは、完全に別の箇所16,17に記載されている、標準曲線と比較することによって形質転換された酵母からの異種タンパク質の産生のレベルを決定するために用いることができます。デモの目的のために、ショーへ酵母の生物学において非常に一般的に使用されるタンパク質の産生に成功し、この原稿は、蛍光顕微鏡を使用して、後続の検出を可能にコードするプラスミド緑色蛍光タンパク質（GFP）との変換を示します。 異種タンパク質を発現するプロバイオティック生物の生産にも同様に重要な部分3および4に記載されているように、胃腸組織内のこれらの微生物の適切な投与および検出です。強制経口投与を介して組換え酵母の投与からC57BL / 6マウスを、直接胃に酵母の制御された量の送達を可能にする自然18嘔吐することができません。しかし、不適切な動物の取り扱いと強制経口投与は、食道損傷や穿 ​​孔、胃穿孔、気管内投与、および誤嚥性肺炎19,20につながることができます。悪い技術と経験不足はさらに、マウスの免疫応答と実験RESUの変動を増加させることができます強制経口投与21,22時に動物のストレスに起因しているLTS、。適切な手法で実践は、このように、動物の不快感を減衰させることができるだけでなく、実験結果の精度を高めることができます。本稿では説明し、組換え酵母の制御された用量の投与のための動物の取り扱いと強制経口投与を示しています。 最後に、酵母および異種タンパク質の存在のためのリンパ組織を分析することによって組換え酵母の配信の成功を確認することが重要です。最も簡単かつ予測酵母の存在について試験することができる胃腸の免疫組織がパイエル板です。パイエル板は、粘膜免疫応答の誘導23の主要な部位である小腸に沿って二次リンパ器官です。内腔からの抗原は、上皮でmicrofold（M）細胞を介してtranscellularly転送され、パイエル板中に放出され、このように同封さらしますD抗原腸の管腔内容物に細胞を提示します。腸上皮を横切る粒子の取り込みはまた、杯細胞によって達成することができますが、これらの細胞のみを取る粒子径24で0.02μm未満に示されています。経上皮樹状突起はまた、腸管腔25から小さな粒子を取るCD103 +樹状細胞（DC）から延長しました。しかし、CD103 + DCは、細菌よりも大きな粒子を取ることが実証された報告は現在のところ存在しません。したがって、無傷のプロバイオティック酵母は、直径が3~6ミクロンの間の平均サイズ、M細胞によって取り込まれ、パイエル板に転写される可能性が最も高いです。ここで説明するこの手順では、簡単にプロバイオティクス細菌の取り込みを評価するために適合させることができるものの、生存可能な遺伝子組換え酵母のためのパイエル板の収集およびスクリーニングするためのプロトコルです。 要約すると、送達するための組換えプロバイオティクス酵母を評価します腸へrapeuticタンパク質は、動物の取り扱いおよび免疫学に分子生物学に及ぶ実験技術に習熟する必要があります。 1のためにここに提示されているプロトコル）を簡単に否定的に抗生物質を含まない選択することができます生成と栄養要求性酵母株のスクリーニングは、2）代替プロトコルは、酵母を形質転換し、異種タンパク質の発現を可能にする、3）適切な動物ハンドリング技術とのための強制経口投与のデモンストレーション組換え酵母の胃内送達、およびパイエル板の解剖のための4）プロトコル、生存組換え酵母で機能的異種タンパク質をスクリーニングします。組み合わせることで、これらのプロトコルは、胃腸管に異種治療用タンパク質を送達することができるプロバイオティクス酵母株の生成およびテストを可能にします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:107px;">170-2501</td>
			<td style="width:275px;">Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">New Brunswick Roller Drum</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">M1053-4004</td>
			<td style="width:275px;">Example of roller drum for yeast culture incubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV Stratalinker 2400</td>
			<td style="width:107px;">Stratagene</td>
			<td style="width:107px;">400075-03</td>
			<td style="width:275px;">Example stratalinker</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stuart Colony Counter SC6PLUS</td>
			<td style="width:107px;">11983044</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scienceware Colony Counter&#160;</td>
			<td style="width:107px;">F378620002</td>
			<td style="width:107px;">Bel-Art Scienceware</td>
			<td style="width:275px;">Hand held colony counter pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica plating device</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td>09-718-1</td>
			<td rowspan="2" style="width:275px;">Example of replica plating stand and pads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen squares</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td>09-718-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;L shaped sterile cell spreaders&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:107px;">14665230</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">D7656-1ML</td>
			<td style="width:275px;">Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Gavage needles</td>
			<td style="width:107px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:107px;">N-PK&#160;002</td>
			<td style="width:275px;">For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:107px;">BD 309659</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7&#34; (178 mm) serrated tip, broad grip forceps</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">77937-28</td>
			<td style="width:275px;">Example of blunt forceps needed for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Straight and curved dissection scissors&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:107px;">72966-02 and 72966-03</td>
			<td style="width:275px;">Examples of scissors needed for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">IMDM</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:107px;">12440053</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

UV照射後の生存曲線の生成は、別個のコロニー形成単位（CFU）を形成することができるように希釈された酵母細胞のプレーティングを必要とします。上記のように収集された各500μlのサンプルは、約5×10 6個の細胞が含まれています。しかし、プレート当たり100以上のコロニーが正確に区別することが困難です。希釈していない試料ならびに照射細胞の連続1時...

Watch this Scientific Journal Video about Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice at JoVE.com

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

ここで提示は、開発変換、管理、およびプロバイオティクス酵母サッカロマイセス・ブラウディの異種タンパク質の発現を試験するために使用することができる技術の統一説明します。

マウスにおける強制経口投与に続いてプロバイオティクス酵母の形質転換および消化管免疫組織から彼らの回復

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

細胞星状に7つのステップ

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

の口頭伝達<em&gt;リステリア菌</em&gt;汚染された食品の摂取を介したマウスにおける

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

16S rRNAのをターゲットジゴキシン標識DNAプローブを用いたパラフィン包埋組織内細菌のその場検出で

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

単離、特徴付けおよび歯肉免疫細胞ネットワークの機能検討

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

防御効力および肺免疫応答は、マウスに皮下および鼻腔内BCG投与後の

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Probiotic Studies in Neonatal Mice Using Gavage

強制経口投与を用いた新生児マウスにおけるプロバイオティクス研究

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult ...