Name: transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice at JoVE.com

Forfatterne erkjenner finansiering gjennom Barnas senter for immunologi og vaksiner og en NIH New Innovator Award (1DP2AI112242-01) tildelt Tracey J. Lamb. Forfatterne takker også Natalya P. Degtyareva for den generøse bidrag rad1 S. cerevisiae.

1. UV Mutagenese å generere Auxotrofe gjærstammer <ol><li> Generere overlevelseskurver for å bestemme nødvendige doser av UV-bestråling <ol><li> Forbered YPD (gjærekstrakt pepton dekstrose) media og andre reagenser som er oppført i tabell 1, i henhold til standardprosedyrer, 26 og inokuler enkeltkolonier inn i 5-10 ml YPD medium. Inkuber kulturer på en berg-trommel ved 30 ° CO / N til metning i minst 8 timer. </li><li> Bestem cellekonsentrasjon på O / N kulturer ved hjelp av et sp...

<ol>
	<li>Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+physiological+characterization+of+Saccharomyces+boulardii,+the+probiotic+strain+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).</li><li>Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Heterologous+Protein+Expression+by+Genetically+Engineered+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii.">Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii.</a> PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).</li><li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , (1991).</li><li>DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+with+PCR+products+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 158, 113-117 (1995).</li><li>Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Uracil+Auxotroph+Strain+of+the+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii+as+a+Host+for+the+Recombinant+Protein+Production.">Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).</li><li>Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast.">Transformation of yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).</li><li>Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+transformation+of+intact+yeast+cells+by+electroinjection+of+plasmid+DNA.">A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).</li><li>Becker, D., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+yeast+by+electroporation.">High-efficiency transformation of yeast by electroporation.</a> Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 182-187 (1991).</li><li>Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+yeast+transformation+method+for+the+generation+of+very+large+human+antibody+libraries.">An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries.</a> Protein engineering, design &amp; selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).</li><li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations.">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).</li><li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi:+methods+and+possible+underlying+mechanism.">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li><li>Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+transformation+process+studied+by+fluorescence+labeling+technique.">Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique.</a> Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+yeast.">Genetic transformation of yeast.</a> BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ELISA+Method.+.">The ELISA Method. .</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2015).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).</li><li>Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Can't+Rodents+Vomit?+A+Comparative+Behavioral,+Anatomical,+and+Physiological+Study.">Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li><li>Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spoonful+of+sugar+helps+the+medicine+go+down:+a+novel+technique+to+improve+oral+gavage+in+mice.">A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).</li><li>Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat.">The rat.</a> Animal Models in Toxicology. , 50-193 (2006).</li><li>Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+produced+by+gavage+administration+in+the+rat.">Stress produced by gavage administration in the rat.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).</li><li>Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+diseases+of+mice.">Biology and diseases of mice.</a> Laboratory animal medicine. , 35-133 (2002).</li><li>Schulz, O., Pabst, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+sampling+in+the+small+intestine.">Antigen sampling in the small intestine.</a> Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).</li><li>McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103++dendritic+cells+in+the+small+intestine.">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li><li>Farache, J., Koren, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+bacteria+recruit+CD103++dendritic+cells+into+the+intestinal+epithelium+to+sample+bacterial+antigens+for+presentation.">Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation.</a> Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).</li><li>Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2000).</li><li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast:+5-fluoro-orotic+acid+resistance.">A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Molecular &amp; general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).</li><li>Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+lys2+mutants+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+the+utilization+of+alpha-aminoadipate.">Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate.</a> Genetics. 93, 51-65 (1979).</li><li>Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson, ., Hollis, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+counterselection+for+the+tryptophan+pathway+in+yeast:+5-fluoroanthranilic+acid+resistance.">A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance.</a> Yeast. 16 (6), 553-560 (2000).</li><li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiological+characterization+of+met15+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae:+a+selective+system+for+forward+and+reverse+mutations.">Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations.</a> Genetics. 81, 75-97 (1975).</li><li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+relationships+of+mercury+resistant+mutants+and+methionine+auxotrophs+of+yeast.">Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).</li><li>McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+DNA+binding+to+cell-surfaces+by+flow+cytometry.">Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Zhang, Z., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+stability+in+recombinant+saccharomyces+cerevisiae.">Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 14 (4), 401-435 (1996).</li><li>Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Fluorescent+Protein+Is+Lighting+Up+Fungal+Biology.">Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).</li><li>Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+the+preparation+of+yeast+cells+for+transformation+by+electroporation.">An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation.</a> Yeast. 14, 565-571 (1998).</li><li>Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gavage-related+reflux+in+rats:+identification,+pathogenesis,+and+toxicological+implications+(review).">Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review).</a> Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).</li><li>Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+uptake+of+biodegradable+nanoparticles:+effect+of+particle+size.">Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size.</a> Pharma. 13 (12), (1994).</li><li>Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+uptake+by+Peyer's+patches:+a+pathway+for+drug+and+vaccine+delivery.">Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery.</a> Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).</li><li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function,+interactions,+and+post-translational+modifications.">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).</li><li>Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Auxotrophic+Mutants+of+Diploid+Industrial+Yeast+Strains+after+UV+Mutagenesis.">Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis.</a> Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).</li></ol>

Sammen protokollene her beskrive de grunnleggende trinnene som er nødvendige for utvikling og testing av auxotrofe probiotiske gjærstammer for levering av heterologe terapeutiske protein til tarmen. Dette manipulasjon og testing av rekombinant probiotiske gjær krever teknikker og ressurser som ethvert individ laboratorium ikke kan nå være kjent. Derfor, selv om mange tidligere studier har beskrevet ovenfor protokoller for flere gjær og musestammer, disse metodene har ikke til forfatternes kunnskap blitt presentert...

Probiotiske mikroorganismer er en spennende potensielle hjelp av effektiv og økonomisk levere heterologe proteiner i fordøyelseskanalen. Disse organismene er i stand til å overleve passasje gjennom mage-tarmkanalen, men ikke kolonisere det 1, slik at kontrollert dosering og begrense eksponering for medikamentet uttrykt. Videre er muligheten til enkelt å konstruere disse organismene for å fremstille heterologe proteiner i stor skala gjør dem et økonomisk alternativ til syntetiske leverings partikler. Imidlertid utvikling av en slik tilnærming, som nylig demonstrert ved anvendelse av en auxotrof stamme av de probiotiske gjæren Saccharomyces boulardii 2, krever kunnskap om laboratorieteknikker som ikke tradisjonelt kombinert innenfor et gitt studie, som strekker seg fra gjær og molekylær biologi til dyr behandlingsteknikker og immunologiske metoder. Således, selv om de enkelte fremgangsmåtene beskrevet heri er ikke i seg selv nyelaboratorieprotokoller, er målet med dette manuskriptet er å presentere en helhetlig innføring i teknikker som trengs for eksperimentell testing av probiotiske gjær som narkotika levering kjøretøy til murine mage-tarmkanalen. Forutsatt er en samling av viktige protokoller for: 1) generasjon av auxotrofe mutant stammer av gjær som kan lett bli genetisk manipulerte; 2) transformasjon av gjærkulturer å uttrykke heterologe protein; 3) administrasjon av rekombinant gjær til tarmen via oral inntak; og 4) utvinning av levedyktige probiotiske rekombinant gjær fra den murine tarmen og vurdering av deres heterolog proteinekspresjon. Første, selv om en rekke positive og negative seleksjonsfremgangsmåter eksisterer for manipuleringen av gjærarter, negativ seleksjon, for eksempel ved bruk av auksotrofe markører øker både effektivitet og letthet som gjær kan bli transformert og selektert. Positiv utvelgelse av trans bruker antibiotika, i samarbeidntrast, øker betydelig kostnaden for gjær manipulasjon. Videre kan utvalget av gjær på antibiotikaholdig faste medier gir mulighet for økt vekst av ikke-transformerte bakgrunns kolonier i forhold til valg av auxotrofe gjær på syntetisk slippe ut faste medier (upubliserte observasjoner). Auksotrof gjærstammer er som mangler enzymer kritiske for syntese av essensielle aminosyrer eller uracil. Slike gjær kan vokse bare hvis supplert med manglende metabolitt eller metabolsk genet, og dermed gjør negativ seleksjon når gjær er platet på syntetisk slippe ut media som mangler essensielle metabolitten. Mange brukte Saccharomyces cerevisiae laboratoriestammer er nemlig allerede auxotrofe mutanter 3. Industrial, klinisk, og probiotiske gjærstammer, men er vanligvis prototrofe med evnen til å syntetisere alle nødvendige næringsstoffer. For å muliggjøre mer effektiv genetisk manipulering av slike gjær, kan auxotrofe gener selektivt målrettetå generere stammer som kan velges uten antibiotika. Spesifikk målretting av auxotrofe markørgener kan oppnås gjennom PCR-mediert genet avbrudd avhengig av homolog rekombinasjon eller senere gjennom CRISPR / Cas9 målgruppe 4-6. Alternativt kan UV-mutagenese for raskt å generere auxotrofe mutanter som til og med i gjærstammer hvor transformasjon med flere plasmider som er teknisk vanskelig 7. Mens PCR målretting og CRISPR / Cas9 er nøye beskrevet andre steder, presentert i del en av dette manuskriptet er en detaljert protokoll som beskriver en UV mutagenese tilnærming for å skape auxotrofe stammer som vil tillate for negativ seleksjon snarere enn positiv antibiotika utvalg av Gjærtransformanter. Det neste nødvendige trinn i bruken av slike stammer auxotrofe for oral levering av heterologt protein er gjær transformasjon med plasmid DNA. Siden den første vellykkede transformasjonen av yeast sfæroplaster rapportert for Saccharomyces cerevisiae i 1978 8, har en rekke modifikasjoner blitt karakterisert for å øke effektiviteten og letthet som gjærarter kan bli genetisk modifisert. Bruken av elektroporering for vellykket transformasjon av DNA til S. cerevisiae ble først beskrevet i 1985 9 og har siden blitt forbedret ved tilsetning av 1 M sorbitol inkubasjon for å osmotisk støttelegemer 10. Electroporation effektivitet har dessuten vist seg å avhenge av gjær arter og belastning, cellenummer og vekstfase, elektroporering volum, feltstyrke, og bestemte buffere 11. Litiumacetat (LiOAc) transformasjon, opprinnelig beskrevet av Ito et al. 12, er blant de mest vanlig anvendte transformasjonsprotokoller som det krever ikke spesielt utstyr. Ytterligere analyser viste at effektiviteten av LiOAc gjærtransformasjons øker sterkt når celler er samlet i midt-log fasenav vekst og varmesjokkbehandlet i nærvær av polyetylenglykol (PEG) og DNA ved 42 ° C 12. Inkubasjon av hele intakte gjær med PEG er en forutsetning for effektiv omforming, eventuelt gjennom å forbedre binding av DNA til cellemembranen samt via andre effekter på membranen 13. Litium seg også øker permeabiliteten av intakte celler 14. Selv om de fleste laboratorium S. cerevisiae-stammer kan lett bli transformert ved anvendelse av LiOAc transformasjon 3, kan andre gjærarter bli mer effektivt transformert ved hjelp av alternative protokoller. Pichia pastoris, for eksempel, er mest effektivt omdannes via elektroporering i stedet for LiOAc transformasjon 13. Det er avgjørende, og derfor, for å teste multiple metoder for transformasjon og for å optimalisere inkubasjonsperioder og reagenskonsentrasjoner når du forsøker å genetisk modifisere en uncharacterized gjærstamme. Dette manuskriptet beskriver således både LiOAc transformation og elektroporasjon som teknikker for transformasjon av auxotrofe mutant og vill type S. boulardii. Interesserte lesere henvises til siste anmeldelser for grundige beskrivelser av utviklingen av gjær transformasjon, alternative protokoller, og videre diskusjoner om mulige virkningsmekanismer 13,15. Transformasjon av gjær med plasmid som koder for en lett påvisbar protein er dessuten essensiell for nedstrøms testing for å sikre riktig ekspresjon og funksjon av heterologt protein. Myriad forskjellige proteiner kan velges avhengig av endelige formålet med den terapeutiske studier og antistoffer som er tilgjengelige for protein deteksjon av immunblotting, ELISA, og andre teknikker. Protokoller for disse teknikker er blitt grundig beskrevet andre steder 16,17, og kan brukes til å bestemme nivåer av heterolog proteinproduksjon fra transformert gjær ved sammenligning med standardkurver. I forbindelse med demonstrasjon og å visevellykket produksjon av en meget vanlig brukt protein i gjær biologi, presenterer dette manuskriptet transformasjon med plasmid som koder for grønt fluorescerende protein (GFP), noe som gir mulighet for etterfølgende påvisning ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Like viktig for fremstilling av probiotiske organismer som uttrykker heterologe proteinet er korrekt administrasjon og deteksjon av disse mikroorganismer i mage-tarm vev, som beskrevet i deler av tre og fire. Administrering av rekombinant gjær via oral tvangsforing gjør det mulig for avgivelse av kontrollerte mengder av gjær direkte inn i magesekken, som C57BL / 6 mus er naturligvis i stand til oppkast 18. Imidlertid kan feil dyr håndtering og føring føre til esophageal skader og perforering, mage perforering, tracheal administrasjon, og aspirasjonspneumoni 19,20. Dårlig teknikk og uerfarenhet kan dessuten øke variasjonen i murine immunresponser og eksperimentell resuLTS, som har blitt tilskrevet dyret stresset på oralt inntak 21,22. Praksis i riktig teknikk kan således ikke bare svekke dyret ubehag, men kan også øke presisjonen av eksperimentelle resultater. Dette manuskriptet beskriver og demonstrerer dyr håndtering og oral sonde for administrasjonen av kontrollerte doser av rekombinant gjær. Endelig er det viktig å bekrefte vellykket levering av rekombinant gjær ved å analysere lymfevev for tilstedeværelsen av gjær og heterologt protein. Gastrointestinale immun vev som kan lettest og forutsigbart undersøkes for tilstedeværelse av gjær er Peyers lapper. Peyers patcher er sekundære lymfoide organer langs tynntarmen som er sentrale områder av mucosal immunrespons induksjon 23. Antigener fra lumen overføres transcellularly gjennom microfold (M) celler i epitelet og slippes ut i Peyers patcher, og dermed utsette vedlegged antigenpresenterende celler til intestinal luminale innhold. Selv om partikkelopptaket over tarmepitelet kan også oppnås ved slimceller, har disse cellene er vist å bare ta opp partikler mindre enn 0,02 pm i diameter 24. Transepitelial dendritter forlenget fra CD103 + dendritiske celler (DC) også ta opp små partikler fra den intestinale lumen 25; men det er foreløpig ingen rapporter som viser at CD103 + DC ta opp partikler større enn bakterier. Således intakt probiotisk gjær, med en gjennomsnittlig størrelse mellom 3-6 mikrometer i diameter, er mest sannsynlig å bli tatt opp av M-celler og overført til Peyers lapper. Beskrevet her er en protokoll for innsamling og screening av Peyers patcher for levedyktig rekombinant gjær, selv om denne prosedyren kan også enkelt tilpasses for å vurdere opptak av probiotiske bakterier. I sammendraget, vurdere rekombinant probiotiske gjær for levering avrapeutic proteiner til tarmen krever ferdigheter i laboratorieteknikker som spenner molekylærbiologi til dyr håndtering og immunologi. Presenteres her er protokoller for en) generering og screening av auxotrofe gjærstammer som lett kan negativt valgt uten antibiotika, 2) alternative protokoller for å forvandle gjær og aktivere uttrykk for heterologe protein, 3) demonstrasjoner av riktig dyr håndtering teknikker og oralt inntak for intragastrisk levering av rekombinant gjær, og 4) protokoller for Peyer patch disseksjon og screening for levedyktige rekombinante gjær og funksjonelt heterologt protein. Til sammen vil disse protokollene tillate generering og testing av en probiotisk gjærstamme i stand til å levere heterologe terapeutiske protein til mage-tarmkanalen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:107px;">170-2501</td>
			<td style="width:275px;">Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">New Brunswick Roller Drum</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">M1053-4004</td>
			<td style="width:275px;">Example of roller drum for yeast culture incubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV Stratalinker 2400</td>
			<td style="width:107px;">Stratagene</td>
			<td style="width:107px;">400075-03</td>
			<td style="width:275px;">Example stratalinker</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stuart Colony Counter SC6PLUS</td>
			<td style="width:107px;">11983044</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scienceware Colony Counter&#160;</td>
			<td style="width:107px;">F378620002</td>
			<td style="width:107px;">Bel-Art Scienceware</td>
			<td style="width:275px;">Hand held colony counter pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica plating device</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td>09-718-1</td>
			<td rowspan="2" style="width:275px;">Example of replica plating stand and pads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen squares</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td>09-718-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;L shaped sterile cell spreaders&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:107px;">14665230</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">D7656-1ML</td>
			<td style="width:275px;">Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Gavage needles</td>
			<td style="width:107px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:107px;">N-PK&#160;002</td>
			<td style="width:275px;">For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:107px;">BD 309659</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7&#34; (178 mm) serrated tip, broad grip forceps</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">77937-28</td>
			<td style="width:275px;">Example of blunt forceps needed for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Straight and curved dissection scissors&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:107px;">72966-02 and 72966-03</td>
			<td style="width:275px;">Examples of scissors needed for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">IMDM</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:107px;">12440053</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Generering av en overlevelseskurve etter UV-bestråling krever plettering av fortynnede gjærceller, slik som forskjellige kolonidannende enheter (CFU) er i stand til å danne. Hver 500 pl prøve oppsamlet som beskrevet ovenfor, inneholder ca. 5 x 10 6 celler; imidlertid, er større enn 100 kolonier per plate er vanskelig å nøyaktig skille. Plating ufortynnet prøve samt serielle 1:10 fortynninger av bestrålte celler dermed sørger for at CFU kan være nummerert ved hver UV...

Watch this Scientific Journal Video about Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice at JoVE.com

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Presenteres her er en enhetlig beskrivelse av teknikker som kan brukes til å utvikle, omforme, administrere og teste heterologe protein uttrykk av de probiotiske gjær Saccharomyces boulardii.

Transformasjon av Probiotiske gjær og deres utvinning fra Gastrointestinale immun Vev Etter oralt inntak i Mus

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral Overføring av<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I Mus via Inntak av forurenset mat

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induksjon av murine tarmbetennelse etter adoptiv overføring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høy</sup&gt; T-celler i immundefekte mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ påvisning av bakterier innenfor parafininnleiret Vev Bruke en digoksin-merket DNA Probe målretting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolasjon, karakterisering og Funksjonell Undersøkelse av Gingival immun Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induksjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt hos mus og evaluering av sykdom avhengige Fordeling av immunceller i ulike vev

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Beskyttende effekt og Lungeimmunrespons etter subkutan og intranasal BCG Administration i Mus

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Probiotic Studies in Neonatal Mice Using Gavage

Probiotiske studier i Neonatal mus med Gavage

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult ...